Name: preparation of poly(pentafluorophenyl acrylate) functionalized sio2 beads for protein purification
Uploaded: 2018-11-19T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Polypentafluorophenyl acrylate Functionalized SiO2 Beads for Protein Purification at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי סוכנות לפיתוח הגנה (מענק מס ' UD170039ID).

1. הכנת Poly(PFPA) Homopolymer
<ol><li>Recrystallization של AIBN<ol>
<li>לשלב 5 g של 2,2'-azobis(2-methylpropionitrile) (AIBN) עם 25 מ של מתנול ב גביע 250 מ. לטבול את הספל באמבט שמן 60 ° C, ואז נמרצות ומערבבים את התערובת עם בר-מערבבים עד התפרקה לחלוטין AIBN.</li>
		<li>לסנן את הפתרון חמים באמצעות נייר סינון (5-8 μm חלקיקים השמירה) ולאחסן את פילטרט של 4 ° C כ...

<ol>
	<li>Johnsson, B., L&#246;f&#229;s, S., Lindquist, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilization+of+proteins+to+a+carboxymethyldextran-modified+gold+surface+for+biospecific+interaction+analysis+in+surface+plasmon+resonance+sensors.">Immobilization of proteins to a carboxymethyldextran-modified gold surface for biospecific interaction analysis in surface plasmon resonance sensors.</a> Analytical Biochemistry. 198 (2), 268-277 (1991).</li><li>Kurzawa, C., Hengstenberg, A., Schuhmann, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilization+method+for+the+preparation+of+biosensors+based+on+pH+shift-induced+deposition+of+biomolecule-containing+polymer+films.">Immobilization method for the preparation of biosensors based on pH shift-induced deposition of biomolecule-containing polymer films.</a> Analytical Chemistry. 74 (2), 355-361 (2002).</li><li>You, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+identification+of+proteins+using+nanoparticle-fluorescent+polymer+'chemical+nose'+sensors.">Detection and identification of proteins using nanoparticle-fluorescent polymer 'chemical nose' sensors.</a> Nature Nanotechnology. 2 (5), 318-323 (2007).</li><li>Roberts, M. W., Ongkudon, C. M., Forde, G. M., Danquah, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatility+of+polymethacrylate+monoliths+for+chromatographic+purification+of+biomolecules.">Versatility of polymethacrylate monoliths for chromatographic purification of biomolecules.</a> Journal of Separation Science. 32 (15-16), 2485-2494 (2009).</li><li>Sandison, M. E., Cumming, S. A., Kolch, W., Pitt, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On-chip+immunoprecipitation+for+protein+purification.">On-chip immunoprecipitation for protein purification.</a> Lab on a Chip. 10 (20), 2805-2813 (2010).</li><li>Das, A., Theato, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activated+Ester+Containing+Polymers:+Opportunities+and+Challenges+for+the+Design+of+Functional+Macromolecules.">Activated Ester Containing Polymers: Opportunities and Challenges for the Design of Functional Macromolecules.</a> Chemical Reviews. 116 (3), 1434-1495 (2016).</li><li>Choi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functionalization+and+patterning+of+reactive+polymer+brushes+based+on+surface+reversible+addition+and+fragmentation+chain+transfer+polymerization.">Functionalization and patterning of reactive polymer brushes based on surface reversible addition and fragmentation chain transfer polymerization.</a> Journal of Polymer Science Part A: Polymer Chemistry. 50 (19), 4010-4018 (2012).</li><li>Kessler, D., Jochum, F. D., Choi, J., Char, K., Theato, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+surface+coatings+based+on+polysilsesquioxanes:+universal+method+toward+light-responsive+surfaces.">Reactive surface coatings based on polysilsesquioxanes: universal method toward light-responsive surfaces.</a> ACS Applied Materials &amp; Interfaces. 3 (2), 124-128 (2011).</li><li>Son, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Penetration+and+exchange+kinetics+of+primary+alkyl+amines+applied+to+reactive+poly(pentafluorophenyl+acrylate)+thin+films.">Penetration and exchange kinetics of primary alkyl amines applied to reactive poly(pentafluorophenyl acrylate) thin films.</a> Polymer Journal. 48 (4), 487-495 (2016).</li><li>Kessler, D., Roth, P. J., Theato, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+surface+coatings+based+on+polysilsesquioxanes:+controlled+functionalization+for+specific+protein+immobilization.">Reactive surface coatings based on polysilsesquioxanes: controlled functionalization for specific protein immobilization.</a> Langmuir. 25 (17), 10068-10076 (2009).</li><li>Kessler, D., Theato, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+surface+coatings+based+on+polysilsesquioxanes:+defined+adjustment+of+surface+wettability.">Reactive surface coatings based on polysilsesquioxanes: defined adjustment of surface wettability.</a> Langmuir. 25 (24), 14200-14206 (2009).</li><li>Kessler, D., Nilles, K., Theato, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modular+approach+towards+multi-functional+surfaces+with+adjustable+and+dual-responsive+wettability+using+a+hybrid+polymer+toolbox.">Modular approach towards multi-functional surfaces with adjustable and dual-responsive wettability using a hybrid polymer toolbox.</a> Journal of Materials Chemistry. 19 (43), 8184-8189 (2009).</li><li>Eberhardt, M., Mruk, R., Zentel, R., Theato, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+pentafluorophenyl(meth)acrylate+polymers:+new+precursor+polymers+for+the+synthesis+of+multifunctional+materials.">Synthesis of pentafluorophenyl(meth)acrylate polymers: new precursor polymers for the synthesis of multifunctional materials.</a> European Polymer Journal. 41 (7), 1569-1575 (2005).</li><li>Jochum, F. D., Forst, F. R., Theato, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PNIPAM+copolymers+containing+light-responsive+chromophores:+a+method+toward+molecular+logic+gates.">PNIPAM copolymers containing light-responsive chromophores: a method toward molecular logic gates.</a> Macromolecular Rapid Communications. 31 (16), 1456-1461 (2010).</li><li>Schattling, P., Pollmann, I., Theato, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+CO2-responsive+polymers+by+post-polymerization+modification.">Synthesis of CO2-responsive polymers by post-polymerization modification.</a> Reactive &amp; Functional Polymers. 75, 16-21 (2014).</li><li>He, L., Szameit, K., Zhao, H., Hahn, U., Theato, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postpolymerization+modification+using+less+cytotoxic+activated+ester+polymers+for+the+synthesis+of+biological+active+polymers.">Postpolymerization modification using less cytotoxic activated ester polymers for the synthesis of biological active polymers.</a> Biomacromolecules. 15 (8), 3197-3205 (2014).</li><li>Arnold, R. M., McNitt, C. D., Popik, V. V., Locklin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+grafting+of+poly(pentafluorophenyl+acrylate)+onto+oxides:+versatile+substrates+for+reactive+microcapillary+printing+and+self-sorting+modification.">Direct grafting of poly(pentafluorophenyl acrylate) onto oxides: versatile substrates for reactive microcapillary printing and self-sorting modification.</a> Chemical Communications. 50 (40), 5307-5309 (2014).</li><li>Son, H., Ku, J., Kim, Y., Li, S., Char, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amine-Reactive+Poly(pentafluorophenyl+acrylate)+Brush+Platforms+for+Cleaner+Protein+Purification.">Amine-Reactive Poly(pentafluorophenyl acrylate) Brush Platforms for Cleaner Protein Purification.</a> Biomacromolecules. 19 (3), 951-961 (2018).</li><li>Cullen, S. E., Schwartz, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+for+isolation+of+H-2+and+Ia+alloantigens+with+immunoprecipitation+induced+by+protein+A-bearing+staphylococci.">An improved method for isolation of H-2 and Ia alloantigens with immunoprecipitation induced by protein A-bearing staphylococci.</a> The Journal of Immunology. 117 (1), 136-142 (1976).</li><li>Sisson, T. H., Castor, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+for+immobilizing+IgG+antibodies+on+protein+A-agarose.">An improved method for immobilizing IgG antibodies on protein A-agarose.</a> Journal of Immunology Methods. 127 (2), 215-220 (1990).</li><li>Peritz, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoprecipitation+of+mRNA-protein+complexes.">Immunoprecipitation of mRNA-protein complexes.</a> Nature Protocols. 1 (2), 577-580 (2006).</li><li>Zhang, Z., Chen, S., Jiang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual-functional+biomimetic+materials:+nonfouling+poly+(carboxybetaine)+with+active+functional+groups+for+protein+immobilization.">Dual-functional biomimetic materials: nonfouling poly (carboxybetaine) with active functional groups for protein immobilization.</a> Biomacromolecules. 7 (12), 3311-3315 (2006).</li><li>Yao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NHS-ester+functionalized+poly(PEGMA)+brushes+on+silicon+surface+for+covalent+protein+immobilization.">NHS-ester functionalized poly(PEGMA) brushes on silicon surface for covalent protein immobilization.</a> Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 66 (2), 233-239 (2008).</li><li>Ma, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Facile+fabrication+of+microsphere-polymer+brush+hierarchically+three-dimensional+(3D)+substrates+for+immunoassays.">Facile fabrication of microsphere-polymer brush hierarchically three-dimensional (3D) substrates for immunoassays.</a> Chemical Communications. 51 (31), 6749-6752 (2015).</li><li>Chong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thiocarbonylthio+compounds+[SC+(Ph)+S&#8722;+R]+in+free+radical+polymerization+with+reversible+addition-fragmentation+chain+transfer+(RAFT+Polymerization).+Role+of+the+free-radical+leaving+group+(R).">Thiocarbonylthio compounds [SC (Ph) S&#8722; R] in free radical polymerization with reversible addition-fragmentation chain transfer (RAFT Polymerization). Role of the free-radical leaving group (R).</a> Macromolecules. 36 (7), 2256-2272 (2003).</li><li>Jochum, F. D., Theato, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature-+and+Light-Responsive+Polyacrylamides+Prepared+by+a+Double+Polymer+Analogous+Reaction+of+Activated+Ester+Polymers.">Temperature- and Light-Responsive Polyacrylamides Prepared by a Double Polymer Analogous Reaction of Activated Ester Polymers.</a> Macromolecules. 42 (16), 5941-5945 (2009).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+The+Western+Blot.">Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot.</a> JoVE. , (2018).</li><li>Chua, G. B. H., Roth, P. J., Duong, H. T. T., Davis, T. P., Lowe, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+Thermoresponsive+Solution+Properties+of+Poly[oligo(ethylene+glycol)+(meth)acrylamide]s:+Biocompatible+PEG+Analogues.">Synthesis and Thermoresponsive Solution Properties of Poly[oligo(ethylene glycol) (meth)acrylamide]s: Biocompatible PEG Analogues.</a> Macromolecules. 45 (3), 1362-1374 (2012).</li></ol>

הסינתזה של poly(PFPA) הושתל SiO2 חרוזים מודגם באיור1. על ידי שימוש APTES כ מולקולה מקשר, ניתן להכין מברשות poly(PFPA) covalently הושתל. המצע2 SiO באמצעות תהליך בן שני שלבים פשוטים. למרות כמה יחידות ה-PFP מוקרבים על התגובה עם APTES, מספר גדול של יחידות ה-PFP צפויים להישאר זמינים עבור התגובה מ...

מברשות פולימר תגובתי קיבלו את עניין רב בשנים האחרונות. הם יכולים לשמש כדי לשתק מולקולות פונקציונלי על חומרים אורגני או לא ליצירת משטחים מופעל עם יישומים בתחומים כמו איתור והפרדה1,2,3,4, 5. בין פולימרים תגובתי דיווח, אלה המכילים pentafluorophenyl אסתר יחידות שימושיים בעיקר בשל שלהם תגובתיות גבוהה עם אמינים והתנגדות כלפי הידרוליזה6. אחד פולימר כזה הוא poly(PFPA), זה יכול להיות בקלות functionalized שלאחר הפילמור עם מולקולות המכילות אמינים ראשית או משנית7,8,9,10. בדוגמה אחת, מברשות poly(PFPA) היו הגיבו אמינו-spiropyrans ליצירת משטחים אור מגיב7.
הכנת poly(PFPA) ושימושיה תוארו במספר הקודם פרסומים6,7,8,9,10,11,12 ,13,14,15,16,17. בפרט, Theato ועמיתים דיווחו על הסינתזה של מברשות poly(PFPA) דרך "הרכבה כדי" וגם "הרכבה של" שיטות7,8,10,11,12 . ב "משתילים על" הגישה, מבחן פוליגרף (methylsilsesquioxane)-פולי (אקרילט pentafluorophenyl) (poly(MSSQ-PFPA)) היברידית פולימר היה מסונתז8,10,11,12. הרכיב poly(MSSQ) היה מסוגל הדבקה חזקה טופס עם מספר של משטחים אורגניים ואנאורגניים שונים, ובכך מאפשר את הרכיב poly(PFPA) ליצור שכבת מברשת על פני השטח חומרים מצופים. "משתילים מ" הגישה, משטח יזם תוספת הפיך, פיצול שרשרת העברת (סי-רפסודה) הפילמור הועסק להכין מברשות poly(PFPA)7. במקרה זה, סוכן העברת השטח שרשרת קיבוע (סי-CTA) היה הראשון covalently למצע באמצעות התגובה סיליקה-silane. קיבוע של סי-CTA ואז השתתפו סי-רפסודה פלמור של מונומרים PFPA, יצירת מברשות poly(PFPA) בצפיפות עם הצמדה קוולנטיות יציב המצע.
על ידי ניצול מברשות poly(PFPA) מסונתז באמצעות סי-רפסודה פלמור, לאחרונה להדגים את הנייח של נוגדנים על חלקיקי סיליקה poly(PFPA) הושתל ויישומם עוקבות חלבון טיהור18. השימוש poly(PFPA) מברשות נוגדן הנייח נמצאה כדי לפתור מספר בעיות הקשורות הנוכחי ההפרדה חלבון באמצעות ה-IP. IP קונבנציונאלי מסתמך על השימוש של חלבון A/G כמו מקשר (linker) נוגדן הנייח19,20,21. מאז השימוש של חלבון A/G מאפשר את הנוגדנים להיקשר עם כיוון הדפסה ספציפי, מושגת המטרה גבוהות אנטיגן התאוששות יעילות. עם זאת, השימוש של חלבון A/G סובל אינטראקציית חלבון שאינם ספציפיים, כמו גם האובדן של נוגדנים במהלך ההתאוששות חלבון, אשר שניהם תורמים רמה גבוהה של רעש רקע. כדי לפתור חסרונות אלה, crosslinking ישירה של הנוגדנים כדי תמיכה מלאה כבר בחנו22,23,24. היעילות של טכניקות אלה הוא בדרך כלל נמוך בגלל הכיוון האקראי של נוגדנים תפור. המצע poly(PFPA) הושתל, הנייח של נוגדנים הוא קבוע, מושגת באמצעות exchange התגובה בין יחידות ה-PFP ופונקציונליות אמין על נוגדנים. כיוון נוגדן אמנם עדיין אקראי, המערכת מועילה מהצורך תגובתי PFP אתרים רבים, לשליטה על ידי מידת פלמור. יתר על כן, הראינו כי על ידי החלפת חלקי של ה-PFP יחידות עם אמינו-פג, hydrophilicity פני השטח ניתן לכוונן, ושיפור היעילות התאוששות חלבון מערכת18. בסך הכל, חלקיקי סיליקה poly(PFPA) הושתל הוצגו להיות חלופה יעילה IP מסורתי עם יעילות סבירים, כמו גם הרבה רקע נקי יותר.
בתרומה זו, מדווחים שיטה חלופית כדי להכין משטח המושתל poly(PFPA) נוגדנים הנייח ויישום ה-IP. בתהליך בן שני שלבים פשוטים, כמופיע באיור 1, מולקולה מקשר APTES קודם הופקד על גבי המשטח סיליקה, ולאחר מכן הפולימר poly(PFPA) covalently מחובר המולקולה מקשר דרך התגובה בין היחידות PFP על פולימר ולפונקציה אמין על APTES. שיטת הכנה זו מאפשרת crosslinking קבוע של poly(PFPA) על משטח המצע, אך מונע סיבוכים רבים הקשורים סינתזה סי-CTA ו- SI-רפסודה פלמור של מברשות poly(PFPA). החלפה חלקית של יחידות ה-PFP עם אמינו-יתד ניתן עדיין לבצע, שמאפשר כוונון של המאפיינים משטח של מברשת פולימר. אנו מראים חרוזים סיליקה poly(PFPA) הושתל ובכך מוכן יכול להיות מרותק למיטה עם נוגדנים ונועד לשמש העשרה חלבונית דרך IP. הליך הכנת חרוזים מפורט, נוגדן הנייח, ובדיקות IP מתועדים במאמר זה, עבור הקוראים ומעוניינים אלטרנטיבה קונבנציונאלי חלבון A/G מבוסס IP.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2,2-Azobisisobutyronitrile, 99%</td>
			<td>Daejung Chemicals</td>
			<td>1102-4405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl alcohol for HPLC, 99.9%</td>
			<td>Duksan Pure Chemicals</td>
			<td>d62</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmagnesium bromide solution 1.0&#160;M in THF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>331376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon disulfide anhydrous, &#8805;99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>335266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzyl bromide, 98%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B17905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petroleum ether, 90%</td>
			<td>Samchun Chemicals</td>
			<td>P0220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl ether, 99%</td>
			<td>Daejung Chemicals</td>
			<td>4025-4404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate anhydrous, powder,&#160;99%</td>
			<td>Daejung Chemicals</td>
			<td>5514-4405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentafluorophenyl acrylate</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-264001</td>
			<td>contains inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium oxide, activated, basic, Brockmann I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>199443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Daejung Chemicals</td>
			<td>7548-4400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anisole anhydrous, 99.7%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>296295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica nanoparticle</td>
			<td>Microparticles GmbH</td>
			<td>SiO2-R-0.7</td>
			<td>5% w/v aqueous suspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Aminopropyltrimethoxysilane, &#62;96.0%</td>
			<td>Tokyo Chemical Industry</td>
			<td>T1255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide for HPLC, &#8805;99.7%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34869</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amino-terminated poly(ethylene glycol) methyl ether</td>
			<td>Polymer Source</td>
			<td>P16082-EGOCH3NH2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline tablet</td>
			<td>Takara</td>
			<td>T9181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>9480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl (pH 8.0)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9855G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9640G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40</td>
			<td>VWR</td>
			<td>E109-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15514-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Biosesang</td>
			<td>D1037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor</td>
			<td>Merck</td>
			<td>535140-1MLCN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromo phenol blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B5525-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl (pH 6.8)</td>
			<td>Biosolution</td>
			<td>BT033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Biosolution</td>
			<td>BS003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21985-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PKR Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>12297S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH Antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-32233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Rabbit IgG</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>2729S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa</td>
			<td>Korea Cell Line Bank</td>
			<td>10002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>DAIHAN Scientific</td>
			<td>WUC-D10H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonicator</td>
			<td>BMBio</td>
			<td>BR2006A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge I</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge II</td>
			<td>LABOGENE</td>
			<td>1736R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator</td>
			<td>FINEPCR</td>
			<td>ROTATOR/AG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum oven</td>
			<td>DAIHAN Scientific</td>
			<td>ThermoStable OV-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel permeation chromatography (THF)</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>1260 Infinity II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-ray photoelectron spectrometer</td>
			<td>Thermo VG Scientific</td>
			<td>Sigma Probe</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynamic light scattering</td>
			<td>Malvern Instruments</td>
			<td>ZEN 3690</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of poly(pentafluorophenyl acrylate) functionalized sio2 beads for protein purification

נדגים שיטה פשוטה להכנת פוליפוני (אקרילט pentafluorophenyl) (poly(PFPA)) הושתל חרוזים סיליקה עבור קיבעון נוגדן ויישום עוקבות immunoprecipitation (IP). השטח המושתל poly(PFPA) מוכן באמצעות תהליך בן שני שלבים פשוטים. בשלב הראשון, 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) מועבר כ מולקולה מקשר על גבי המשטח סיליקה. בשלב השני, homopolymer poly(PFPA), מסונתז דרך הפיך תוספת פיצול שרשרת העברת (רפסודה) פלמור, הורכבה על המולקולה מקשר דרך התגובה החליפין בין היחידות pentafluorophenyl (PFP) פולימר וקבוצות אמין על APTES. בתצהיר של APTES ו- poly(PFPA) על סיליקה חלקיקים הם אושרה על-ידי photoelectron הספקטרומטריה (XPS), כמו גם המנוטרת על-ידי שינוי גודל החלקיקים נמדד באמצעות פיזור אור דינאמי (DLS). כדי לשפר את hydrophilicity משטח של החרוזים, החלפה חלקית של poly(PFPA) עם poly(ethylene glycol) functionalized-אמין (אמינו-יתד) מבוצע גם. Poly(PFPA) שהוחלפו פג הושתל סיליקה חרוזים אז מרותק למיטה עם נוגדנים עבור יישום ה-IP. להדגמה, נוגדן כנגד חלבון קינאז מופעל RNA (PKR) הוא מועסק, יעילות IP נקבעת על-ידי סופג המערבי. מתוצאות הניתוח מראים כי החרוזים נוגדן. מרותק למיטה אכן יכול לשמש כדי להעשיר PKR בזמן אינטראקציות חלבון שאינם ספציפיים הן מינימליות.

מפרטים טכניים עבור הכנת poly(PFPA) הושתל SiO2 חרוזים, עם או בלי פג החלפת מוצג באיור1. כדי לנטר את APTES ואת poly(PFPA) הרכבה תהליך, חרוזים2 SiO חשופות, APTES functionalized SiO2 חרוזים, poly(PFPA) הושתל SiO2 חרוזים מאופיינים DLS (איור 2) והן XPS (...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Polypentafluorophenyl acrylate Functionalized SiO2 Beads for Protein Purification at JoVE.com

Preparation of Polypentafluorophenyl acrylate Functionalized SiO2 Beads for Protein Purification

פרוטוקול עבור הכנת פוליפוני (pentafluorophenyl אקרילט) (חרוזים סיליקה poly(PFPA)) הושתל מוצג. לאחר מכן, השטח functionalized poly(PFPA) הוא מרותק למיטה עם נוגדנים, בעבר בהצלחה לצורך הקמת מכשול ההפרדה חלבון באמצעות immunoprecipitation.

הכנת חרוזים2 Poly(pentafluorophenyl acrylate) Functionalized SiO לטיהור חלבון

We demonstrate a simple method to prepare poly(pentafluorophenyl acrylate) (poly(PFPA)) grafted silica beads for antibody immobilization and subsequent ...

שיטה זו יכולה לשמש להכנת משטחים המופעלים על ידי ביומולקול, אשר יש יישומים בתחומים כגון אספקת תרופות, זיהוי יעד ביולוגי, והפרדה ביולוגית. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא כי מברשות PFPA פולי מגיבים מאוד עם אמינים, ואת ההשתקה של נוגדנים מושגת על ידי דגירה בת פתרון חיץ במשך כמה שעות. ההשלכות של טכניקה זו להרחיב לכיוון טיהור החלבון באמצעות immunopurification, כמו נוגדן משותק יכול להיקשר בהצלחה עם אנטיגנים היעד.למרות שיטה זו היא להפגין עבור גיוס נוגדנים וטיהור חלבון, זה יכול להיות מיושם גם על מערכות אחרות הדורשות גיוס ביומולקולרי. כדי לטפל גם גם ב-APTES, יש להשיג תחילה חלקיקי דו תחמוצת הסיליקון בצורה של השעיה מיקווית בנפח 5%. לשלב 0.8 מיליליטר של השעיית דו תחמוצת הסיליקון עם 40 מיליגרם של APTES, ושמונה מיליליטר של מתנול בבקבוקון 20 מיליליטר scintillation מצויד בר ערבוב.אפשר לתגובה להמשיך בטמפרטורת החדר במשך חמש שעות עם ערבוב נמרץ. לאחר חמש שעות, להעביר את הפתרון לצינור חרוט. כדי לבודד את גם גם הגידור הדו-חמצני הפונקציונלי של APTES, יש לבודד את הפתרון ב-10,000 ג'י למשך חמש דקות.ואז להסיר את העל-טבעי. עכשיו לשטוף את חרוזים על ידי תיפוף מחדש אותם בשלושה מיליליטר של מתנול טרי. לחץ את הצינור ביד לערבוב, אבל במידת הצורך, לשפר את הפיזור על ידי sonication באמבט מים במשך כמה שניות.צנטריפוגה כמו קודם, ולחזור על שלב לשטוף עוד פעם אחת. ערבבו את חמוזי הסיליקון הדו-חמצני עם שלושה מיליליטר של דימתיל סולפוקסיד, או DMSO. לחץ את התערובת ביד, או במידת הצורך, sonicate במשך כמה שניות עד חרוזים מפוזרים באופן מלא ב- DMSO.לאחר צנטריפוגה לפני, להסיר את על טבעי. חזור על שלב הצנטריפוגה בפעם האחרונה כדי להבטיח חילופי ממסים שלמים ממתנול ל- DMSO. כדי להכין את פתרון PFPA פולי, להמיס 20 מיליגרם של פולי PFPA בשני מיליליטר של DMSO בבקבוקון 20 מיליליטר scintillation.כדי להכין פתרון PEG, להמיס אמין פונקציונלי PEG במיליליטר אחד של DMSO. כעת העבר את פתרון PEG לפתרון פולי PFPA. מגיבים בטמפרטורת החדר במשך שעה עם ערבוב נמרץ.העבר מיליליטר אחד של גם דם דו-חמצני פונקציונלי של APTES המושעה ב-DMSO לתוך פתרון ה-PFPA של פולי PFPA שהוחלף ב-PEG. אפשר השתלה בין פולי PFPA ו APTES פונקציונלי סיליקון דו חמצני חרוזים להמשיך בטמפרטורת החדר במשך שעה אחת עם ערבוב נמרץ. ואז לבודד את חרוזים על ידי צנטריפוגה ב 10, 000 G במשך חמש דקות, ואחריו הסרת העל טבעי.לשטוף את חרוזים על ידי הוספת שלושה מיליליטר של DMSO, ומערבבים ביד או עם כמה שניות של sonication. צנטריפוגה את חרוזים כמו קודם. ולהסיר את supernatant לפני לחזור לשטוף DMSO פעמיים.לשטוף את חרוזים פעמיים נוספות עם שלושה מיליליטר של מים מזוקקים משולשים. ואז לערבב ביד או עם כמה שניות של sonication. צנטריפוגה את חרוזים כמו קודם ולהסיר את supernatant.לבסוף לייבש את חרוזים ב 40 מעלות צלזיוס בתנור ואקום לילה. הוסף חמישה מיליגרם של פולי PFPA מושתל סיליקון דו חמצני גם צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר. לשטוף את חרוזים על ידי הוספת 800 microliters של PBS, ומערבבים היטב על ידי מערבולת.צנטריפוגה את חרוזים ב 10, 000 גרם בטמפרטורת החדר במשך דקה אחת. הסר את העל-טבעי, וחזור על שלב הכביסה שלוש פעמים. עכשיו להוסיף 350 microliters של PBS טרי, 50 microliters של 0.1% PBST, ו 6.67 מיקרוגרם של הנוגדן.דגירה כ 20 שעות על מסובב בארבע מעלות צלזיוס. למחרת, לשטוף את חרוזים צנטריפוגה ב 400 G ו 4 מעלות צלזיוס במשך דקה אחת. לאחר מכן הסר את העל-טבעי והוסף בזהירות 400 מיקרוליטרים של מאגר תיזה.בעדינות resuspend את חרוזים על ידי צינור למעלה ולמטה חמש פעמים. חזור על שלב שטיפה זה שלוש פעמים. לאחר הכביסה הסופית, להסיר כמה שיותר של supernatant ככל האפשר.הכן תאים ומאגר תזה כמתואר בפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן בצע שימוש חוזר בכדור התא עם 400 מיקרוליטרים של מאגר התיזה. Sonicate התאים באמצעות קוליטור אולטרה.לאחר sonication, מערבולת בקצרה. ואז צנטריפוגה lysate ב 20, 000 G בארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. העבר את העל-טבעי לצינור צנטריפוגה חדש באורך 1.5 מיליליטר.כדי לבצע immunoprecipitation, להעביר 300 microliters של ליסס תאים נוגדנים שהוכנו בעבר משותק פולי PFPA מושתל חרוזי סיליקון דו חמצני. שמור על 30 מיקרוליטרים של התא lysate כמו מדגם קלט בצינור microcentrifuge חדש. דגירה תערובת גם גם את תערובת גם גם 100 מעלות צלזיוס במשך שלוש שעות על מסובב ב-4 מעלות צלזיוס.לאחר הדגירה, צנטריפוגה את התערובת ב 400 גרם בארבע מעלות צלזיוס במשך דקה אחת. הסר את העל-טבעי והוסף בזהירות 400 מיקרוליטרים של חיץ שטיפה. בעדינות resuspend את חרוזים על ידי צינור למעלה ולמטה כחמש פעמים.לאחר שלוש שטיפות, להסיר כמה שיותר של supernatant ככל האפשר. הוסף 30 מיקרוליטרים של צבע טעינת SDS 2x לדגימה של הקלט. ואז לחמם אותם במשך 10 דקות ב 95 מעלות צלזיוס.לאחר החימום, לנתח את המדגם באמצעות סופג מערבי, או לאחסן את המדגם במינוס 20 מעלות צלזיוס. קדזי הסיליקה הפונקציונליים נבדקים על ידי ספקטרוסקופיית פוטואלקטרון רנטגן, או XPS, כדי לקבוע את הרכב פני השטח. נתוני XPS מייצגים מוצגים כאן.בעקבות טיפול APTES, שיא חנקן 1s הקשורים לאזור קבוצת אמין APTES מזוהה. לאחר טיפול PFPA פולי, פסגת פלואור 1s הקשורים ליחידות PFP על הפולימר מזוהה. RNA קינאז חלבון מופעל, או העשרת PKR באמצעות immunoprecipitation מבוצעת, ואת דגימת החלבון רמז מנותחים באמצעות סופג מערבי.כצפוי, חרוזים משותקים ללא נוגדנים, או תערובת נוגדנים לא ספציפית מראים שאין התאוששות PKR. חרוזים דגירה עם אנטי PKR יכול להעשיר בהצלחה PKR כפי שצוין על ידי נוכחות של להקת PKR והיעדר הלהקה GAPDH. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור כי בעת השוואת מערכות, ניסויי IP, כמו גם ניתוח סופג המערבי הבאים צריך להיעשות בו זמנית.לאחר התפתחותה, טכניקה זו יכולה לשמש לשתק של מצע ביומולקולרי או חומר שונה. יתר על כן, שיטה זו יש את היתרון הנוסף של כוונון רק רכוש פני השטח כדי להיות מותאם לצרכים של כל יישום.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Preparation of Poly(pentafluorophenyl acrylate) Functionalized SiO2 Beads for Protein Purification

Synthesis and Characterization of Functionalized Metal-organic Frameworks

מסגרות סינתזה ואפיון של פונקציונליות מתכת אורגנית

Metal-organic frameworks have attracted extraordinary amounts of research attention, as they are attractive candidates for numerous industrial and ...

Microbubble Fabrication of Concave-porosity PDMS Beads

ייצור Microbubble של חרוזים PDMS קעור-נקבוביות

Microbubble fabrication (by use of a fine emulsion) provides a means of increasing the surface-area-to-volume (SAV) ratio of polymer materials, which is ...

Immobilization of Multi-biocatalysts in Alginate Beads for Cofactor Regeneration and Improved Reusability

קיבוע של biocatalysts רב בחרוזים אלגינט עבור פקטור רגנרציה Reusability משופר

We have recently developed a simple, reusable and coupled whole-cell biocatalytic system with the capability of cofactor regeneration and biocatalyst ...

Preparation of a Corannulene-functionalized Hexahelicene by Copper(I)-catalyzed Alkyne-azide Cycloaddition of Nonplanar Polyaromatic Units

Preparation of a Corannulene-functionalized Hexahelicene by CopperI-catalyzed Alkyne-azide Cycloaddition of Nonplanar Polyaromatic Units

הכנת Hexahelicene Corannulene הפונקציונלית ידי נחושת (I) -catalyzed אלקין-יזיד cycloaddition יחידות Nonplanar Polyaromatic

The main purpose of this video is to show 6 reaction steps of a convergent synthesis and prepare a complex molecule containing up to three nonplanar ...

The Effect of Interfacial Chemical Bonding in TiO2-SiO2 Composites on Their Photocatalytic NOx Abatement Performance

The Effect of Interfacial Chemical Bonding in TiO2-SiO2 Composites on Their Photocatalytic NOx Abatement Performance

ההשפעה של מליטה כימית interfacial ב TiO<sub&gt; 2</sub&gt; -SiO<sub&gt; 2</sub&gt; מרוכבים על הביצועים שלהם NOX photatalyalytic הפחתה

The chemical bonding of particulate photocatalysts to supporting material surfaces is of great importance in engineering more efficient and practical ...

Methionine Functionalized Biocompatible Block Copolymers for Targeted Plasmid DNA Delivery

מתיונין מתפקד ביולוגית ביויוננים בלוק תואם למשלוח דנ א ממוקד

Reversible addition-fragmentation chain transfer (RAFT) polymerization integrates the advantages of radical polymerization and living polymerization. This ...

Efficient Synthesis of All-Carbon Quaternary Centers via the Conjugate Addition of Functionalized Monoorganozinc Bromides

סינתזה יעילה של מרכזי הפחמן הדו הדו באמצעות התוספת המשלים של מונואורגאורומטוזיס

The conjugate addition of organometallic reagents to &#945;,&#946;-unsaturated carbonyls represents an important method to generate C&#8211;C bonds in the ...

Organic Solvent-Based Protein Precipitation for Robust Proteome Purification Ahead of Mass Spectrometry

משקעי חלבון אורגניים מבוססי ממסים לטיהור פרוטאום חזק לפני ספקטרומטריית מסה

While multiple advances in mass spectrometry (MS) instruments have improved qualitative and quantitative proteome analysis, more reliable front-end ...

Porphyrin-Modified Beads in Flow Cytometry

Porphyrin-Modified Beads for Use as Compensation Controls in Flow Cytometry

Porphyrin-Modified Beads for Use as Compensation Controls in Flow Cytometry (Video) | JoVE 

חרוזים מהונדסים בפורפירין לשימוש כבקרות פיצוי בציטומטריית זרימה

Flow cytometry can rapidly characterize and quantify diverse cell populations based on fluorescence measurements. The cells are first stained with one or ...