Name: preparation of poly(pentafluorophenyl acrylate) functionalized sio2 beads for protein purification
Uploaded: 2018-11-19T14:00:00
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1. Vorbereitung des Poly(PFPA) Homopolymer
<ol><li>Rekristallisation der Havariekommission<ol>
<li>Kombinieren Sie 5 g 2,2'-azobis(2-methylpropionitrile) (Havariekommission) mit 25 mL Methanol in einem 250 mL Becherglas. Tauchen Sie den Becher in ein Ölbad 60 ° C, dann rühren Sie kräftig die Mischung mit Stir Bar bis Havariekommission vollständig aufgelöst ist.</li>
		<li>Filtern Sie die warme Lösung durch Filterpapier (5-8 μm Partikel Retention) und speichern Sie das Filtrat bei 4 ° C langsam erlauben die Kri...

<ol>
	<li>Johnsson, B., L&#246;f&#229;s, S., Lindquist, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilization+of+proteins+to+a+carboxymethyldextran-modified+gold+surface+for+biospecific+interaction+analysis+in+surface+plasmon+resonance+sensors.">Immobilization of proteins to a carboxymethyldextran-modified gold surface for biospecific interaction analysis in surface plasmon resonance sensors.</a> Analytical Biochemistry. 198 (2), 268-277 (1991).</li><li>Kurzawa, C., Hengstenberg, A., Schuhmann, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilization+method+for+the+preparation+of+biosensors+based+on+pH+shift-induced+deposition+of+biomolecule-containing+polymer+films.">Immobilization method for the preparation of biosensors based on pH shift-induced deposition of biomolecule-containing polymer films.</a> Analytical Chemistry. 74 (2), 355-361 (2002).</li><li>You, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+identification+of+proteins+using+nanoparticle-fluorescent+polymer+'chemical+nose'+sensors.">Detection and identification of proteins using nanoparticle-fluorescent polymer 'chemical nose' sensors.</a> Nature Nanotechnology. 2 (5), 318-323 (2007).</li><li>Roberts, M. W., Ongkudon, C. M., Forde, G. M., Danquah, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatility+of+polymethacrylate+monoliths+for+chromatographic+purification+of+biomolecules.">Versatility of polymethacrylate monoliths for chromatographic purification of biomolecules.</a> Journal of Separation Science. 32 (15-16), 2485-2494 (2009).</li><li>Sandison, M. E., Cumming, S. A., Kolch, W., Pitt, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On-chip+immunoprecipitation+for+protein+purification.">On-chip immunoprecipitation for protein purification.</a> Lab on a Chip. 10 (20), 2805-2813 (2010).</li><li>Das, A., Theato, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activated+Ester+Containing+Polymers:+Opportunities+and+Challenges+for+the+Design+of+Functional+Macromolecules.">Activated Ester Containing Polymers: Opportunities and Challenges for the Design of Functional Macromolecules.</a> Chemical Reviews. 116 (3), 1434-1495 (2016).</li><li>Choi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functionalization+and+patterning+of+reactive+polymer+brushes+based+on+surface+reversible+addition+and+fragmentation+chain+transfer+polymerization.">Functionalization and patterning of reactive polymer brushes based on surface reversible addition and fragmentation chain transfer polymerization.</a> Journal of Polymer Science Part A: Polymer Chemistry. 50 (19), 4010-4018 (2012).</li><li>Kessler, D., Jochum, F. D., Choi, J., Char, K., Theato, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+surface+coatings+based+on+polysilsesquioxanes:+universal+method+toward+light-responsive+surfaces.">Reactive surface coatings based on polysilsesquioxanes: universal method toward light-responsive surfaces.</a> ACS Applied Materials &amp; Interfaces. 3 (2), 124-128 (2011).</li><li>Son, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Penetration+and+exchange+kinetics+of+primary+alkyl+amines+applied+to+reactive+poly(pentafluorophenyl+acrylate)+thin+films.">Penetration and exchange kinetics of primary alkyl amines applied to reactive poly(pentafluorophenyl acrylate) thin films.</a> Polymer Journal. 48 (4), 487-495 (2016).</li><li>Kessler, D., Roth, P. J., Theato, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+surface+coatings+based+on+polysilsesquioxanes:+controlled+functionalization+for+specific+protein+immobilization.">Reactive surface coatings based on polysilsesquioxanes: controlled functionalization for specific protein immobilization.</a> Langmuir. 25 (17), 10068-10076 (2009).</li><li>Kessler, D., Theato, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+surface+coatings+based+on+polysilsesquioxanes:+defined+adjustment+of+surface+wettability.">Reactive surface coatings based on polysilsesquioxanes: defined adjustment of surface wettability.</a> Langmuir. 25 (24), 14200-14206 (2009).</li><li>Kessler, D., Nilles, K., Theato, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modular+approach+towards+multi-functional+surfaces+with+adjustable+and+dual-responsive+wettability+using+a+hybrid+polymer+toolbox.">Modular approach towards multi-functional surfaces with adjustable and dual-responsive wettability using a hybrid polymer toolbox.</a> Journal of Materials Chemistry. 19 (43), 8184-8189 (2009).</li><li>Eberhardt, M., Mruk, R., Zentel, R., Theato, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+pentafluorophenyl(meth)acrylate+polymers:+new+precursor+polymers+for+the+synthesis+of+multifunctional+materials.">Synthesis of pentafluorophenyl(meth)acrylate polymers: new precursor polymers for the synthesis of multifunctional materials.</a> European Polymer Journal. 41 (7), 1569-1575 (2005).</li><li>Jochum, F. D., Forst, F. R., Theato, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PNIPAM+copolymers+containing+light-responsive+chromophores:+a+method+toward+molecular+logic+gates.">PNIPAM copolymers containing light-responsive chromophores: a method toward molecular logic gates.</a> Macromolecular Rapid Communications. 31 (16), 1456-1461 (2010).</li><li>Schattling, P., Pollmann, I., Theato, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+CO2-responsive+polymers+by+post-polymerization+modification.">Synthesis of CO2-responsive polymers by post-polymerization modification.</a> Reactive &amp; Functional Polymers. 75, 16-21 (2014).</li><li>He, L., Szameit, K., Zhao, H., Hahn, U., Theato, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postpolymerization+modification+using+less+cytotoxic+activated+ester+polymers+for+the+synthesis+of+biological+active+polymers.">Postpolymerization modification using less cytotoxic activated ester polymers for the synthesis of biological active polymers.</a> Biomacromolecules. 15 (8), 3197-3205 (2014).</li><li>Arnold, R. M., McNitt, C. D., Popik, V. V., Locklin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+grafting+of+poly(pentafluorophenyl+acrylate)+onto+oxides:+versatile+substrates+for+reactive+microcapillary+printing+and+self-sorting+modification.">Direct grafting of poly(pentafluorophenyl acrylate) onto oxides: versatile substrates for reactive microcapillary printing and self-sorting modification.</a> Chemical Communications. 50 (40), 5307-5309 (2014).</li><li>Son, H., Ku, J., Kim, Y., Li, S., Char, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amine-Reactive+Poly(pentafluorophenyl+acrylate)+Brush+Platforms+for+Cleaner+Protein+Purification.">Amine-Reactive Poly(pentafluorophenyl acrylate) Brush Platforms for Cleaner Protein Purification.</a> Biomacromolecules. 19 (3), 951-961 (2018).</li><li>Cullen, S. E., Schwartz, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+for+isolation+of+H-2+and+Ia+alloantigens+with+immunoprecipitation+induced+by+protein+A-bearing+staphylococci.">An improved method for isolation of H-2 and Ia alloantigens with immunoprecipitation induced by protein A-bearing staphylococci.</a> The Journal of Immunology. 117 (1), 136-142 (1976).</li><li>Sisson, T. H., Castor, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+for+immobilizing+IgG+antibodies+on+protein+A-agarose.">An improved method for immobilizing IgG antibodies on protein A-agarose.</a> Journal of Immunology Methods. 127 (2), 215-220 (1990).</li><li>Peritz, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoprecipitation+of+mRNA-protein+complexes.">Immunoprecipitation of mRNA-protein complexes.</a> Nature Protocols. 1 (2), 577-580 (2006).</li><li>Zhang, Z., Chen, S., Jiang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual-functional+biomimetic+materials:+nonfouling+poly+(carboxybetaine)+with+active+functional+groups+for+protein+immobilization.">Dual-functional biomimetic materials: nonfouling poly (carboxybetaine) with active functional groups for protein immobilization.</a> Biomacromolecules. 7 (12), 3311-3315 (2006).</li><li>Yao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NHS-ester+functionalized+poly(PEGMA)+brushes+on+silicon+surface+for+covalent+protein+immobilization.">NHS-ester functionalized poly(PEGMA) brushes on silicon surface for covalent protein immobilization.</a> Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 66 (2), 233-239 (2008).</li><li>Ma, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Facile+fabrication+of+microsphere-polymer+brush+hierarchically+three-dimensional+(3D)+substrates+for+immunoassays.">Facile fabrication of microsphere-polymer brush hierarchically three-dimensional (3D) substrates for immunoassays.</a> Chemical Communications. 51 (31), 6749-6752 (2015).</li><li>Chong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thiocarbonylthio+compounds+[SC+(Ph)+S&#8722;+R]+in+free+radical+polymerization+with+reversible+addition-fragmentation+chain+transfer+(RAFT+Polymerization).+Role+of+the+free-radical+leaving+group+(R).">Thiocarbonylthio compounds [SC (Ph) S&#8722; R] in free radical polymerization with reversible addition-fragmentation chain transfer (RAFT Polymerization). Role of the free-radical leaving group (R).</a> Macromolecules. 36 (7), 2256-2272 (2003).</li><li>Jochum, F. D., Theato, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature-+and+Light-Responsive+Polyacrylamides+Prepared+by+a+Double+Polymer+Analogous+Reaction+of+Activated+Ester+Polymers.">Temperature- and Light-Responsive Polyacrylamides Prepared by a Double Polymer Analogous Reaction of Activated Ester Polymers.</a> Macromolecules. 42 (16), 5941-5945 (2009).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+The+Western+Blot.">Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot.</a> JoVE. , (2018).</li><li>Chua, G. B. H., Roth, P. J., Duong, H. T. T., Davis, T. P., Lowe, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+Thermoresponsive+Solution+Properties+of+Poly[oligo(ethylene+glycol)+(meth)acrylamide]s:+Biocompatible+PEG+Analogues.">Synthesis and Thermoresponsive Solution Properties of Poly[oligo(ethylene glycol) (meth)acrylamide]s: Biocompatible PEG Analogues.</a> Macromolecules. 45 (3), 1362-1374 (2012).</li></ol>

Die Synthese von poly(PFPA) gepfropft SiO2 Perlen in Abbildung 1dargestellt ist. Durch den Einsatz von APTES als Linker Molekül, können poly(PFPA) Bürsten kovalent gepfropft, SiO2 Substrat über einen einfachen Schritten zubereitet werden. Obwohl einige der PFP-Einheiten für die Reaktion mit APTES geopfert werden, sollen eine große Anzahl von PFP-Einheiten für spätere Reaktion mit amino-PEG oder Antikörper verfügbar bleiben. Die PFP-Gruppen sind dafür bekannt,...

Reaktive Polymer Bürsten haben viel Interesse in den letzten Jahren erhalten. Sie können verwendet werden, um funktionelle Moleküle auf organische oder anorganische Materialien für aktivierte Oberflächen mit Anwendungen in Bereichen wie Erkennung und Trennung1,2,3,4zu immobilisieren, 5. Unter die reaktive Polymere berichtet sind jene mit Pentafluorophenyl Ester Einheiten besonders aufgrund ihrer hohen Reaktivität mit Aminen und Beständigkeit gegenüber Hydrolyse6. Eine solche Polymer ist poly(PFPA) kann, und es ohne weiteres funktionalisierten nach Polymerisation mit Molekülen, die mit primären oder sekundären Aminen7,8,9,10. In einem Beispiel wurden poly(PFPA) Bürsten mit amino-Spiropyrans Licht reagierende Oberflächen7erstellen reagiert.
Die Vorbereitung der poly(PFPA) und deren Anwendungen wurden in einer Reihe von früheren Publikationen6,7,8,9,10,11,12 beschrieben ,13,14,15,16,17. Insbesondere berichtet Theato und Mitarbeiter die Synthese von poly(PFPA) Bürsten über "Pfropfen zu" und "Pfropfen aus" Methoden7,8,10,11,12 . In der "Pfropfen" Ansatz, eine Poly (Methylsilsesquioxane)-Poly (Pentafluorophenyl Acrylat) (poly(MSSQ-PFPA))-Hybrid-Polymer synthetisiert8,10,11,12war. Die poly(MSSQ)-Komponente konnte Form starke Adhäsion mit einer Reihe von verschiedenen organischen und anorganischen Oberflächen, so dass die poly(PFPA)-Komponente, die eine Bürste auf der beschichteten Oberfläche bilden. In der "Pfropfen aus" Ansatz, Oberfläche initiiert reversible Addition und Fragmentierung Kette Transfer (SI-FLOß) Polymerisation wurde eingesetzt, um poly(PFPA) Bürsten7vorzubereiten. In diesem Fall hing eine Oberfläche immobilisiert Kette Transferstelle (SI-CTA) zuerst kovalent an das Substrat durch Kieselsäure-Silan-Reaktion. Immobilisierte SI-CTA nahm dann in der SI-RAFT Polymerisation PFPA Monomere, dicht gepackten poly(PFPA) Bürsten mit stabile kovalente Anbindung an das Substrat zu erzeugen.
Durch die Nutzung der poly(PFPA) Bürsten über SI-RAFT Polymerisation synthetisiert, haben wir vor kurzem die Immobilisierung von Antikörpern auf poly(PFPA) gepfropft Silica-Partikel und deren spätere Anwendung in Protein Reinigung18gezeigt. Die Verwendung von poly(PFPA) Bürsten für Antikörper Immobilisierung erwies sich um eine Reihe von Fragen im Zusammenhang mit aktuellen Protein Trennung durch IP-zu lösen. Herkömmliche IP beruht auf der Verwendung von Protein A/G als ein Linker für Antikörper Immobilisierung19,20,21. Da die Verwendung von Protein A/G der Antikörper mit einer bestimmten Orientierung angebracht werden kann, wird eine hohe Ziel Antigen Erholung Effizienz erreicht. Allerdings leidet die Verwendung von Protein A/G unspezifische Protein-Interaktion sowie der Verlust von Antikörpern während Proteingewinnung, die ein hohes Maß an Rauschen beitragen. Um diese Mängel zu beheben, wurde die direkte Vernetzung von Antikörpern gegen eine feste Stütze erforschten22,23,24. Die Effizienz solcher Techniken ist in der Regel gering aufgrund der zufälligen Orientierung der Antikörper vernetzt. Für das Substrat poly(PFPA) gepfropft ist die Immobilisierung von Antikörpern dauerhaft, durch Austausch Reaktion zwischen PFP Einheiten und Amin Funktionalitäten auf Antikörper erreicht. Obwohl die Antikörper-Ausrichtung noch zufällig ist, profitiert das System haben viele reaktive PFP-Sites, steuerbar durch den Grad der Polymerisation. Darüber hinaus zeigten wir, dass durch partielle Substitution von PFP-Einheiten mit amino-PEG, kann Oberfläche Hydrophilie abgestimmt werden weitere Effizienzsteigerungen Protein Recovery System18. Insgesamt zeigten die poly(PFPA) gepfropft Silica-Partikel eine wirksame Alternative zu traditionellen IP mit angemessenen Effizienz sowie viel sauberer Hintergrund sein.
In diesem Beitrag berichten wir über eine alternative Methode zur poly(PFPA) veredelte Oberfläche Antikörper Immobilisierung und IP-Anwendung vorzubereiten. In zwei einfachen Schritten, wie in Abbildung 1dargestellt ein APTES Linker Molekül zuerst lagert sich auf die Silizium-Oberfläche, dann poly(PFPA) Polymer ist kovalent angeschlossen an die Linker-Molekül durch die Reaktion zwischen der PFP-Einheiten auf die Polymer und Amin-Funktionen auf APTES. Diese Vorbereitung Methode ermöglicht die permanente Vernetzung der poly(PFPA) auf einer Substratoberfläche, aber vermeidet viele Komplikationen im Zusammenhang mit SI-CTA-Synthese und SI-RAFT Polymerisation von poly(PFPA) Bürsten. Teilsubstitution der PFP-Einheiten mit amino-PEG kann noch durchgeführt werden, ermöglicht die Feinabstimmung der Oberflächeneigenschaften der Polymer-Pinsel. Wir zeigen die poly(PFPA) gepfropft Kieselsäure Perlen so vorbereitet mit Antikörper immobilisiert und zur Proteinanreicherung über IP verwendet werden können. Die detaillierte Wulst Vorbereitung Verfahren, Antikörper Immobilisierung und IP-Tests sind in diesem Artikel dokumentiert, für Leser interessierten bei der Suche nach eine Alternative zu herkömmlichen Protein A/G IP-basierte.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2,2-Azobisisobutyronitrile, 99%</td>
			<td>Daejung Chemicals</td>
			<td>1102-4405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl alcohol for HPLC, 99.9%</td>
			<td>Duksan Pure Chemicals</td>
			<td>d62</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmagnesium bromide solution 1.0&#160;M in THF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>331376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon disulfide anhydrous, &#8805;99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>335266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzyl bromide, 98%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B17905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petroleum ether, 90%</td>
			<td>Samchun Chemicals</td>
			<td>P0220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl ether, 99%</td>
			<td>Daejung Chemicals</td>
			<td>4025-4404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate anhydrous, powder,&#160;99%</td>
			<td>Daejung Chemicals</td>
			<td>5514-4405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentafluorophenyl acrylate</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-264001</td>
			<td>contains inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium oxide, activated, basic, Brockmann I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>199443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Daejung Chemicals</td>
			<td>7548-4400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anisole anhydrous, 99.7%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>296295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica nanoparticle</td>
			<td>Microparticles GmbH</td>
			<td>SiO2-R-0.7</td>
			<td>5% w/v aqueous suspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Aminopropyltrimethoxysilane, &#62;96.0%</td>
			<td>Tokyo Chemical Industry</td>
			<td>T1255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide for HPLC, &#8805;99.7%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34869</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amino-terminated poly(ethylene glycol) methyl ether</td>
			<td>Polymer Source</td>
			<td>P16082-EGOCH3NH2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline tablet</td>
			<td>Takara</td>
			<td>T9181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>9480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl (pH 8.0)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9855G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9640G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40</td>
			<td>VWR</td>
			<td>E109-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15514-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Biosesang</td>
			<td>D1037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor</td>
			<td>Merck</td>
			<td>535140-1MLCN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromo phenol blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B5525-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl (pH 6.8)</td>
			<td>Biosolution</td>
			<td>BT033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Biosolution</td>
			<td>BS003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21985-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PKR Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>12297S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH Antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-32233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Rabbit IgG</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>2729S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa</td>
			<td>Korea Cell Line Bank</td>
			<td>10002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>DAIHAN Scientific</td>
			<td>WUC-D10H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonicator</td>
			<td>BMBio</td>
			<td>BR2006A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge I</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge II</td>
			<td>LABOGENE</td>
			<td>1736R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator</td>
			<td>FINEPCR</td>
			<td>ROTATOR/AG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum oven</td>
			<td>DAIHAN Scientific</td>
			<td>ThermoStable OV-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel permeation chromatography (THF)</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>1260 Infinity II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-ray photoelectron spectrometer</td>
			<td>Thermo VG Scientific</td>
			<td>Sigma Probe</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynamic light scattering</td>
			<td>Malvern Instruments</td>
			<td>ZEN 3690</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of poly(pentafluorophenyl acrylate) functionalized sio2 beads for protein purification

Wir zeigen eine einfache Methode um Poly (Pentafluorophenyl Acrylat) vorzubereiten (poly(PFPA)) gepfropft Kieselsäure Perlen für Antikörper Immobilisierung und nachfolgende Immunopräzipitation (IP) Anwendung. Die poly(PFPA) veredelte Oberfläche ist über einen einfachen Schritten bereit. Im ersten Schritt wird 3-Aminopropyltriethoxysilane (APTES) wie ein Linker-Molekül auf der Oberfläche Kieselsäure hinterlegt. In einem zweiten Schritt poly(PFPA) Homopolymer, über die reversible Addition und Fragmentierung Kette Transfer (FLOß) Polymerisation synthetisiert ist gepfropft an die Linker-Molekül durch die Reaktion der Austausch zwischen den Pentafluorophenyl (PFP) Einheiten auf die Polymer und Amin Gruppen auf APTES. Die Abscheidung des APTES und poly(PFPA) auf die Kieselsäure Teilchen sind durch Röntgen-Photoelektronen-Spektroskopie (XPS) bestätigt, sowie durch die Änderung der Größe der Partikel überwacht über dynamische Lichtstreuung (DLS) gemessen. Verbesserung der Oberfläche Hydrophilie der Perlen, partielle Substitution von poly(PFPA) mit Poly(ethylene glycol) Amin funktionalisiert wird auch (amino-PEG) durchgeführt. Die PEG ersetzt poly(PFPA) gepfropft Kieselsäure, die Perlen mit Antikörpern für IP-Anwendung dann immobilisiert sind. Zur Demonstration ein Antikörper gegen Proteinkinase RNA aktiviert (PKR) beschäftigt, und IP-Effizienz wird durch Western blotting bestimmt. Die Ergebnisse der Analyse zeigen, dass die Antikörper immobilisiert Perlen in der Tat lässt sich PKR zu bereichern, während unspezifische Protein-Interaktionen minimal sind.

Ein Schaltplan für die Zubereitung von poly(PFPA) gepfropft SiO2 Perlen, mit oder ohne PEG Substitution ist in Abbildung 1dargestellt. Zur Überwachung der APTES und poly(PFPA) Prozess, nackten SiO2 Perlen, Pfropfung APTES funktionalisiert SiO2 Perlen und poly(PFPA) gepfropft SiO2 Perlen von DLS (Abbildung 2) und XPS (Abbildung 3) gekennzeichnet sind. IP-E...

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Preparation of Polypentafluorophenyl acrylate Functionalized SiO2 Beads for Protein Purification

Ein Protokoll für die Zubereitung von Poly (Pentafluorophenyl Acrylat) (poly(PFPA)) gepfropft Kieselsäure Perlen wird vorgestellt. Die poly(PFPA) funktionalisierten Oberfläche ist dann mit Antikörper immobilisiert und die Protein-Trennung durch Immunopräzipitation erfolgreich eingesetzt.

Vorbereitung der Poly(pentafluorophenyl acrylate) funktionalisiert SiO2 Perlen Proteinreinigung

We demonstrate a simple method to prepare poly(pentafluorophenyl acrylate) (poly(PFPA)) grafted silica beads for antibody immobilization and subsequent ...

Diese Methode kann zur Herstellung biomolekülaktivierter Oberflächen eingesetzt werden, die in Bereichen wie Arzneimittelabgabe, biologisches Zielnachweis und Biotrennung Anwendung finden. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die Poly-PFPA-Bürsten mit Auminen hochreaktiv sind und die Immobilisierung von Antikörpern durch Inkubation in Pufferlösung für einige Stunden erreicht wird. Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Proteinreinigung durch Immunreinigung, da der immobilisierte Antikörper erfolgreich mit Zielantigenen binden kann.Obwohl diese Methode für die Antikörpermobilisierung und Proteinreinigung demonstriert wird, kann sie auch auf andere Systeme angewendet werden, die eine biomolekulare Mobilisierung erfordern. Zur Behandlung von Siliziumdioxidperlen mit APTES erhalten Sie zunächst Siliziumdioxidpartikel in Form einer wässrigen Suspension mit einem Volumen von 5 %. Kombinieren Sie 0,8 Milliliter Siliziumdioxidsuspension mit 40 Milligramm APTES und acht Milliliter Methanol in einer 20-Milliliter-Szintillationsdurchstechflasche mit Rührstange.Lassen Sie die Reaktion bei Raumtemperatur für fünf Stunden mit kräftigem Rühren ablaufen. Nach fünf Stunden die Lösung auf ein konisches Rohr übertragen. Um die funktionalisierten Silicondioxidperlen aptES zu isolieren, zentrieren Sie die Lösung fünf Minuten lang bei 10.000 G.Entfernen Sie dann den Überstand. Waschen Sie nun die Perlen, indem Sie sie in drei Milliliter frisches Methanol röten. Schütteln Sie das Rohr von Hand zum Mischen, aber wenn nötig, verbessern Sie die Dispersion durch Beschallung in einem Wasserbad für ein paar Sekunden.Zentrifugieren Sie wie zuvor, und wiederholen Sie den Waschschritt noch einmal. Kombinieren Sie die Methanol-Waschsilikondioxidperlen mit drei Millilitern Dimethylsulfoxid oder DMSO. Schütteln Sie die Mischung von Hand, oder bei Bedarf für ein paar Sekunden beschallen, bis die Perlen vollständig im DMSO verteilt sind.Entfernen Sie nach der Zentrifugation zuvor den Überstand. Wiederholen Sie den Zentrifugationsschritt ein letztes Mal, um einen vollständigen Lösungsmittelaustausch von Methanol zu DMSO zu gewährleisten. Um die Poly-PFPA-Lösung vorzubereiten, lösen Sie 20 Milligramm Poly-PFPA in zwei Milliliter DMSO in einer 20-Milliliter-Szintillationsdurchstechflasche auf.Um PEG-Lösung vorzubereiten, lösen Sie Amin funktionalisierte PEG in einem Milliliter DMSO. Übertragen Sie nun die PEG-Lösung auf die Poly-PFPA-Lösung. Reagieren Sie bei Raumtemperatur für eine Stunde mit kräftigem Rühren.Übertragen Sie einen Milliliter der in DMSO aufgehängten APES-funktionalisierten Siliciumdioxidperlen in die PEG-substituierte Poly-PFPA-Lösung. Lassen Sie die Veredelung zwischen Poly-PFPA und APTES funktionalisierten Siliziumdioxidperlen bei Raumtemperatur für eine Stunde mit kräftigem Rühren ablaufen. Dann isolieren Sie die Perlen durch Zentrifugation bei 10.000 G für fünf Minuten, gefolgt von der Entfernung des Überstandes.Waschen Sie die Perlen, indem Sie drei Milliliter DMSO hinzufügen, und mischen Sie sie von Hand oder mit ein paar Sekunden Beschallung. Zentrifugieren Sie die Perlen wie bisher. Und entfernen Sie den Überstand, bevor Sie die DMSO-Wäsche zweimal wiederholen.Waschen Sie die Perlen zweimal mehr mit drei Milliliter dreifach destilliertem Wasser. Dann von Hand oder mit ein paar Sekunden Beschallung mischen. Zentrifugieren Sie die Perlen wie bisher und entfernen Sie den Überstand.Zum Schluss trocknen Sie die Perlen bei 40 Grad Celsius über Nacht im Vakuumofen. Fügen Sie fünf Milligramm Poly-PFPA-veredelte Siliziumdioxidperlen zu einem 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr hinzu. Waschen Sie die Perlen, indem Sie 800 Mikroliter PBS hinzufügen, und mischen Sie gut durch Wirbeln.Zentrifugieren Sie die Perlen bei 10.000 G bei Raumtemperatur für eine Minute. Entfernen Sie den Überstand, und wiederholen Sie den Waschschritt dreimal. Fügen Sie nun 350 Mikroliter frisches PBS, 50 Mikroliter 0,1% PBST und 6,67 Mikrogramm des Antikörpers hinzu.Etwa 20 Stunden auf einem Rotator bei vier Grad Celsius inkubieren. Am nächsten Tag die Perlen und Zentrifuge bei 400 G und vier Grad Celsius für eine Minute waschen. Entfernen Sie dann den Überstand und fügen Sie vorsichtig 400 Mikroliter Lysepuffer hinzu.Die Perlen vorsichtig wieder aussetzen, indem Sie fünfmal nach oben und unten pfeifen. Wiederholen Sie diesen Waschschritt dreimal. Nach der letzten Wäsche so viel vom Überstand wie möglich entfernen.Bereiten Sie Zellen und Lysepuffer wie im Textprotokoll beschrieben vor. Dann das Zellpellet mit 400 Mikrolitern des Lysepuffers wieder aufhängen. Beschallen Sie die Zellen mit einem Ultraschallgerät.Nach der Beschallung kurz Wirbel. Dann zentrifugieren Sie das Lysat bei 20.000 G bei vier Grad Celsius für 10 Minuten. Übertragen Sie den Überstand auf ein neues 1,5 Milliliter Zentrifugenrohr.Um Immunpräzipitation durchzuführen, übertragen Sie 300 Mikroliter Zelllysat auf zuvor vorbereitete Antikörper immobilisierte Poly PFPA-veredelte Siliziumdioxidperlen. Bewahren Sie 30 Mikroliter der Zelle lysiert als Eingangsprobe in einem neuen Mikrozentrifugenrohr auf. Die Lysatperlenmischung drei Stunden lang auf einem Rotator bei vier Grad Celsius inkubieren.Nach der Inkubation zentrieren Sie die Mischung bei 400 G bei vier Grad Celsius für eine Minute. Entfernen Sie den Überstand, und fügen Sie vorsichtig 400 Mikroliter Waschpuffer hinzu. Die Perlen vorsichtig wieder aussetzen, indem Sie etwa fünfmal nach oben und unten pfeifen.Entfernen Sie nach drei Washes so viel vom Überstand wie möglich. Fügen Sie 30 Mikroliter 2x SDS-Ladefarbstoff zu den Perlen und zur Eingangsprobe hinzu. Dann erhitzen Sie sie für 10 Minuten bei 95 Grad Celsius.Analysieren Sie die Probe nach dem Erhitzen mit Dem westlichen Blotting, oder lagern Sie die Probe bei minus 20 Grad Celsius. Die funktionalisierten Kieselsäureperlen werden mittels Röntgenphotoelektronenspektroskopie (XPS) untersucht, um die Oberflächenzusammensetzung zu bestimmen. Repräsentative XPS-Daten werden hier angezeigt.Nach der APTES-Behandlung wird der Stickstoff-1s-Peak, der mit der Amingruppenzone APTES verbunden ist, nachgewiesen. Nach der Poly-PFPA-Behandlung wird die fluor-1s-Spitze, die mit den PFP-Einheiten auf dem Polymer verbunden ist, nachgewiesen. Proteinkinase-RNA aktiviert, oder PKR-Anreicherung durch Immunpräzipitation durchgeführt, und die angespielte Proteinprobe wird mit Western Blotting analysiert.Wie erwartet zeigen immobilisierte Perlen ohne Antikörper oder eine unspezifische Antikörpermischung keine PKR-Wiederherstellung. Die mit Anti-PKR bebrüteten Perlen können PKR erfolgreich bereichern, wie das Vorhandensein eines PKR-Bandes und das Fehlen eines GAPDH-Bandes zeigen. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass beim Vergleich von Systemen die IP-Experimente sowie die anschließende Western-Blotting-Analyse gleichzeitig durchgeführt werden sollten.Nach seiner Entwicklung kann diese Technik zur Immobilisierung verschiedener biomolekularer oder materieller Substrateingesetzt eingesetzt werden. Darüber hinaus hat diese Methode den zusätzlichen Vorteil der Abstimmung Only Surface-Eigenschaft, die auf die Anforderungen jeder Anwendung zugeschnitten werden kann.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Preparation of Poly(pentafluorophenyl acrylate) Functionalized SiO2 Beads for Protein Purification

Synthesis and Characterization of Functionalized Metal-organic Frameworks

Synthese und Charakterisierung von funktionalisierten Metall-organische Gerüste

Metal-organic frameworks have attracted extraordinary amounts of research attention, as they are attractive candidates for numerous industrial and ...

Forschung

Chemie

Microbubble Fabrication of Concave-porosity PDMS Beads

Mikroblasen Herstellung von Konkav-Porosität PDMS Beads

Microbubble fabrication (by use of a fine emulsion) provides a means of increasing the surface-area-to-volume (SAV) ratio of polymer materials, which is ...

Immobilization of Multi-biocatalysts in Alginate Beads for Cofactor Regeneration and Improved Reusability

Immobilisierung von Multi-Biokatalysatoren in Alginatbeads für Kofaktorregenerierung und verbesserte Reusability

We have recently developed a simple, reusable and coupled whole-cell biocatalytic system with the capability of cofactor regeneration and biocatalyst ...

Preparation of a Corannulene-functionalized Hexahelicene by Copper(I)-catalyzed Alkyne-azide Cycloaddition of Nonplanar Polyaromatic Units

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Herstellung eines Corannulene-funktionalisierten Hexahelicen von Kupfer (I) -katalysierte Alkin-Azid-Cyclo von Nichtplanare Polyaromatische Einheiten

The main purpose of this video is to show 6 reaction steps of a convergent synthesis and prepare a complex molecule containing up to three nonplanar ...

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Die Wirkung der interfacialen chemischen Bindung in TiO<sub&gt; 2</sub&gt; -SiO<sub&gt; 2</sub&gt; Verbundwerkstoffe über ihre photokatalytische NOx-Abfallleistung

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Porphyrin-Modified Beads in Flow Cytometry

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Porphyrin-Modified Beads for Use as Compensation Controls in Flow Cytometry (Video) | JoVE 

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