Name: preparation of poly(pentafluorophenyl acrylate) functionalized sio2 beads for protein purification
Uploaded: 2018-11-19T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Polypentafluorophenyl acrylate Functionalized SiO2 Beads for Protein Purification at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av byrået for Defense utvikling (Grant nr. UD170039ID).

1. forberedelse av Poly(PFPA) Homopolymer
<ol><li>Recrystallization av SHTS<ol>
<li>Kombiner 5 g av 2,2'-azobis(2-methylpropionitrile) (SHTS) med 25 mL av metanol i en 250 mL kanne. Fordype begeret i en 60 ° C olje bad og kraftig rør blandingen med en røre bar til SHTS er fullstendig oppløst.</li>
		<li>Filtrere varm løsningen gjennom filter papir (5-8 μm partikkel oppbevaring) og lagre filtratet på 4 ° C tillate krystaller form sakte.</li>
		<li>Samle inn den recrystallized SHTS ved filtrering. Kombiner samlet...

<ol>
	<li>Johnsson, B., L&#246;f&#229;s, S., Lindquist, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilization+of+proteins+to+a+carboxymethyldextran-modified+gold+surface+for+biospecific+interaction+analysis+in+surface+plasmon+resonance+sensors.">Immobilization of proteins to a carboxymethyldextran-modified gold surface for biospecific interaction analysis in surface plasmon resonance sensors.</a> Analytical Biochemistry. 198 (2), 268-277 (1991).</li><li>Kurzawa, C., Hengstenberg, A., Schuhmann, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilization+method+for+the+preparation+of+biosensors+based+on+pH+shift-induced+deposition+of+biomolecule-containing+polymer+films.">Immobilization method for the preparation of biosensors based on pH shift-induced deposition of biomolecule-containing polymer films.</a> Analytical Chemistry. 74 (2), 355-361 (2002).</li><li>You, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+identification+of+proteins+using+nanoparticle-fluorescent+polymer+'chemical+nose'+sensors.">Detection and identification of proteins using nanoparticle-fluorescent polymer 'chemical nose' sensors.</a> Nature Nanotechnology. 2 (5), 318-323 (2007).</li><li>Roberts, M. W., Ongkudon, C. M., Forde, G. M., Danquah, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatility+of+polymethacrylate+monoliths+for+chromatographic+purification+of+biomolecules.">Versatility of polymethacrylate monoliths for chromatographic purification of biomolecules.</a> Journal of Separation Science. 32 (15-16), 2485-2494 (2009).</li><li>Sandison, M. E., Cumming, S. A., Kolch, W., Pitt, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On-chip+immunoprecipitation+for+protein+purification.">On-chip immunoprecipitation for protein purification.</a> Lab on a Chip. 10 (20), 2805-2813 (2010).</li><li>Das, A., Theato, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activated+Ester+Containing+Polymers:+Opportunities+and+Challenges+for+the+Design+of+Functional+Macromolecules.">Activated Ester Containing Polymers: Opportunities and Challenges for the Design of Functional Macromolecules.</a> Chemical Reviews. 116 (3), 1434-1495 (2016).</li><li>Choi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functionalization+and+patterning+of+reactive+polymer+brushes+based+on+surface+reversible+addition+and+fragmentation+chain+transfer+polymerization.">Functionalization and patterning of reactive polymer brushes based on surface reversible addition and fragmentation chain transfer polymerization.</a> Journal of Polymer Science Part A: Polymer Chemistry. 50 (19), 4010-4018 (2012).</li><li>Kessler, D., Jochum, F. D., Choi, J., Char, K., Theato, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+surface+coatings+based+on+polysilsesquioxanes:+universal+method+toward+light-responsive+surfaces.">Reactive surface coatings based on polysilsesquioxanes: universal method toward light-responsive surfaces.</a> ACS Applied Materials &amp; Interfaces. 3 (2), 124-128 (2011).</li><li>Son, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Penetration+and+exchange+kinetics+of+primary+alkyl+amines+applied+to+reactive+poly(pentafluorophenyl+acrylate)+thin+films.">Penetration and exchange kinetics of primary alkyl amines applied to reactive poly(pentafluorophenyl acrylate) thin films.</a> Polymer Journal. 48 (4), 487-495 (2016).</li><li>Kessler, D., Roth, P. J., Theato, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+surface+coatings+based+on+polysilsesquioxanes:+controlled+functionalization+for+specific+protein+immobilization.">Reactive surface coatings based on polysilsesquioxanes: controlled functionalization for specific protein immobilization.</a> Langmuir. 25 (17), 10068-10076 (2009).</li><li>Kessler, D., Theato, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+surface+coatings+based+on+polysilsesquioxanes:+defined+adjustment+of+surface+wettability.">Reactive surface coatings based on polysilsesquioxanes: defined adjustment of surface wettability.</a> Langmuir. 25 (24), 14200-14206 (2009).</li><li>Kessler, D., Nilles, K., Theato, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modular+approach+towards+multi-functional+surfaces+with+adjustable+and+dual-responsive+wettability+using+a+hybrid+polymer+toolbox.">Modular approach towards multi-functional surfaces with adjustable and dual-responsive wettability using a hybrid polymer toolbox.</a> Journal of Materials Chemistry. 19 (43), 8184-8189 (2009).</li><li>Eberhardt, M., Mruk, R., Zentel, R., Theato, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+pentafluorophenyl(meth)acrylate+polymers:+new+precursor+polymers+for+the+synthesis+of+multifunctional+materials.">Synthesis of pentafluorophenyl(meth)acrylate polymers: new precursor polymers for the synthesis of multifunctional materials.</a> European Polymer Journal. 41 (7), 1569-1575 (2005).</li><li>Jochum, F. D., Forst, F. R., Theato, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PNIPAM+copolymers+containing+light-responsive+chromophores:+a+method+toward+molecular+logic+gates.">PNIPAM copolymers containing light-responsive chromophores: a method toward molecular logic gates.</a> Macromolecular Rapid Communications. 31 (16), 1456-1461 (2010).</li><li>Schattling, P., Pollmann, I., Theato, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+CO2-responsive+polymers+by+post-polymerization+modification.">Synthesis of CO2-responsive polymers by post-polymerization modification.</a> Reactive &amp; Functional Polymers. 75, 16-21 (2014).</li><li>He, L., Szameit, K., Zhao, H., Hahn, U., Theato, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postpolymerization+modification+using+less+cytotoxic+activated+ester+polymers+for+the+synthesis+of+biological+active+polymers.">Postpolymerization modification using less cytotoxic activated ester polymers for the synthesis of biological active polymers.</a> Biomacromolecules. 15 (8), 3197-3205 (2014).</li><li>Arnold, R. M., McNitt, C. D., Popik, V. V., Locklin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+grafting+of+poly(pentafluorophenyl+acrylate)+onto+oxides:+versatile+substrates+for+reactive+microcapillary+printing+and+self-sorting+modification.">Direct grafting of poly(pentafluorophenyl acrylate) onto oxides: versatile substrates for reactive microcapillary printing and self-sorting modification.</a> Chemical Communications. 50 (40), 5307-5309 (2014).</li><li>Son, H., Ku, J., Kim, Y., Li, S., Char, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amine-Reactive+Poly(pentafluorophenyl+acrylate)+Brush+Platforms+for+Cleaner+Protein+Purification.">Amine-Reactive Poly(pentafluorophenyl acrylate) Brush Platforms for Cleaner Protein Purification.</a> Biomacromolecules. 19 (3), 951-961 (2018).</li><li>Cullen, S. E., Schwartz, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+for+isolation+of+H-2+and+Ia+alloantigens+with+immunoprecipitation+induced+by+protein+A-bearing+staphylococci.">An improved method for isolation of H-2 and Ia alloantigens with immunoprecipitation induced by protein A-bearing staphylococci.</a> The Journal of Immunology. 117 (1), 136-142 (1976).</li><li>Sisson, T. H., Castor, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+for+immobilizing+IgG+antibodies+on+protein+A-agarose.">An improved method for immobilizing IgG antibodies on protein A-agarose.</a> Journal of Immunology Methods. 127 (2), 215-220 (1990).</li><li>Peritz, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoprecipitation+of+mRNA-protein+complexes.">Immunoprecipitation of mRNA-protein complexes.</a> Nature Protocols. 1 (2), 577-580 (2006).</li><li>Zhang, Z., Chen, S., Jiang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual-functional+biomimetic+materials:+nonfouling+poly+(carboxybetaine)+with+active+functional+groups+for+protein+immobilization.">Dual-functional biomimetic materials: nonfouling poly (carboxybetaine) with active functional groups for protein immobilization.</a> Biomacromolecules. 7 (12), 3311-3315 (2006).</li><li>Yao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NHS-ester+functionalized+poly(PEGMA)+brushes+on+silicon+surface+for+covalent+protein+immobilization.">NHS-ester functionalized poly(PEGMA) brushes on silicon surface for covalent protein immobilization.</a> Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 66 (2), 233-239 (2008).</li><li>Ma, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Facile+fabrication+of+microsphere-polymer+brush+hierarchically+three-dimensional+(3D)+substrates+for+immunoassays.">Facile fabrication of microsphere-polymer brush hierarchically three-dimensional (3D) substrates for immunoassays.</a> Chemical Communications. 51 (31), 6749-6752 (2015).</li><li>Chong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thiocarbonylthio+compounds+[SC+(Ph)+S&#8722;+R]+in+free+radical+polymerization+with+reversible+addition-fragmentation+chain+transfer+(RAFT+Polymerization).+Role+of+the+free-radical+leaving+group+(R).">Thiocarbonylthio compounds [SC (Ph) S&#8722; R] in free radical polymerization with reversible addition-fragmentation chain transfer (RAFT Polymerization). Role of the free-radical leaving group (R).</a> Macromolecules. 36 (7), 2256-2272 (2003).</li><li>Jochum, F. D., Theato, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature-+and+Light-Responsive+Polyacrylamides+Prepared+by+a+Double+Polymer+Analogous+Reaction+of+Activated+Ester+Polymers.">Temperature- and Light-Responsive Polyacrylamides Prepared by a Double Polymer Analogous Reaction of Activated Ester Polymers.</a> Macromolecules. 42 (16), 5941-5945 (2009).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+The+Western+Blot.">Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot.</a> JoVE. , (2018).</li><li>Chua, G. B. H., Roth, P. J., Duong, H. T. T., Davis, T. P., Lowe, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+Thermoresponsive+Solution+Properties+of+Poly[oligo(ethylene+glycol)+(meth)acrylamide]s:+Biocompatible+PEG+Analogues.">Synthesis and Thermoresponsive Solution Properties of Poly[oligo(ethylene glycol) (meth)acrylamide]s: Biocompatible PEG Analogues.</a> Macromolecules. 45 (3), 1362-1374 (2012).</li></ol>

Syntese av poly(PFPA) podet SiO2 perler er illustrert i figur 1. Ved å bruke APTES som et koblingsfunksjonalitet molekyl, kan poly(PFPA) børster covalently podet til SiO2 underlaget tilberedes via en enkel prosess. Selv om noen av PFP enhetene er ofret for reaksjon med APTES, er et stort antall PFP enhetene forventet å være tilgjengelig for senere reaksjon med amino-pinne eller antistoffer. PFP-grupper er kjent til lav energi overflater poly(PFPA) børster gjøre ik...

Reaktiv polymer børster har mottatt stor interesse i de senere år. De kan brukes til nakkens funksjonelle molekyler på organisk eller uorganisk materiale å lage aktivert overflater med programmer innenfor områder som gjenkjenning og separasjon1,2,3,4, 5. Blant de reaktive polymerer rapportert, er som inneholder pentafluorophenyl ester enheter spesielt nyttig på grunn av deres høye kryssreaksjon med aminer og motstand mot hydrolyse6. En slik polymer er poly(PFPA), og det kan være lett functionalized etter polymerisasjon med molekyler som inneholder primære eller sekundære aminer7,8,9,10. I ett eksempel var poly(PFPA) børster reagert med amino-spiropyrans å lage lys svarer overflatene7.
Utarbeidelse av poly(PFPA) og tilhørende programmer er beskrevet i flere tidligere publikasjoner6,7,8,9,10,11,12 ,,13,,14,,15,,16,,17. Spesielt rapporterte Theato og medarbeidere syntese av poly(PFPA) børster via både "pode til" og "pode fra" metoder7,8,10,11,12 . I den "pode å" tilnærming, en poly (methylsilsesquioxane)-poly (pentafluorophenyl acrylate) (poly(MSSQ-PFPA)) hybrid polymer ble syntetisert8,10,11,12. Komponenten poly(MSSQ) kunne skjemaet sterk vedheft med en rekke ulike organiske og uorganiske overflater, slik at poly(PFPA) komponenten til en pensel laget på bestrøket materialoverflaten. I den "pode fra" tilnærming, overflate initiert reversibel tillegg og fragmentering kjeden overføring (SI-FLÅTEN) polymerisasjon var ansatt å forberede poly(PFPA) børster7. I dette tilfellet ble en overflate immobilisert kjeden forflytning agent (SI-CTA) først covalently knyttet til underlaget via silika-silane reaksjon. Immobilisert SI-CTA deltok i SI-FLÅTEN polymerisasjon av PFPA monomerer, genererer tettpakkede poly(PFPA) børster stabil kovalente kobling til underlaget.
Ved å benytte poly(PFPA) børster syntetisert via SI-FLÅTEN polymerisasjon, viste vi nylig immobilisering av antistoffer poly(PFPA) podet silika partikler og deres anvendelse i protein rensing18. Bruk av poly(PFPA) børster for antistoff immobilisering fant for å løse mange problemer forbundet med dagens protein skille gjennom IP. Konvensjonelle IP er avhengig av bruken av Protein A/G som et linker for antistoff immobilisering19,20,21. Siden bruken av Protein A/G kan antistoffer skal festes i en bestemt retning, er høye målet antigen utvinning effektivitet oppnådd. Men lider bruk av Protein A/G av ikke-spesifikk protein samhandling samt tap av antistoffer under protein utvinning, begge bidrar til høy bakgrunnsstøy. Du kan løse disse svakhetene ved har direkte crosslinking av antistoffer mot en solid støtte vært utforsket22,23,24. Effektiviteten av slike teknikker er vanligvis lav på grunn av tilfeldig orienteringen av krysskoblet antistoffer. Av poly(PFPA) podet underlaget er immobilisering av antistoffer permanent, oppnådd gjennom exchange reaksjon mellom PFP enheter og Amin funksjonaliteten på antistoffer. Selv om antistoff retningen er fortsatt tilfeldig, fordeler systemet av å ha mange reaktive PFP områder, kontrollerbar av graden av polymerisasjon. Videre vi viste at ved delvis substitusjon av PFP enheter med amino-pinne, overflate hydrophilicity stilles, ytterligere forbedre protein utvinning effektiviteten av systemet18. Samlet ble poly(PFPA) podet silika partikler vist å være et effektivt alternativ til tradisjonelle IP med rimelig effektivitet samt mye renere bakgrunnen.
I denne bidrag rapportere vi en alternativ metode å forberede poly(PFPA) podet overflaten antistoff immobilisering og IP søknad. I en enkelt prosess, som vist i figur 1, en APTES koblingsfunksjonalitet molekyl er først avsatt på silica overflaten, så poly(PFPA) polymer er covalently knyttet til koblingsfunksjonalitet molekylet gjennom reaksjonen PFP enhetene på den polymer og Amin funksjonene på APTES. Denne forberedelse metoden tillater permanent crosslinking av poly(PFPA) til et substrat overflate, men unngår mange komplikasjoner knyttet til SI-CTA syntese og SI-FLÅTEN polymerisering av poly(PFPA) børster. Delvis substitusjon av PFP-enheter med amino-pinne kan fremdeles utføres, slik at finjustering av polymer børste overflaten egenskapene. Vi viser poly(PFPA) podet silica perlene dermed forberedt kan immobilisert med antistoffer og brukt for protein berikelse IP. Den detaljerte perle forberedelse prosedyren antistoff immobilisering og IP testing er dokumentert i denne artikkelen, for leserne interessert i søker et alternativ til konvensjonelle Protein A/G basert IP.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2,2-Azobisisobutyronitrile, 99%</td>
			<td>Daejung Chemicals</td>
			<td>1102-4405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl alcohol for HPLC, 99.9%</td>
			<td>Duksan Pure Chemicals</td>
			<td>d62</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmagnesium bromide solution 1.0&#160;M in THF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>331376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon disulfide anhydrous, &#8805;99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>335266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzyl bromide, 98%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B17905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petroleum ether, 90%</td>
			<td>Samchun Chemicals</td>
			<td>P0220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl ether, 99%</td>
			<td>Daejung Chemicals</td>
			<td>4025-4404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate anhydrous, powder,&#160;99%</td>
			<td>Daejung Chemicals</td>
			<td>5514-4405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentafluorophenyl acrylate</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-264001</td>
			<td>contains inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium oxide, activated, basic, Brockmann I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>199443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Daejung Chemicals</td>
			<td>7548-4400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anisole anhydrous, 99.7%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>296295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica nanoparticle</td>
			<td>Microparticles GmbH</td>
			<td>SiO2-R-0.7</td>
			<td>5% w/v aqueous suspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Aminopropyltrimethoxysilane, &#62;96.0%</td>
			<td>Tokyo Chemical Industry</td>
			<td>T1255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide for HPLC, &#8805;99.7%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34869</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amino-terminated poly(ethylene glycol) methyl ether</td>
			<td>Polymer Source</td>
			<td>P16082-EGOCH3NH2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline tablet</td>
			<td>Takara</td>
			<td>T9181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>9480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl (pH 8.0)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9855G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9640G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40</td>
			<td>VWR</td>
			<td>E109-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15514-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Biosesang</td>
			<td>D1037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor</td>
			<td>Merck</td>
			<td>535140-1MLCN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromo phenol blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B5525-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl (pH 6.8)</td>
			<td>Biosolution</td>
			<td>BT033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Biosolution</td>
			<td>BS003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21985-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PKR Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>12297S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH Antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-32233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Rabbit IgG</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>2729S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa</td>
			<td>Korea Cell Line Bank</td>
			<td>10002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>DAIHAN Scientific</td>
			<td>WUC-D10H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonicator</td>
			<td>BMBio</td>
			<td>BR2006A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge I</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge II</td>
			<td>LABOGENE</td>
			<td>1736R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator</td>
			<td>FINEPCR</td>
			<td>ROTATOR/AG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum oven</td>
			<td>DAIHAN Scientific</td>
			<td>ThermoStable OV-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel permeation chromatography (THF)</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>1260 Infinity II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-ray photoelectron spectrometer</td>
			<td>Thermo VG Scientific</td>
			<td>Sigma Probe</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynamic light scattering</td>
			<td>Malvern Instruments</td>
			<td>ZEN 3690</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of poly(pentafluorophenyl acrylate) functionalized sio2 beads for protein purification

Vi viser en enkel metode for å forberede poly (pentafluorophenyl acrylate) (poly(PFPA)) podet silica perler for antistoff immobilisering og påfølgende immunoprecipitation (IP) program. Poly(PFPA) podet overflaten forberedes via en enkel prosess. I det første trinnet, settes 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) inn som et koblingsfunksjonalitet molekyl på silica overflaten. I det andre trinnet er poly(PFPA) homopolymer, syntetisert via reversibel tillegg og fragmentering kjeden overføring (FLÅTEN) polymerisasjon, podet til koblingsfunksjonalitet molekylet gjennom exchange reaksjonen pentafluorophenyl (PFP)-enheter på den polymer og Amin gruppene i APTES. Avsetning av APTES og poly(PFPA) på silika partikler er bekreftet av X-ray photoelectron spektroskopi (XPS), samt overvåket av partikkel størrelse endringen målt via dynamisk lysspredning (DLS). Forbedre den overflaten hydrophilicity av perler, delvis substitusjon av poly(PFPA) med Amin-functionalized poly(ethylene glycol) (amino-PEG) er også utført. PEG-substituert poly(PFPA) podet silica perler er så immobilisert med antistoffer for IP-programmet. For demonstrasjon, et antistoff mot protein kinase RNA-aktivert (PKR) er ansatt og IP effektivitet bestemmes av vestlige blotting. Analyseresultatene viser at antistoff immobilisert perlene kan faktisk brukes til å berike PKR mens uspesifisert protein interaksjoner er minimal.

En skjematisk for utarbeidelsen av poly(PFPA) podet SiO2 perler, med eller uten PEG substitusjon er vist i figur 1. For å overvåke APTES og poly(PFPA) pode prosessen, nakne SiO2 perler, APTES functionalized SiO2 perler og poly(PFPA) podet SiO2 perler er preget av både DLS (figur 2) og XPS (Figur 3). IP effektiviteten av perler bestemmes av vestlige blott...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Polypentafluorophenyl acrylate Functionalized SiO2 Beads for Protein Purification at JoVE.com

Preparation of Polypentafluorophenyl acrylate Functionalized SiO2 Beads for Protein Purification

En protokoll for utarbeidelse av poly (pentafluorophenyl acrylate) (poly(PFPA)) podet silica perler er presentert. Poly(PFPA) functionalized overflaten er så immobilisert med antistoffer og brukt med hell i protein separasjon gjennom immunoprecipitation.

Utarbeidelse av Poly(pentafluorophenyl acrylate) Functionalized SiO2 perler for Protein rensing

We demonstrate a simple method to prepare poly(pentafluorophenyl acrylate) (poly(PFPA)) grafted silica beads for antibody immobilization and subsequent ...

Denne metoden kan brukes til å forberede biomolekylaktiverte overflater, som har applikasjoner i områder som legemiddellevering, biologisk måldeteksjon og bioseparasjon. Den største fordelen med denne teknikken er at poly PFPA børster er svært reaktive med aminer, og immobilisering av antistoffer oppnås ved inkubasjon i bufferløsning i noen timer. Implikasjonene av denne teknikken strekker seg mot proteinrensing gjennom immunopurification, da det immobiliserte antistoffet med hell kan binde seg med målantigener.Selv om denne metoden er demonstrere for antistoffmobilisering og proteinrensing, kan den også brukes på andre systemer som krever biomolekylær mobilisering. For å behandle silisiumdioksidperler med APTES, må du først få silisiumdioksidpartikler i form av en 5% vektvolum vandig suspensjon. Kombiner 0,8 milliliter silisiumdioksidsuspensjon med 40 milligram APTES, og åtte milliliter metanol i et 20 milliliter scintillasjons hetteglass utstyrt med en rørestang.La reaksjonen fortsette ved romtemperatur i fem timer med kraftig omrøring. Etter fem timer, overfør løsningen til et konisk rør. For å isolere APTES-funksjonaliserte silikondioksidperler, sentrifuger oppløsningen ved 10 000 G i fem minutter.Fjern deretter det overnaturlige. Vask nå perlene ved å pusse dem i tre milliliter frisk metanol. Rist røret for hånd for blanding, men om nødvendig forbedre spredningen ved sonikering i et vannbad i noen sekunder.Sentrifuge som før, og gjenta vasketrinnet en gang til. Kombiner metanol vask silikondioksid perler med tre milliliter dimetylsulfoksid, eller DMSO. Rist blandingen for hånd, eller om nødvendig, sonikere i noen sekunder til perlene er fullstendig dispergert i DMSO.Etter sentrifugering før, fjern supernatanten. Gjenta sentrifugeringstrinnet et siste tidspunkt for å sikre fullstendig løsningsmiddelutveksling fra metanol til DMSO. For å forberede poly PFPA-løsningen oppløs 20 milligram poly PFPA i to milliliter DMSO i et 20 milliliter hetteglass med scintillasjon.For å forberede PEG-oppløsning, oppløs aminfunksjonalisert PEG i en milliliter DMSO. Overfør nå PEG-løsningen til poly PFPA-løsningen. Reager ved romtemperatur i en time med kraftig omrøring.Overfør en milliliter aptes funksjonaliserte silisiumdioksidperler suspendert i DMSO til PEG erstattet poly PFPA-oppløsning. La pode mellom poly PFPA og APTES funksjonaliserte silisiumdioksidperler fortsette ved romtemperatur i en time med kraftig omrøring. Deretter isolerer du perlene ved sentrifugering ved 10.000 G i fem minutter, etterfulgt av fjerning av det overnaturante.Vask perlene ved å legge til tre milliliter DMSO, og bland for hånd eller med noen få sekunder sonikering. Sentrifuger perlene som før. Og fjern supernatant før du gjentar DMSO vask to ganger.Vask perlene to ganger til med tre milliliter trippel destillert vann. Bland deretter for hånd eller med noen få sekunder med sonikering. Sentrifuger perlene som før og fjern supernatanten.Tørk til slutt perlene ved 40 grader celsius i en vakuumovn over natten. Tilsett fem milligram poly PFPA podet silisiumdioksidperler til et 1,5 milliliter mikrocentrifugerør. Vask perlene ved å legge til 800 mikroliter PBS, og bland godt ved å virvle.Sentrifuger perlene ved 10.000 G ved romtemperatur i ett minutt. Fjern det overnaturlige, og gjenta vasketrinnet tre ganger. Legg nå til 350 mikroliter med ferske PBS, 50 mikroliter på 0,1% PBST og 6,67 mikrogram antistoff.Inkuber ca 20 timer på en rotator ved fire grader celsius. Neste dag, vask perlene og sentrifuge på 400 G og fire grader celsius i ett minutt. Fjern deretter det overnaturlige og legg forsiktig til 400 mikroliter lysisbuffer.Forsiktig resuspend perlene ved å pipetter opp og ned fem ganger. Gjenta dette vasketrinnet tre ganger. Etter den endelige vasken, fjern så mye av det overnaturlige som mulig.Klargjør celler og lysisbuffer som beskrevet i tekstprotokollen. Deretter gjenbruker cellepellet med 400 mikroliter lysisbufferen. Sonicate cellene ved hjelp av en ultra sonicator.Etter sonikering, vortex kort. Deretter sentrifugere lysatet på 20.000 G ved fire grader celsius i 10 minutter. Overfør supernatanten til et nytt, 1,5 milliliter sentrifugerør.For å utføre immunoprecipitation, overfør 300 mikroliter cellelylat til tidligere forberedt antistoff immobilisert poly PFPA podet silisiumdioksid perler. Behold 30 mikroliter av cellelysatet som inngangsprøve i et nytt mikrocentrifugerør. Inkuber lysate perlene blandingen i tre timer på en rotator ved fire grader celsius.Etter inkubasjon sentrifuger blandingen ved 400 G ved fire grader celsius i ett minutt. Fjern det overnaturlige, og legg forsiktig til 400 mikroliter vaskebuffer. Forsiktig resuspend perlene ved å pipetter opp og ned omtrent fem ganger.Etter tre vasker, fjern så mye av det overnaturlige som mulig. Tilsett 30 mikroliter 2x SDS som laster fargestoff til perlene og til inngangsprøven. Varm dem deretter i 10 minutter ved 95 grader celsius.Etter oppvarming, analysere prøven ved hjelp av vestlig blotting, eller lagre prøven på minus 20 grader celsius. De funksjonaliserte silikaperlene undersøkes av røntgenfotoelektronspektroskopi, eller XPS, for å bestemme overflatesammensetning. Representative XPS-data vises her.Etter APTES-behandling oppdages nitrogen 1-toppen forbundet med amingruppesonen APTES. Etter poly PFPA-behandling oppdages fluor1s-toppen forbundet med PFP-enhetene på polymeren. Protein kinase RNA aktivert, eller PKR berikelse gjennom immunforutståelse utføres, og den hentydet protein prøven analyseres ved hjelp av vestlig blotting.Som forventet viser perler immobilisert uten antistoff, eller en ikke-spesifikk antistoffblanding ingen PKR-gjenoppretting. Perlene inkubert med anti-PKR kan med hell berike PKR som indikert av tilstedeværelsen av et PKR-bånd og fraværet av GAPDH-bånd. Mens du prøver denne prosedyren, er det viktig å huske at når man sammenligner systemer, bør IP-eksperimentene samt den påfølgende vestlige blottinganalysen gjøres samtidig.Etter utviklingen kan denne teknikken brukes til immobilisering av forskjellig biomolekylært eller materiale substrat. Videre har denne metoden den ekstra fordelen av tuning Bare overflateegenskap som skal skreddersys etter hvert programs behov.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Preparation of Poly(pentafluorophenyl acrylate) Functionalized SiO2 Beads for Protein Purification

Synthesis and Characterization of Functionalized Metal-organic Frameworks

Syntese og karakterisering av funksjon Metal-organisk Rammeverk

Metal-organic frameworks have attracted extraordinary amounts of research attention, as they are attractive candidates for numerous industrial and ...

Microbubble Fabrication of Concave-porosity PDMS Beads

Mikrobobleutskillere Fabrikasjon av Konkav-porøsitet PDMS Perler

Microbubble fabrication (by use of a fine emulsion) provides a means of increasing the surface-area-to-volume (SAV) ratio of polymer materials, which is ...

Immobilization of Multi-biocatalysts in Alginate Beads for Cofactor Regeneration and Improved Reusability

Immobilisering av Multi-biocatalysts i alginatkuler for kofaktor Regeneration og forbedret Reusability

We have recently developed a simple, reusable and coupled whole-cell biocatalytic system with the capability of cofactor regeneration and biocatalyst ...

Preparation of a Corannulene-functionalized Hexahelicene by Copper(I)-catalyzed Alkyne-azide Cycloaddition of Nonplanar Polyaromatic Units

Preparation of a Corannulene-functionalized Hexahelicene by CopperI-catalyzed Alkyne-azide Cycloaddition of Nonplanar Polyaromatic Units

Utarbeidelse av en Corannulene-funksjon Hexahelicene av kobber (I) -catalyzed alkyn-azid cykloaddisjon av plane Polyaromatiske Units

The main purpose of this video is to show 6 reaction steps of a convergent synthesis and prepare a complex molecule containing up to three nonplanar ...

The Effect of Interfacial Chemical Bonding in TiO2-SiO2 Composites on Their Photocatalytic NOx Abatement Performance

The Effect of Interfacial Chemical Bonding in TiO2-SiO2 Composites on Their Photocatalytic NOx Abatement Performance

Effekten av interfacial kjemisk binding i TiO<sub&gt; 2</sub&gt; -SiO<sub&gt; 2</sub&gt; Kompositter på deres fotokatalytiske NOx-reduksjonsytelse

The chemical bonding of particulate photocatalysts to supporting material surfaces is of great importance in engineering more efficient and practical ...

Methionine Functionalized Biocompatible Block Copolymers for Targeted Plasmid DNA Delivery

Metionin Funksjonalisert biokompatible Block Kopolymerer for målrettet plasmider DNA levering

Reversible addition-fragmentation chain transfer (RAFT) polymerization integrates the advantages of radical polymerization and living polymerization. This ...

Efficient Synthesis of All-Carbon Quaternary Centers via the Conjugate Addition of Functionalized Monoorganozinc Bromides

Effektiv syntese av alle-Carbon kvartær Centers via bøy tilsetting av Funksjonalisert Monoorganozinc bromider

The conjugate addition of organometallic reagents to &#945;,&#946;-unsaturated carbonyls represents an important method to generate C&#8211;C bonds in the ...

Organic Solvent-Based Protein Precipitation for Robust Proteome Purification Ahead of Mass Spectrometry

Organisk løsemiddelbasert proteinutfelling for robust proteomrensing før massespektrometri

While multiple advances in mass spectrometry (MS) instruments have improved qualitative and quantitative proteome analysis, more reliable front-end ...

Porphyrin-Modified Beads in Flow Cytometry

Porphyrin-Modified Beads for Use as Compensation Controls in Flow Cytometry

Porphyrin-Modified Beads for Use as Compensation Controls in Flow Cytometry (Video) | JoVE 

Porfyrinmodifiserte perler til bruk som kompensasjonskontroll i flowcytometri

Flow cytometry can rapidly characterize and quantify diverse cell populations based on fluorescence measurements. The cells are first stained with one or ...