Name: preparation of poly(pentafluorophenyl acrylate) functionalized sio2 beads for protein purification
Uploaded: 2018-11-19T14:00:00
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1. Poly(PFPA) ホモポリマーの準備
<ol><li>AIBN の再結晶<ol>
<li>250 mL のビーカーにメタノール 25 ml 2,2'-azobis(2-methylpropionitrile) (AIBN) の 5 g を組み合わせます。60 ° C のオイルバスでビーカーに没頭し、精力的に AIBN は完全に溶解するまで攪拌棒との混合物をかき混ぜます。</li>
		<li>ろ紙 (5-8 μ m 粒子保持) を通じて暖かいソリューションをフィルター処理し、ゆっくりと結晶の形成を許可する 4 ° C で?...

<ol>
	<li>Johnsson, B., L&#246;f&#229;s, S., Lindquist, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilization+of+proteins+to+a+carboxymethyldextran-modified+gold+surface+for+biospecific+interaction+analysis+in+surface+plasmon+resonance+sensors.">Immobilization of proteins to a carboxymethyldextran-modified gold surface for biospecific interaction analysis in surface plasmon resonance sensors.</a> Analytical Biochemistry. 198 (2), 268-277 (1991).</li><li>Kurzawa, C., Hengstenberg, A., Schuhmann, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilization+method+for+the+preparation+of+biosensors+based+on+pH+shift-induced+deposition+of+biomolecule-containing+polymer+films.">Immobilization method for the preparation of biosensors based on pH shift-induced deposition of biomolecule-containing polymer films.</a> Analytical Chemistry. 74 (2), 355-361 (2002).</li><li>You, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+identification+of+proteins+using+nanoparticle-fluorescent+polymer+'chemical+nose'+sensors.">Detection and identification of proteins using nanoparticle-fluorescent polymer 'chemical nose' sensors.</a> Nature Nanotechnology. 2 (5), 318-323 (2007).</li><li>Roberts, M. W., Ongkudon, C. M., Forde, G. M., Danquah, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatility+of+polymethacrylate+monoliths+for+chromatographic+purification+of+biomolecules.">Versatility of polymethacrylate monoliths for chromatographic purification of biomolecules.</a> Journal of Separation Science. 32 (15-16), 2485-2494 (2009).</li><li>Sandison, M. E., Cumming, S. A., Kolch, W., Pitt, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On-chip+immunoprecipitation+for+protein+purification.">On-chip immunoprecipitation for protein purification.</a> Lab on a Chip. 10 (20), 2805-2813 (2010).</li><li>Das, A., Theato, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activated+Ester+Containing+Polymers:+Opportunities+and+Challenges+for+the+Design+of+Functional+Macromolecules.">Activated Ester Containing Polymers: Opportunities and Challenges for the Design of Functional Macromolecules.</a> Chemical Reviews. 116 (3), 1434-1495 (2016).</li><li>Choi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functionalization+and+patterning+of+reactive+polymer+brushes+based+on+surface+reversible+addition+and+fragmentation+chain+transfer+polymerization.">Functionalization and patterning of reactive polymer brushes based on surface reversible addition and fragmentation chain transfer polymerization.</a> Journal of Polymer Science Part A: Polymer Chemistry. 50 (19), 4010-4018 (2012).</li><li>Kessler, D., Jochum, F. D., Choi, J., Char, K., Theato, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+surface+coatings+based+on+polysilsesquioxanes:+universal+method+toward+light-responsive+surfaces.">Reactive surface coatings based on polysilsesquioxanes: universal method toward light-responsive surfaces.</a> ACS Applied Materials &amp; Interfaces. 3 (2), 124-128 (2011).</li><li>Son, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Penetration+and+exchange+kinetics+of+primary+alkyl+amines+applied+to+reactive+poly(pentafluorophenyl+acrylate)+thin+films.">Penetration and exchange kinetics of primary alkyl amines applied to reactive poly(pentafluorophenyl acrylate) thin films.</a> Polymer Journal. 48 (4), 487-495 (2016).</li><li>Kessler, D., Roth, P. J., Theato, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+surface+coatings+based+on+polysilsesquioxanes:+controlled+functionalization+for+specific+protein+immobilization.">Reactive surface coatings based on polysilsesquioxanes: controlled functionalization for specific protein immobilization.</a> Langmuir. 25 (17), 10068-10076 (2009).</li><li>Kessler, D., Theato, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+surface+coatings+based+on+polysilsesquioxanes:+defined+adjustment+of+surface+wettability.">Reactive surface coatings based on polysilsesquioxanes: defined adjustment of surface wettability.</a> Langmuir. 25 (24), 14200-14206 (2009).</li><li>Kessler, D., Nilles, K., Theato, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modular+approach+towards+multi-functional+surfaces+with+adjustable+and+dual-responsive+wettability+using+a+hybrid+polymer+toolbox.">Modular approach towards multi-functional surfaces with adjustable and dual-responsive wettability using a hybrid polymer toolbox.</a> Journal of Materials Chemistry. 19 (43), 8184-8189 (2009).</li><li>Eberhardt, M., Mruk, R., Zentel, R., Theato, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+pentafluorophenyl(meth)acrylate+polymers:+new+precursor+polymers+for+the+synthesis+of+multifunctional+materials.">Synthesis of pentafluorophenyl(meth)acrylate polymers: new precursor polymers for the synthesis of multifunctional materials.</a> European Polymer Journal. 41 (7), 1569-1575 (2005).</li><li>Jochum, F. D., Forst, F. R., Theato, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PNIPAM+copolymers+containing+light-responsive+chromophores:+a+method+toward+molecular+logic+gates.">PNIPAM copolymers containing light-responsive chromophores: a method toward molecular logic gates.</a> Macromolecular Rapid Communications. 31 (16), 1456-1461 (2010).</li><li>Schattling, P., Pollmann, I., Theato, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+CO2-responsive+polymers+by+post-polymerization+modification.">Synthesis of CO2-responsive polymers by post-polymerization modification.</a> Reactive &amp; Functional Polymers. 75, 16-21 (2014).</li><li>He, L., Szameit, K., Zhao, H., Hahn, U., Theato, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postpolymerization+modification+using+less+cytotoxic+activated+ester+polymers+for+the+synthesis+of+biological+active+polymers.">Postpolymerization modification using less cytotoxic activated ester polymers for the synthesis of biological active polymers.</a> Biomacromolecules. 15 (8), 3197-3205 (2014).</li><li>Arnold, R. M., McNitt, C. D., Popik, V. V., Locklin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+grafting+of+poly(pentafluorophenyl+acrylate)+onto+oxides:+versatile+substrates+for+reactive+microcapillary+printing+and+self-sorting+modification.">Direct grafting of poly(pentafluorophenyl acrylate) onto oxides: versatile substrates for reactive microcapillary printing and self-sorting modification.</a> Chemical Communications. 50 (40), 5307-5309 (2014).</li><li>Son, H., Ku, J., Kim, Y., Li, S., Char, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amine-Reactive+Poly(pentafluorophenyl+acrylate)+Brush+Platforms+for+Cleaner+Protein+Purification.">Amine-Reactive Poly(pentafluorophenyl acrylate) Brush Platforms for Cleaner Protein Purification.</a> Biomacromolecules. 19 (3), 951-961 (2018).</li><li>Cullen, S. E., Schwartz, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+for+isolation+of+H-2+and+Ia+alloantigens+with+immunoprecipitation+induced+by+protein+A-bearing+staphylococci.">An improved method for isolation of H-2 and Ia alloantigens with immunoprecipitation induced by protein A-bearing staphylococci.</a> The Journal of Immunology. 117 (1), 136-142 (1976).</li><li>Sisson, T. H., Castor, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+for+immobilizing+IgG+antibodies+on+protein+A-agarose.">An improved method for immobilizing IgG antibodies on protein A-agarose.</a> Journal of Immunology Methods. 127 (2), 215-220 (1990).</li><li>Peritz, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoprecipitation+of+mRNA-protein+complexes.">Immunoprecipitation of mRNA-protein complexes.</a> Nature Protocols. 1 (2), 577-580 (2006).</li><li>Zhang, Z., Chen, S., Jiang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual-functional+biomimetic+materials:+nonfouling+poly+(carboxybetaine)+with+active+functional+groups+for+protein+immobilization.">Dual-functional biomimetic materials: nonfouling poly (carboxybetaine) with active functional groups for protein immobilization.</a> Biomacromolecules. 7 (12), 3311-3315 (2006).</li><li>Yao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NHS-ester+functionalized+poly(PEGMA)+brushes+on+silicon+surface+for+covalent+protein+immobilization.">NHS-ester functionalized poly(PEGMA) brushes on silicon surface for covalent protein immobilization.</a> Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 66 (2), 233-239 (2008).</li><li>Ma, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Facile+fabrication+of+microsphere-polymer+brush+hierarchically+three-dimensional+(3D)+substrates+for+immunoassays.">Facile fabrication of microsphere-polymer brush hierarchically three-dimensional (3D) substrates for immunoassays.</a> Chemical Communications. 51 (31), 6749-6752 (2015).</li><li>Chong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thiocarbonylthio+compounds+[SC+(Ph)+S&#8722;+R]+in+free+radical+polymerization+with+reversible+addition-fragmentation+chain+transfer+(RAFT+Polymerization).+Role+of+the+free-radical+leaving+group+(R).">Thiocarbonylthio compounds [SC (Ph) S&#8722; R] in free radical polymerization with reversible addition-fragmentation chain transfer (RAFT Polymerization). Role of the free-radical leaving group (R).</a> Macromolecules. 36 (7), 2256-2272 (2003).</li><li>Jochum, F. D., Theato, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature-+and+Light-Responsive+Polyacrylamides+Prepared+by+a+Double+Polymer+Analogous+Reaction+of+Activated+Ester+Polymers.">Temperature- and Light-Responsive Polyacrylamides Prepared by a Double Polymer Analogous Reaction of Activated Ester Polymers.</a> Macromolecules. 42 (16), 5941-5945 (2009).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+The+Western+Blot.">Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot.</a> JoVE. , (2018).</li><li>Chua, G. B. H., Roth, P. J., Duong, H. T. T., Davis, T. P., Lowe, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+Thermoresponsive+Solution+Properties+of+Poly[oligo(ethylene+glycol)+(meth)acrylamide]s:+Biocompatible+PEG+Analogues.">Synthesis and Thermoresponsive Solution Properties of Poly[oligo(ethylene glycol) (meth)acrylamide]s: Biocompatible PEG Analogues.</a> Macromolecules. 45 (3), 1362-1374 (2012).</li></ol>

Poly(PFPA) の合成は接ぎ木 SiO2ビーズは図 1に示します。リンカー分子として APTES を採用し、単純な 2 段階のプロセスを介して SiO2基板に移植した poly(PFPA) ブラシを用意できます。PFP の単位のいくつかが APTES との反応を犠牲に、多数の PFP ユニットがアミノ ペグまたは抗体のいずれかで後の反応に利用可能なままと予想します。PFP グループは、poly(PFPA) ブ?...

反応性ポリマー ブラシは、近年多くの関心を受けています。検出と分離1,2,3,4などの分野でのアプリケーションと非アクティブなサーフェスを作成する有機又は無機の物質に機能分子を固定化する使用することができます。 5。報告された反応性高分子の中でペンタフルオロフェニル エステル単位を含む、アミンと加水分解6に向けて耐反応性が高いため特に便利です。1 つのようなポリマーは poly(PFPA) と、それはプライマリまたはセカンダリのアミン7,8,9,10を含む分子と容易に官能の後重合をすることができます。1 つの例で、poly(PFPA) ブラシした光応答性表面7を作成するアミノ スピロピランと反応しました。
Poly(PFPA) とその応用の準備は前出版物6,7,8,9,10、11,12 の番号に記載されています。 ,13,14,15,16,17。特に、Theato と同僚は報告「移植」と""方法7,8,10、11,12から移植の両方を介して poly(PFPA) ブラシの合成.「接木する」アプローチは、ポリ (メチルシルセスキオキサン) の-ポリ (アクリル酸ペンタフルオロフェニル) (poly(MSSQ-PFPA)) ハイブリッド ・ ポリマーは合成8,10、11,12。Poly(MSSQ) コンポーネントはフォーム数材料表面上ブラシ層を形成するコンポーネントの poly(PFPA) をように別の有機・無機表面と密着できた。「接木から」アプローチ、表面は可逆的付加を開始され、断片化チェーン転送 (SI ・ ラフト) 重合を用いて poly(PFPA) ブラシ7を準備します。この場合、表面固定化連鎖移動剤 (SI CTA) 最初共有についたシリカ シラン反応による基板。固定化 SI CTA は、基板に安定した共有結合のリンケージを持つ密集 poly(PFPA) ブラシを生成する PFPA モノマーの SI ・ ラフト重合し参加しました。
SI ・ ラフト重合により合成した poly(PFPA) ブラシを活用し、最近移植 poly(PFPA) シリカ粒子やタンパク質精製18で、後続のアプリケーションにおける抗体の固定化を示した。IP で現在の蛋白質の分離に関連する問題の数を解決する抗体固定化のための poly(PFPA) ブラシの使用が見つかりました。従来の IP は、抗体固定化19,20,21のタンパク質 A/G リンカーとしての使用に依存します。タンパク質 A/G の特定の方向で接続する抗体を使用、高いターゲット抗原回復効率が達成されました。ただし、タンパク質 A/G の使用苦しんでいる抗体の損失と同様、非特異的タンパク質間相互作用タンパク質の回収、どちらもはバック グラウンド ノイズの高レベルに貢献中。これらの欠点を解決するには、しっかりサポートする抗体の直接架橋検討22,23,24をされています。このような技術の効率は架橋抗体のランダムな向きがあるため通常は低くなります。接木 poly(PFPA) 基板の抗体の固定化は永久、PFP ユニットと抗体のアミン機能間の交換反応によって達成されます。抗体の向きはまだランダムが、システム多く反応 PFP サイト、重合度によって制御を持っていることから寄与します。さらに、我々 はアミノ止め釘と PFP 単位の部分的な置換によることを示した表面親水性調整できるさらにシステム18のタンパク質回収効率を向上します。全体的にみて、多くのクリーナーの背景と同様、合理的な効率で従来の IP へ有効な代わりをする接木 poly(PFPA) シリカ粒子が示されていた。
この貢献抗体固定化と IP アプリケーションを poly(PFPA) グラフト表面を準備する方法を報告する.単純な 2 段階のプロセスで図 1に示すように、APTES のリンカー分子最初に到着したシリカ表面にし、poly(PFPA) 高分子に PFP ユニット間反応によってリンカー分子に接続した、ポリマーと APTES のアミン機能。本調製法は基板表面に poly(PFPA) の永久的な架橋が可能が SI CTA 合成と poly(PFPA) ブラシの SI ・ ラフト重合に関連する多くの合併症を回避します。アミノ ペグの PFP ユニットの部分置換実行できますが、ポリマー ブラシ表面特性の微調整可能します。従って準備 poly(PFPA) 接木シリカビーズを抗体を固定化して IP を介したタンパク質の濃縮に使用できますを示します。詳細なビード作製手順、抗体固定化と IP テストは、この資料に記載されて、読者を求めて興味従来タンパク質 A/G に代わるベースの IP。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2,2-Azobisisobutyronitrile, 99%</td>
			<td>Daejung Chemicals</td>
			<td>1102-4405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl alcohol for HPLC, 99.9%</td>
			<td>Duksan Pure Chemicals</td>
			<td>d62</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmagnesium bromide solution 1.0&#160;M in THF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>331376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon disulfide anhydrous, &#8805;99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>335266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzyl bromide, 98%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B17905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petroleum ether, 90%</td>
			<td>Samchun Chemicals</td>
			<td>P0220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl ether, 99%</td>
			<td>Daejung Chemicals</td>
			<td>4025-4404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate anhydrous, powder,&#160;99%</td>
			<td>Daejung Chemicals</td>
			<td>5514-4405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentafluorophenyl acrylate</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-264001</td>
			<td>contains inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium oxide, activated, basic, Brockmann I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>199443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Daejung Chemicals</td>
			<td>7548-4400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anisole anhydrous, 99.7%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>296295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica nanoparticle</td>
			<td>Microparticles GmbH</td>
			<td>SiO2-R-0.7</td>
			<td>5% w/v aqueous suspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Aminopropyltrimethoxysilane, &#62;96.0%</td>
			<td>Tokyo Chemical Industry</td>
			<td>T1255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide for HPLC, &#8805;99.7%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34869</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amino-terminated poly(ethylene glycol) methyl ether</td>
			<td>Polymer Source</td>
			<td>P16082-EGOCH3NH2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline tablet</td>
			<td>Takara</td>
			<td>T9181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>9480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl (pH 8.0)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9855G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9640G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40</td>
			<td>VWR</td>
			<td>E109-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15514-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Biosesang</td>
			<td>D1037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor</td>
			<td>Merck</td>
			<td>535140-1MLCN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromo phenol blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B5525-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl (pH 6.8)</td>
			<td>Biosolution</td>
			<td>BT033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Biosolution</td>
			<td>BS003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21985-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PKR Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>12297S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH Antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-32233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Rabbit IgG</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>2729S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa</td>
			<td>Korea Cell Line Bank</td>
			<td>10002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>DAIHAN Scientific</td>
			<td>WUC-D10H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonicator</td>
			<td>BMBio</td>
			<td>BR2006A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge I</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge II</td>
			<td>LABOGENE</td>
			<td>1736R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator</td>
			<td>FINEPCR</td>
			<td>ROTATOR/AG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum oven</td>
			<td>DAIHAN Scientific</td>
			<td>ThermoStable OV-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel permeation chromatography (THF)</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>1260 Infinity II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-ray photoelectron spectrometer</td>
			<td>Thermo VG Scientific</td>
			<td>Sigma Probe</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynamic light scattering</td>
			<td>Malvern Instruments</td>
			<td>ZEN 3690</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of poly(pentafluorophenyl acrylate) functionalized sio2 beads for protein purification

ポリ (アクリル酸ペンタフルオロフェニル) を準備する簡単な方法を示す (poly(PFPA)) は、抗体の固定化とそれに続く免疫沈降 (IP) アプリケーションのシリカビーズを移植しました。Poly(PFPA) グラフト表面は、単純な 2 段階のプロセスを介して用意しています。最初のステップで 3-アミノプロピルトリエトキシシラン (APTES) は、シリカ表面にリンカー分子として預けられます。2 番目のステップでペンタフルオロフェニル (PFP) 単位間の交換反応によってリンカー分子に可逆的付加と断片化チェーン転送 (いかだ) 重合により合成した poly(PFPA) ホモポリマーを移植で、ポリマーと APTES のアミン グループ。APTES とシリカ粒子は x 線光電子分光法 (XPS) により確認し同様、粒子サイズの変更によって監視 poly(PFPA) の沈着は、動的光散乱 (DLS) を介して測定。ビーズ、アミン官能基化 poly(ethylene glycol) と poly(PFPA) の一部代替の表面の親水性を向上させる (アミノ PEG) が行われます。ペグ-置換 poly(PFPA) は、ビーズが IP アプリケーションのための抗体を固定化し、シリカを移植しました。デモで、タンパク質キナーゼ (PKR) rna 抗体を採用、IP 効率は西部にしみが付くことによって決定されます。分析の結果, 抗体固定化ビーズを無指定蛋白質の相互作用は最小限、PKR を豊かに使用確かにできます。

Poly(PFPA) の準備のための回路図と SiO2ビーズおよびペグなし置換は図 1に示します。APTES と poly(PFPA) プロセス、裸の SiO2ビーズを移植を監視する APTES 機能 SiO2ビーズと poly(PFPA) 接木 SiO2ビーズは DLS (図 2) と XPS (図 3) によって特徴付けられます。ビーズの IP 効率は西部に?...

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Preparation of Polypentafluorophenyl acrylate Functionalized SiO2 Beads for Protein Purification

ポリ (アクリル酸ペンタフルオロフェニル) の準備のためのプロトコル (poly(PFPA)) 接木シリカビーズを提示。Poly(PFPA) 機能性表面は抗体を固定化し、正常に免疫沈降法による蛋白質の分離のために使用します。

蛋白質の浄化のため Poly(pentafluorophenyl acrylate) 機能 SiO2ビーズの準備

We demonstrate a simple method to prepare poly(pentafluorophenyl acrylate) (poly(PFPA)) grafted silica beads for antibody immobilization and subsequent ...

この方法は、薬物送達、生物学的標的検出、および生体分離などの分野での用途を有する生体分子活性化表面を調製するために使用することができる。この技術の主な利点は、ポリPFPAブラシがアミンと反応性が高く、抗体の固定化が数時間のバッファー溶液中のインキュベーションによって達成される点である。この技術の意味は、固定化抗体が標的抗原と正常に結合することができるため、免疫精製を通じてタンパク質精製に向けて広がっています。この方法は抗体の動員とタンパク質精製のために実証されるが、生体分子動員を必要とする他のシステムにも適用することができる。二酸化ケイ素ビーズをAPTESで処理するために、まず5%重量体積水性懸濁液の形で二酸化ケイ素粒子を得る。0.8ミリリットルの二酸化ケイ素懸濁液を40ミリグラムのAPTESと組み合わせ、8ミリリットルのメタノールを20ミリリットルのシンチレーションバイアルに組み合わせます。激しい攪拌を行い、室温で5時間反応を進行させます。5時間後、溶液を円錐管に移します。APTESの機能性シリコーン二酸化ビーズを分離するために、溶液を10,000 Gで5分間遠心分離する。その後、上清を取り除く。今、新鮮なメタノールの3ミリリットルでそれらをやりくりすることによってビーズを洗います。混合するために手でチューブを振るが、必要に応じて、数秒間水浴中の超音波処理によって分散を改善します。前と同様に遠心分離機、洗浄工程をもう一度繰り返す。メタノール洗浄二酸化シリコーンビーズと3ミリリットルのジメチルスルホキシド(DMSO)を組み合わせます。混合物を手で振るか、必要に応じて、ビーズがDMSOに完全に分散するまで数秒間超音波処理します。前に遠心分離に続いて、上清を取り除く。メタノールからDMSOへの完全な溶媒交換を確実にするために、最後の時間に遠心分離ステップを繰り返します。ポリPFPA溶液を調製するために、20ミリリットルのシンチレーションバイアルで2ミリリットルのDMSOにポリPFPAの20ミリグラムを溶解する。PEG溶液を調製するために、アミン機能化PEGをDMSOの1ミリリットルに溶解する。次に、PEG 溶液をポリ PFPA 溶液に転送します。激しい攪拌で室温で1時間反応させます。DMSOに懸濁したAPTESの機能性二酸化ケイ素ビーズをPEG置換ポリPFPA溶液に1ミリリットル移動します。ポリPFPAとAPTESの機能性二酸化ケイ素ビーズの間のグラフトを、激しい攪拌で室温で1時間進めます。その後、10,000Gで10,000Gで遠心分離してビーズを5分間分離し、続いて上清を除去する。DMSOの3ミリリットルを加えてビーズを洗い、手で、または数秒の超音波処理で混ぜます。以前のようにビーズを遠心分離します。そして、DMSO洗浄を2回繰り返す前に上清を取り除きます。3ミリリットルの三重蒸留水でさらにビーズを洗います。その後、手で、または超音波処理の数秒でミックス。前のようにビーズを遠心分離し、上清を取り除きます。最後に、一晩真空オーブンで40°Cでビーズを乾燥させます。1.5ミリリットルマイクロ遠心分離チューブにポリPFPA接ぎ木二酸化ケイ素ビーズを5ミリグラム加えます。800マイクロリットルのPBSを加えてビーズを洗い、渦をよく混ぜます。室温で10,000Gでビーズを1分間遠心する。上清を取り出し、洗浄工程を3回繰り返します。次に、新鮮なPBSの350マイクロリットル、0.1%PBSTの50マイクロリットル、および抗体の6.67マイクログラムを追加します。摂氏4度で回転器に約20時間インキュベートします。翌日、ビーズと遠心分離機を400Gと摂氏4度で1分間洗います。その後、上清を取り除き、慎重に400マイクロリットルのライシスバッファーを追加します。ビーズを上下に5回ピペットしてそっと再中断します。この洗浄を3回繰り返します。最後の洗浄後、できるだけ多くの上清を取り除きます。テキストプロトコルに記載されているように、細胞およびリシスバッファーを準備します。次に、細胞ペレットを400マイクロリットルのリシスバッファーで再懸濁する。超超音波処理器を使用して細胞を超音波処理します。超音波処理の後、簡単に渦。その後、摂氏4度で20,000Gのリセートを10分間遠心分離する。上清を新しい1.5ミリリットルの遠心管に移します。免疫沈降を行うために、300マイクロリットルの細胞ライセートを、あらかじめ調製したポリPFPA移植二酸化ケイ素ビーズを固定化した抗体に移す。30マイクロリットルの細胞ライセートを入力サンプルとして新しいマイクロ遠心分離チューブに保持します。リゼートビーズ混合物を摂氏4度で回転器で3時間インキュベートします。インキュベーションに続き、400Gで1分間摂氏4度で遠心分離する。上清を取り除き、400マイクロリットルの洗浄バッファーを慎重に加えます。ビーズを上下に約5回ピペットして静かに再中断します。3回の打ち上がりの後、できるだけ多くの上清を取り除く。ビーズと入力サンプルに2x SDS負荷染料の30マイクロリットルを追加します。その後、摂氏95度で10分間加熱します。加熱後、ウェスタンブロッティングを使用してサンプルを分析するか、マイナス20°Cで保存します。機能化されたシリカビーズをX線光電子分光法(XPS)で調べ、表面組成を決定する。代表的な XPS データをここに示します。APTES処理後、アミン群領域APTESに関連する窒素1sピークが検出される。ポリPFPA処理の後、ポリマー上のPFP単位に関連するフッ素1sピークが検出される。タンパク質キナーゼRNA活性化、または免疫沈降によるPKR濃縮が行われ、ウェスタンブロッティングを用いて抽出したタンパク質サンプルを分析する。予想通り、抗体を使用しないビーズ、または非特異的抗体混合法はPKR回復を示さない。アンチPKRでインキュベートされたビーズは、PKRバンドの存在とGAPDHバンドの不在によって示されるようにPKRをうまく濃縮することができます。この手順を試みる際には、システムを比較する際には、IP実験とそれに続くウェスタンブロッティング解析を同時に行う必要があることを覚えておくことが重要です。その開発後、この技術は、異なる生体分子または材料基質の固定化に使用することができる。さらに、この方法には、各アプリケーションのニーズに合わせて調整されるサーフェスプロパティのみを調整するという追加の利点があります。

Research

JoVE Journal

Chemistry

Preparation of Poly(pentafluorophenyl acrylate) Functionalized SiO2 Beads for Protein Purification

Synthesis and Characterization of Functionalized Metal-organic Frameworks

官能化有機金属構造体の合成とキャラクタリゼーション

Metal-organic frameworks have attracted extraordinary amounts of research attention, as they are attractive candidates for numerous industrial and ...

Microbubble Fabrication of Concave-porosity PDMS Beads

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補因子再生と改善された再利用のためのアルギン酸ビーズでマルチ生体触媒の固定化

We have recently developed a simple, reusable and coupled whole-cell biocatalytic system with the capability of cofactor regeneration and biocatalyst ...

Preparation of a Corannulene-functionalized Hexahelicene by Copper(I)-catalyzed Alkyne-azide Cycloaddition of Nonplanar Polyaromatic Units

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銅（I）によるコランニュレン官能Hexaheliceneの調製は、非平面多環芳香族ユニットのアルキンアジド付加環を - 触媒

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The Effect of Interfacial Chemical Bonding in TiO2-SiO2 Composites on Their Photocatalytic NOx Abatement Performance

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TiOにおける界面化学結合の影響<sub&gt; 2</sub&gt; -SiO<sub&gt; 2</sub&gt;光触媒NOx低減性能に関する複合材料

The chemical bonding of particulate photocatalysts to supporting material surfaces is of great importance in engineering more efficient and practical ...

Methionine Functionalized Biocompatible Block Copolymers for Targeted Plasmid DNA Delivery

標的プラスミドDNA送達に対するメチオニン機能性生体適合性共重合体

Reversible addition-fragmentation chain transfer (RAFT) polymerization integrates the advantages of radical polymerization and living polymerization. This ...

Efficient Synthesis of All-Carbon Quaternary Centers via the Conjugate Addition of Functionalized Monoorganozinc Bromides

官能化 Monoorganozinc 臭化物の共役添加による全炭素4級センターの効率的な合成

The conjugate addition of organometallic reagents to &#945;,&#946;-unsaturated carbonyls represents an important method to generate C&#8211;C bonds in the ...

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質量分析に先立つ堅牢なプロテオーム精製のための有機溶媒ベースのタンパク質沈殿

While multiple advances in mass spectrometry (MS) instruments have improved qualitative and quantitative proteome analysis, more reliable front-end ...

Porphyrin-Modified Beads in Flow Cytometry

Porphyrin-Modified Beads for Use as Compensation Controls in Flow Cytometry

Porphyrin-Modified Beads for Use as Compensation Controls in Flow Cytometry (Video) | JoVE 

フローサイトメトリーの補正コントロールとして使用するポルフィリン修飾ビーズ

Flow cytometry can rapidly characterize and quantify diverse cell populations based on fluorescence measurements. The cells are first stained with one or ...