Name: preparation of poly(pentafluorophenyl acrylate) functionalized sio2 beads for protein purification
Uploaded: 2018-11-19T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Polypentafluorophenyl acrylate Functionalized SiO2 Beads for Protein Purification at JoVE.com

Ce travail a été soutenu par l’Agence pour le développement de défense (Grant No. UD170039ID).

1. préparation des Poly(PFPA) homopolymère
<ol><li>Recristallisation de AIBN<ol>
<li>Mélanger 5 g de 2,2'-azobis(2-methylpropionitrile) (AIBN) avec 25 mL de méthanol dans un bécher de 250 mL. Plonger le bécher dans un bain d’huile de 60 ° C, puis remuer vigoureusement le mélange avec une barre de remuer jusqu'à AIBN est entièrement dissous.</li>
		<li>Filtrer la solution chaude sur papier filtre (5-8 μm rétention de particules) et conserver le filtrat à 4 ° C pour permettre les cristaux à forme lenteme...

<ol>
	<li>Johnsson, B., L&#246;f&#229;s, S., Lindquist, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilization+of+proteins+to+a+carboxymethyldextran-modified+gold+surface+for+biospecific+interaction+analysis+in+surface+plasmon+resonance+sensors.">Immobilization of proteins to a carboxymethyldextran-modified gold surface for biospecific interaction analysis in surface plasmon resonance sensors.</a> Analytical Biochemistry. 198 (2), 268-277 (1991).</li><li>Kurzawa, C., Hengstenberg, A., Schuhmann, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilization+method+for+the+preparation+of+biosensors+based+on+pH+shift-induced+deposition+of+biomolecule-containing+polymer+films.">Immobilization method for the preparation of biosensors based on pH shift-induced deposition of biomolecule-containing polymer films.</a> Analytical Chemistry. 74 (2), 355-361 (2002).</li><li>You, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+identification+of+proteins+using+nanoparticle-fluorescent+polymer+'chemical+nose'+sensors.">Detection and identification of proteins using nanoparticle-fluorescent polymer 'chemical nose' sensors.</a> Nature Nanotechnology. 2 (5), 318-323 (2007).</li><li>Roberts, M. W., Ongkudon, C. M., Forde, G. M., Danquah, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatility+of+polymethacrylate+monoliths+for+chromatographic+purification+of+biomolecules.">Versatility of polymethacrylate monoliths for chromatographic purification of biomolecules.</a> Journal of Separation Science. 32 (15-16), 2485-2494 (2009).</li><li>Sandison, M. E., Cumming, S. A., Kolch, W., Pitt, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On-chip+immunoprecipitation+for+protein+purification.">On-chip immunoprecipitation for protein purification.</a> Lab on a Chip. 10 (20), 2805-2813 (2010).</li><li>Das, A., Theato, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activated+Ester+Containing+Polymers:+Opportunities+and+Challenges+for+the+Design+of+Functional+Macromolecules.">Activated Ester Containing Polymers: Opportunities and Challenges for the Design of Functional Macromolecules.</a> Chemical Reviews. 116 (3), 1434-1495 (2016).</li><li>Choi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functionalization+and+patterning+of+reactive+polymer+brushes+based+on+surface+reversible+addition+and+fragmentation+chain+transfer+polymerization.">Functionalization and patterning of reactive polymer brushes based on surface reversible addition and fragmentation chain transfer polymerization.</a> Journal of Polymer Science Part A: Polymer Chemistry. 50 (19), 4010-4018 (2012).</li><li>Kessler, D., Jochum, F. D., Choi, J., Char, K., Theato, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+surface+coatings+based+on+polysilsesquioxanes:+universal+method+toward+light-responsive+surfaces.">Reactive surface coatings based on polysilsesquioxanes: universal method toward light-responsive surfaces.</a> ACS Applied Materials &amp; Interfaces. 3 (2), 124-128 (2011).</li><li>Son, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Penetration+and+exchange+kinetics+of+primary+alkyl+amines+applied+to+reactive+poly(pentafluorophenyl+acrylate)+thin+films.">Penetration and exchange kinetics of primary alkyl amines applied to reactive poly(pentafluorophenyl acrylate) thin films.</a> Polymer Journal. 48 (4), 487-495 (2016).</li><li>Kessler, D., Roth, P. J., Theato, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+surface+coatings+based+on+polysilsesquioxanes:+controlled+functionalization+for+specific+protein+immobilization.">Reactive surface coatings based on polysilsesquioxanes: controlled functionalization for specific protein immobilization.</a> Langmuir. 25 (17), 10068-10076 (2009).</li><li>Kessler, D., Theato, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+surface+coatings+based+on+polysilsesquioxanes:+defined+adjustment+of+surface+wettability.">Reactive surface coatings based on polysilsesquioxanes: defined adjustment of surface wettability.</a> Langmuir. 25 (24), 14200-14206 (2009).</li><li>Kessler, D., Nilles, K., Theato, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modular+approach+towards+multi-functional+surfaces+with+adjustable+and+dual-responsive+wettability+using+a+hybrid+polymer+toolbox.">Modular approach towards multi-functional surfaces with adjustable and dual-responsive wettability using a hybrid polymer toolbox.</a> Journal of Materials Chemistry. 19 (43), 8184-8189 (2009).</li><li>Eberhardt, M., Mruk, R., Zentel, R., Theato, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+pentafluorophenyl(meth)acrylate+polymers:+new+precursor+polymers+for+the+synthesis+of+multifunctional+materials.">Synthesis of pentafluorophenyl(meth)acrylate polymers: new precursor polymers for the synthesis of multifunctional materials.</a> European Polymer Journal. 41 (7), 1569-1575 (2005).</li><li>Jochum, F. D., Forst, F. R., Theato, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PNIPAM+copolymers+containing+light-responsive+chromophores:+a+method+toward+molecular+logic+gates.">PNIPAM copolymers containing light-responsive chromophores: a method toward molecular logic gates.</a> Macromolecular Rapid Communications. 31 (16), 1456-1461 (2010).</li><li>Schattling, P., Pollmann, I., Theato, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+CO2-responsive+polymers+by+post-polymerization+modification.">Synthesis of CO2-responsive polymers by post-polymerization modification.</a> Reactive &amp; Functional Polymers. 75, 16-21 (2014).</li><li>He, L., Szameit, K., Zhao, H., Hahn, U., Theato, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postpolymerization+modification+using+less+cytotoxic+activated+ester+polymers+for+the+synthesis+of+biological+active+polymers.">Postpolymerization modification using less cytotoxic activated ester polymers for the synthesis of biological active polymers.</a> Biomacromolecules. 15 (8), 3197-3205 (2014).</li><li>Arnold, R. M., McNitt, C. D., Popik, V. V., Locklin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+grafting+of+poly(pentafluorophenyl+acrylate)+onto+oxides:+versatile+substrates+for+reactive+microcapillary+printing+and+self-sorting+modification.">Direct grafting of poly(pentafluorophenyl acrylate) onto oxides: versatile substrates for reactive microcapillary printing and self-sorting modification.</a> Chemical Communications. 50 (40), 5307-5309 (2014).</li><li>Son, H., Ku, J., Kim, Y., Li, S., Char, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amine-Reactive+Poly(pentafluorophenyl+acrylate)+Brush+Platforms+for+Cleaner+Protein+Purification.">Amine-Reactive Poly(pentafluorophenyl acrylate) Brush Platforms for Cleaner Protein Purification.</a> Biomacromolecules. 19 (3), 951-961 (2018).</li><li>Cullen, S. E., Schwartz, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+for+isolation+of+H-2+and+Ia+alloantigens+with+immunoprecipitation+induced+by+protein+A-bearing+staphylococci.">An improved method for isolation of H-2 and Ia alloantigens with immunoprecipitation induced by protein A-bearing staphylococci.</a> The Journal of Immunology. 117 (1), 136-142 (1976).</li><li>Sisson, T. H., Castor, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+for+immobilizing+IgG+antibodies+on+protein+A-agarose.">An improved method for immobilizing IgG antibodies on protein A-agarose.</a> Journal of Immunology Methods. 127 (2), 215-220 (1990).</li><li>Peritz, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoprecipitation+of+mRNA-protein+complexes.">Immunoprecipitation of mRNA-protein complexes.</a> Nature Protocols. 1 (2), 577-580 (2006).</li><li>Zhang, Z., Chen, S., Jiang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual-functional+biomimetic+materials:+nonfouling+poly+(carboxybetaine)+with+active+functional+groups+for+protein+immobilization.">Dual-functional biomimetic materials: nonfouling poly (carboxybetaine) with active functional groups for protein immobilization.</a> Biomacromolecules. 7 (12), 3311-3315 (2006).</li><li>Yao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NHS-ester+functionalized+poly(PEGMA)+brushes+on+silicon+surface+for+covalent+protein+immobilization.">NHS-ester functionalized poly(PEGMA) brushes on silicon surface for covalent protein immobilization.</a> Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 66 (2), 233-239 (2008).</li><li>Ma, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Facile+fabrication+of+microsphere-polymer+brush+hierarchically+three-dimensional+(3D)+substrates+for+immunoassays.">Facile fabrication of microsphere-polymer brush hierarchically three-dimensional (3D) substrates for immunoassays.</a> Chemical Communications. 51 (31), 6749-6752 (2015).</li><li>Chong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thiocarbonylthio+compounds+[SC+(Ph)+S&#8722;+R]+in+free+radical+polymerization+with+reversible+addition-fragmentation+chain+transfer+(RAFT+Polymerization).+Role+of+the+free-radical+leaving+group+(R).">Thiocarbonylthio compounds [SC (Ph) S&#8722; R] in free radical polymerization with reversible addition-fragmentation chain transfer (RAFT Polymerization). Role of the free-radical leaving group (R).</a> Macromolecules. 36 (7), 2256-2272 (2003).</li><li>Jochum, F. D., Theato, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature-+and+Light-Responsive+Polyacrylamides+Prepared+by+a+Double+Polymer+Analogous+Reaction+of+Activated+Ester+Polymers.">Temperature- and Light-Responsive Polyacrylamides Prepared by a Double Polymer Analogous Reaction of Activated Ester Polymers.</a> Macromolecules. 42 (16), 5941-5945 (2009).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+The+Western+Blot.">Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot.</a> JoVE. , (2018).</li><li>Chua, G. B. H., Roth, P. J., Duong, H. T. T., Davis, T. P., Lowe, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+Thermoresponsive+Solution+Properties+of+Poly[oligo(ethylene+glycol)+(meth)acrylamide]s:+Biocompatible+PEG+Analogues.">Synthesis and Thermoresponsive Solution Properties of Poly[oligo(ethylene glycol) (meth)acrylamide]s: Biocompatible PEG Analogues.</a> Macromolecules. 45 (3), 1362-1374 (2012).</li></ol>

La synthèse de poly(PFPA) greffés SiO2 perles est illustrée à la Figure 1. En employant selon comme une molécule de l’éditeur de liens, brosses poly(PFPA) greffés par covalence à SiO2 substrat peuvent être préparés grâce à un processus en deux étapes simples. Même si certaines unités PPP sont sacrifiés pour la réaction avec APTES, un grand nombre des unités de PPP est censé rester disponible pour une réaction plus tard avec amino-PEG ou anticorps....

Brosses de polymère réactif ont reçu beaucoup d’intérêt ces dernières années. Ils peuvent être utilisés pour immobiliser des molécules fonctionnelles sur les matières organiques ou inorganiques pour créer des surfaces activées avec des applications dans des domaines tels que la détection et la séparation1,2,3,4, 5. Parmi les polymères réactives signalés, ceux contenant des unités pentafluorophényl ester sont particulièrement utiles en raison de leur forte réactivité avec des amines et résistance envers l’hydrolyse6. Une tel polymère est poly(PFPA), et il peut être facilement fonctionnalisée après polymérisation avec des molécules contenant des amines primaires ou secondaires7,8,9,10. À titre d’exemple, poly(PFPA) brosses ont réagi avec amino-étude pour créer des surfaces sensibles à la lumière de7.
La préparation de poly(PFPA) et ses applications ont été décrites dans un certain nombre de précédents publications6,7,8,9,10,11,12 ,13,14,15,16,17. En particulier, Theato et ses collaborateurs a signalé la synthèse de poly(PFPA) brosses « greffage à » et « greffage de » méthodes7,8,10,11,12 par . Dans le « greffage de » approche, un poly (methylsilsesquioxane)-poly (acrylate de pentafluorophényl) (polymère hybride poly(MSSQ-PFPA)) a été synthétisé8,10,11,12. Le composant poly(MSSQ) réussit à adhérence forte forme avec un certain nombre de différentes surfaces organiques et inorganiques, permettant ainsi le composant poly(PFPA) former une couche de pinceau sur la surface du matériau enduite. Dans le « greffage de » approche, surface amorcée addition réversible et polymérisation par transfert (SI-RAFT) chaîne fragmentation a été utilisée pour préparer poly(PFPA) brosses7. Dans ce cas, un agent de transfert de chaîne immobilisée surface (SI-LTC) a été tout d’abord de façon covalente au substrat par réaction de la silice-silane. Le SI-Dec immobilisé participe ensuite à la polymérisation de SI-radeau de monomères PFPA, générant des brosses poly(PFPA) dense avec stable liaison covalente au substrat.
En utilisant les brosses poly(PFPA) synthétisés par polymérisation de SI-radeau, nous avons récemment démontré l’immobilisation des anticorps sur les particules de silice greffée de poly(PFPA) et leur application ultérieure dans la purification de protéines18. L’utilisation de brosses poly(PFPA) pour l’immobilisation de l’anticorps a été trouvée pour résoudre un certain nombre de questions liées à l’actuelle séparation de protéines par IP. IP classique repose sur l’utilisation de la protéine A/G comme un linker pour anticorps immobilisation19,20,21. Étant donné que l’utilisation de la protéine A/G permet les anticorps être attaché avec une orientation spécifique, efficacité de récupération de l’antigène cible élevé est atteint. Cependant, l’utilisation de la protéine A/G souffre d’interaction des protéines non spécifiques comme la perte d’anticorps lors de la récupération de protéines, qui contribuent à un niveau élevé de bruit de fond. Pour combler ces lacunes, réticulation directe des anticorps sur un support solide a été exploré22,23,24. L’efficacité de ces techniques est généralement faible en raison de l’orientation aléatoire des anticorps réticulé. Pour le substrat poly(PFPA) greffés, l’immobilisation des anticorps est permanente, obtenue par la réaction d’échange entre les unités de la PFP et fonctionnalités amine sur les anticorps. Bien que l’orientation de l’anticorps est toujours aléatoire, le système bénéficie d’avoir plusieurs sites réactifs de PPP, contrôlables par le degré de polymérisation. En outre, nous avons montré qu’en substitution partielle des unités ppp avec amino-PEG, hydrophilicité de surface peut être ajustée, améliorer davantage l’efficacité de récupération de protéines du système18. Dans l’ensemble, les particules de silice greffée de poly(PFPA) se sont avérés être une alternative efficace à la propriété intellectuelle traditionnelle avec une efficacité raisonnable, mais aussi beaucoup plus propre arrière-plan.
Dans cette contribution, nous présentons une méthode alternative pour préparer des poly(PFPA) surface greffées pour immobilisation des anticorps et l’application de la propriété intellectuelle. Dans un processus simple en deux étapes, comme illustré dans la Figure 1, une molécule de linker selon est tout d’abord déposée sur la surface de la silice, puis le polymère poly(PFPA) est covalente de la molécule de l’éditeur de liens par l’intermédiaire de la réaction entre les unités de PPP sur la polymère et les fonctions amines sur APTES. Cette méthode de préparation permet la réticulation permanente des poly(PFPA) sur une surface de substrat, mais évite les nombreuses complications associées de synthèse SI-LTC et polymérisation TR-radeau de brosses poly(PFPA). Une substitution partielle des unités ppp avec amino-PEG peut encore être effectuée, permettant un réglage fin des propriétés surface polymère brosse. Nous montrons les billes de silice poly(PFPA) greffés ainsi préparés peuvent être immobilisés avec des anticorps et utilisés pour l’enrichissement en protéines via IP. La procédure de préparation détaillées perle, immobilisation des anticorps et le test IP sont documentés dans cet article, pour les lecteurs intéressés par la recherche d’une alternative aux classique protéine A/G basés IP.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2,2-Azobisisobutyronitrile, 99%</td>
			<td>Daejung Chemicals</td>
			<td>1102-4405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl alcohol for HPLC, 99.9%</td>
			<td>Duksan Pure Chemicals</td>
			<td>d62</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmagnesium bromide solution 1.0&#160;M in THF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>331376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon disulfide anhydrous, &#8805;99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>335266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzyl bromide, 98%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B17905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petroleum ether, 90%</td>
			<td>Samchun Chemicals</td>
			<td>P0220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl ether, 99%</td>
			<td>Daejung Chemicals</td>
			<td>4025-4404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate anhydrous, powder,&#160;99%</td>
			<td>Daejung Chemicals</td>
			<td>5514-4405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentafluorophenyl acrylate</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-264001</td>
			<td>contains inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium oxide, activated, basic, Brockmann I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>199443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Daejung Chemicals</td>
			<td>7548-4400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anisole anhydrous, 99.7%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>296295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica nanoparticle</td>
			<td>Microparticles GmbH</td>
			<td>SiO2-R-0.7</td>
			<td>5% w/v aqueous suspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Aminopropyltrimethoxysilane, &#62;96.0%</td>
			<td>Tokyo Chemical Industry</td>
			<td>T1255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide for HPLC, &#8805;99.7%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34869</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amino-terminated poly(ethylene glycol) methyl ether</td>
			<td>Polymer Source</td>
			<td>P16082-EGOCH3NH2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline tablet</td>
			<td>Takara</td>
			<td>T9181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>9480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl (pH 8.0)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9855G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9640G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40</td>
			<td>VWR</td>
			<td>E109-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15514-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Biosesang</td>
			<td>D1037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor</td>
			<td>Merck</td>
			<td>535140-1MLCN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromo phenol blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B5525-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl (pH 6.8)</td>
			<td>Biosolution</td>
			<td>BT033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Biosolution</td>
			<td>BS003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21985-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PKR Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>12297S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH Antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-32233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Rabbit IgG</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>2729S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa</td>
			<td>Korea Cell Line Bank</td>
			<td>10002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>DAIHAN Scientific</td>
			<td>WUC-D10H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonicator</td>
			<td>BMBio</td>
			<td>BR2006A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge I</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge II</td>
			<td>LABOGENE</td>
			<td>1736R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator</td>
			<td>FINEPCR</td>
			<td>ROTATOR/AG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum oven</td>
			<td>DAIHAN Scientific</td>
			<td>ThermoStable OV-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel permeation chromatography (THF)</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>1260 Infinity II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-ray photoelectron spectrometer</td>
			<td>Thermo VG Scientific</td>
			<td>Sigma Probe</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynamic light scattering</td>
			<td>Malvern Instruments</td>
			<td>ZEN 3690</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
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preparation of poly(pentafluorophenyl acrylate) functionalized sio2 beads for protein purification

Nous démontrons une méthode simple pour préparer les poly (acrylate de pentafluorophényl) (poly(PFPA)) greffés perles de silice pour immobilisation des anticorps et l’application ultérieure immunoprécipitation (IP). La surface greffées poly(PFPA) est préparée par un processus en deux étapes simples. Dans un premier temps, 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) se dépose comme une molécule de l’éditeur de liens sur la surface de la silice. Dans la deuxième étape, poly(PFPA) homopolymère, synthétisé par l’addition réversible et polymérisation de transfert (RAFT) chaîne fragmentation, est greffée à la molécule de l’éditeur de liens par l’intermédiaire de la réaction d’échange entre les unités de pentafluorométhyl (PPP) sur le polymère et les groupes amine sur APTES. Les dépôts de APTES et poly(PFPA) sur la silice particules sont confirmées par spectrométrie de photoélectrons (XPS), ainsi que surveillés par le changement de taille de particules mesurées via la diffusion de la lumière dynamique (DLS). Pour améliorer la surface hydrophilicité des perles, substitution partielle de poly(PFPA) avec poly(ethylene glycol) amine fonctionnalisés (amino-PEG) est également réalisée. Le poly(PFPA) PEG-substitués greffés silice perles sont alors immobilisés avec des anticorps pour l’application de la propriété intellectuelle. Pour démonstration, un anticorps dirigé contre la protéine kinase activée par RNA (PKR) est employé, et efficacité de la propriété intellectuelle est déterminée par Western Blot. Les résultats d’analyse montrent que les perles d’anticorps immobilisé en effet peuvent servir à enrichir PKR, tandis que les interactions entre protéines non spécifiques sont minimes.

Un schéma pour la préparation des poly(PFPA) greffés SiO2 perles, avec ou sans PEG substitution est illustrée à la Figure 1. Pour surveiller les APTES et poly(PFPA) processus, nu SiO2 perles, la greffe selon fonctionnalisés SiO2 perles et poly(PFPA) greffés SiO2 perles sont caractérisés par des listes de distribution (Figure 2) et XPS (Figure 3). E...

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Preparation of Polypentafluorophenyl acrylate Functionalized SiO2 Beads for Protein Purification

Un protocole pour la préparation de poly (acrylate de pentafluorophényl) (perles de silice greffée de poly(PFPA)) est présentée. La surface fonctionnalisés poly(PFPA) est ensuite immobilisée avec des anticorps et utilisée avec succès pour la séparation de la protéine par immunoprécipitation.

Préparation de Poly(pentafluorophenyl acrylate) fonctionnalisés SiO2 perles pour la Purification de protéines

We demonstrate a simple method to prepare poly(pentafluorophenyl acrylate) (poly(PFPA)) grafted silica beads for antibody immobilization and subsequent ...

Cette méthode peut être utilisée pour préparer des surfaces activées par la biomolécule, qui ont des applications dans des domaines tels que l’administration de médicaments, la détection de cibles biologiques et la séparation biologique. Le principal avantage de cette technique est que les brosses poly PFPA sont très réactives avec les amines, et l’immobilisation des anticorps est réalisée par incubation en solution tampon pendant quelques heures. Les implications de cette technique s’étendent vers la purification des protéines par immunopurification, car l’anticorps immobilisé peut se lier avec succès avec les antigènes cibles.Bien que cette méthode soit démontrée pour la mobilisation des anticorps et la purification des protéines, elle peut également être appliquée à d’autres systèmes nécessitant une mobilisation biomoléculaire. Pour traiter les perles de dioxyde de silicium avec APTES, obtenez d’abord des particules de dioxyde de silicium sous la forme d’une suspension aqueuse de volume de 5%. Combinez 0,8 millilitres de suspension de dioxyde de silicium avec 40 milligrammes d’APTES, et huit millilitres de méthanol dans un flacon de scintillation de 20 millilitres équipé d’une barre de remue-remous.Laissez la réaction se poursuivre à température ambiante pendant cinq heures en remuant vigoureusement. Après cinq heures, transférer la solution dans un tube conique. Pour isoler les perles de dioxyde de silicone fonctionnalisées APTES, centrifugez la solution à 10 000 G pendant cinq minutes.Retirez ensuite le surnatant. Lavez maintenant les perles en les redispursant en trois millilitres de méthanol frais. Secouez le tube à la main pour le mélange, mais si nécessaire, améliorer la dispersion par sonication dans un bain d’eau pendant quelques secondes.Centrifugeuse comme avant, et répéter l’étape de lavage une fois de plus. Mélanger les perles de dioxyde de silicone de lavage de méthanol avec trois millilitres de sulfure de diméthyle, ou DMSO. Secouez le mélange à la main, ou si nécessaire, soniquez pendant quelques secondes jusqu’à ce que les perles soient complètement dispersées dans le DMSO.Après centrifugation avant, retirer le supernatant. Répétez l’étape de centrifugation une dernière fois pour assurer un échange complet de solvants du méthanol au DMSO. Pour préparer la solution poly PFPA, dissoudre 20 milligrammes de poly PFPA en deux millilitres de DMSO dans un flacon de scintillation de 20 millilitres.Pour préparer la solution PEG, dissoudre l’amine fonctionnalisée PEG en un millilitre de DMSO. Transférez maintenant la solution PEG à la solution poly PFPA. Réagissez à température ambiante pendant une heure en remuant vigoureusement.Transférer un millilitre des perles de dioxyde de silicium fonctionnalisées APTES suspendues dans DMSO dans la solution PEG en poly PFPA substituée. Permettre à la greffe entre les perles de dioxyde de silicium fonctionnalisées poly PFPA et APTES de procéder à température ambiante pendant une heure en remuant vigoureusement. Puis isoler les perles par centrifugation à 10 000 G pendant cinq minutes, suivie de l’ablation du supernatant.Lavez les perles en ajoutant trois millilitres de DMSO, et mélangez à la main ou avec quelques secondes de sonication. Centrifuger les perles comme avant. Et retirez le supernatant avant de répéter le lavage DMSO deux fois.Lavez les perles deux fois de plus avec trois millilitres d’eau distillée triple. Puis mélanger à la main ou avec quelques secondes de sonication. Centrifuger les perles comme avant et enlever le supernatant.Enfin sécher les perles à 40 degrés Celsius dans un four à vide pendant la nuit. Ajouter cinq milligrammes de perles de dioxyde de silicium greffées poly PFPA à un tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre. Laver les perles en ajoutant 800 microlitres de PBS, et bien mélanger par vortex.Centrifuger les perles à 10 000 G à température ambiante pendant une minute. Retirer le surnatant et répéter l’étape de lavage trois fois. Maintenant ajouter 350 microlitres de PBS frais, 50 microlitres de 0,1%PBST, et 6,67 microgrammes de l’anticorps.Incuber environ 20 heures sur un rotateur à quatre degrés Celsius. Le lendemain, laver les perles et la centrifugeuse à 400 G et quatre degrés Celsius pendant une minute. Retirez ensuite le supernatant et ajoutez soigneusement 400 microlitres de tampon de lyse.Resuspendez doucement les perles en faisant monter et descendre cinq fois. Répétez cette étape de lavage trois fois. Après le lavage final, retirer autant de supernatant que possible.Préparez les cellules et le tampon de lyse tels que décrits dans le protocole de texte. Puis résuspendez la pastille cellulaire avec 400 microlitres du tampon de lyse. Sonicate les cellules à l’aide d’un sonicateur ultra.Après la sonication, vortex brièvement. Puis centrifugeuse le lysate à 20 000 G à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Transférer le supernatant dans un nouveau tube centrifugeuse de 1,5 millilitre.Pour effectuer l’immunoprécipitation, transférez 300 microlitres de lysate cellulaire à des perles de dioxyde de silicium greffées poly PFPA immobilisées précédemment préparées. Conserver 30 microlitres de la cellule lysate comme échantillon d’entrée dans un nouveau tube de microcentrifugeuse. Incuber le mélange de perles de lysate pendant trois heures sur un rotateur à quatre degrés Celsius.Après incubation, centrifuger le mélange à 400 G à quatre degrés Celsius pendant une minute. Retirer le supernatant et ajouter délicatement 400 microlitres de tampon de lavage. Resuspendez doucement les perles en faisant monter et descendre environ cinq fois.Après trois lavages, retirer autant de supernatant que possible. Ajouter 30 microlitres de colorant de chargement 2x SDS aux perles et à l’échantillon d’entrée. Ensuite, chauffez-les pendant 10 minutes à 95 degrés Celsius.Après le chauffage, analysez l’échantillon à l’aide de ballonnements occidentaux ou stockez l’échantillon à moins 20 degrés Celsius. Les perles de silice fonctionnalisées sont examinées par spectroscopie photoélectron à rayons X, ou XPS, pour déterminer la composition de la surface. Les données représentatives XPS sont affichées ici.Après le traitement aptes, le pic d’azote 1 associé à la zone du groupe amine APTES est détecté. Après le traitement poly PFPA, le pic de fluor 1 associé aux unités PFP sur le polymère est détecté. L’ARN de kinase de protéine activé, ou enrichissement de PKR par immunoprécipitation est exécuté, et l’échantillon de protéine fait allusion sont analysés utilisant le ballonnement occidental.Comme prévu, les perles immobilisées sans anticorps, ou une mixuture anticorps non spécifique ne montrent aucune récupération PKR. Les perles incubées avec anti-PKR peuvent enrichir avec succès PKR comme l’indiquent la présence d’une bande PKR et l’absence de bande GAPDH. Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler que lors de la comparaison des systèmes, les expériences de propriété intellectuelle ainsi que l’analyse de ballonnement occidental ultérieure doit être faite simultanément.Après son développement, cette technique peut être utilisée pour l’immobilisation de différents substrats biomoléculaires ou matériels. En outre, cette méthode a l’avantage supplémentaire de tuning seulement la propriété de surface à adapter aux besoins de chaque application.

Research

JoVE Journal

Chemistry

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