Name: preparation of poly(pentafluorophenyl acrylate) functionalized sio2 beads for protein purification
Uploaded: 2018-11-19T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Polypentafluorophenyl acrylate Functionalized SiO2 Beads for Protein Purification at JoVE.com

Este trabalho foi financiado pela Agência para o desenvolvimento de defesa (Grant no. UD170039ID).

1. preparação de homopolímero de Poly(PFPA)
<ol><li>Recristalização de AIBN<ol>
<li>Combine 5 g de 2,2'-azobis(2-methylpropionitrile) (AIBN) com 25 mL de metanol em um copo de 250 mL. Mergulhe o béquer em banho de óleo 60 ° C e, em seguida, agitar vigorosamente a mistura com uma barra de agitação até AIBN é totalmente dissolvido.</li>
		<li>Filtrar a solução quente através de papel de filtro (5-8 μm retenção de partículas) e armazene o filtrado a 4 ° C, para permitir que os cristais de forma lenta.<...

<ol>
	<li>Johnsson, B., L&#246;f&#229;s, S., Lindquist, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilization+of+proteins+to+a+carboxymethyldextran-modified+gold+surface+for+biospecific+interaction+analysis+in+surface+plasmon+resonance+sensors.">Immobilization of proteins to a carboxymethyldextran-modified gold surface for biospecific interaction analysis in surface plasmon resonance sensors.</a> Analytical Biochemistry. 198 (2), 268-277 (1991).</li><li>Kurzawa, C., Hengstenberg, A., Schuhmann, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilization+method+for+the+preparation+of+biosensors+based+on+pH+shift-induced+deposition+of+biomolecule-containing+polymer+films.">Immobilization method for the preparation of biosensors based on pH shift-induced deposition of biomolecule-containing polymer films.</a> Analytical Chemistry. 74 (2), 355-361 (2002).</li><li>You, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+identification+of+proteins+using+nanoparticle-fluorescent+polymer+'chemical+nose'+sensors.">Detection and identification of proteins using nanoparticle-fluorescent polymer 'chemical nose' sensors.</a> Nature Nanotechnology. 2 (5), 318-323 (2007).</li><li>Roberts, M. W., Ongkudon, C. M., Forde, G. M., Danquah, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatility+of+polymethacrylate+monoliths+for+chromatographic+purification+of+biomolecules.">Versatility of polymethacrylate monoliths for chromatographic purification of biomolecules.</a> Journal of Separation Science. 32 (15-16), 2485-2494 (2009).</li><li>Sandison, M. E., Cumming, S. A., Kolch, W., Pitt, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On-chip+immunoprecipitation+for+protein+purification.">On-chip immunoprecipitation for protein purification.</a> Lab on a Chip. 10 (20), 2805-2813 (2010).</li><li>Das, A., Theato, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activated+Ester+Containing+Polymers:+Opportunities+and+Challenges+for+the+Design+of+Functional+Macromolecules.">Activated Ester Containing Polymers: Opportunities and Challenges for the Design of Functional Macromolecules.</a> Chemical Reviews. 116 (3), 1434-1495 (2016).</li><li>Choi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functionalization+and+patterning+of+reactive+polymer+brushes+based+on+surface+reversible+addition+and+fragmentation+chain+transfer+polymerization.">Functionalization and patterning of reactive polymer brushes based on surface reversible addition and fragmentation chain transfer polymerization.</a> Journal of Polymer Science Part A: Polymer Chemistry. 50 (19), 4010-4018 (2012).</li><li>Kessler, D., Jochum, F. D., Choi, J., Char, K., Theato, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+surface+coatings+based+on+polysilsesquioxanes:+universal+method+toward+light-responsive+surfaces.">Reactive surface coatings based on polysilsesquioxanes: universal method toward light-responsive surfaces.</a> ACS Applied Materials &amp; Interfaces. 3 (2), 124-128 (2011).</li><li>Son, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Penetration+and+exchange+kinetics+of+primary+alkyl+amines+applied+to+reactive+poly(pentafluorophenyl+acrylate)+thin+films.">Penetration and exchange kinetics of primary alkyl amines applied to reactive poly(pentafluorophenyl acrylate) thin films.</a> Polymer Journal. 48 (4), 487-495 (2016).</li><li>Kessler, D., Roth, P. J., Theato, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+surface+coatings+based+on+polysilsesquioxanes:+controlled+functionalization+for+specific+protein+immobilization.">Reactive surface coatings based on polysilsesquioxanes: controlled functionalization for specific protein immobilization.</a> Langmuir. 25 (17), 10068-10076 (2009).</li><li>Kessler, D., Theato, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+surface+coatings+based+on+polysilsesquioxanes:+defined+adjustment+of+surface+wettability.">Reactive surface coatings based on polysilsesquioxanes: defined adjustment of surface wettability.</a> Langmuir. 25 (24), 14200-14206 (2009).</li><li>Kessler, D., Nilles, K., Theato, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modular+approach+towards+multi-functional+surfaces+with+adjustable+and+dual-responsive+wettability+using+a+hybrid+polymer+toolbox.">Modular approach towards multi-functional surfaces with adjustable and dual-responsive wettability using a hybrid polymer toolbox.</a> Journal of Materials Chemistry. 19 (43), 8184-8189 (2009).</li><li>Eberhardt, M., Mruk, R., Zentel, R., Theato, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+pentafluorophenyl(meth)acrylate+polymers:+new+precursor+polymers+for+the+synthesis+of+multifunctional+materials.">Synthesis of pentafluorophenyl(meth)acrylate polymers: new precursor polymers for the synthesis of multifunctional materials.</a> European Polymer Journal. 41 (7), 1569-1575 (2005).</li><li>Jochum, F. D., Forst, F. R., Theato, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PNIPAM+copolymers+containing+light-responsive+chromophores:+a+method+toward+molecular+logic+gates.">PNIPAM copolymers containing light-responsive chromophores: a method toward molecular logic gates.</a> Macromolecular Rapid Communications. 31 (16), 1456-1461 (2010).</li><li>Schattling, P., Pollmann, I., Theato, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+CO2-responsive+polymers+by+post-polymerization+modification.">Synthesis of CO2-responsive polymers by post-polymerization modification.</a> Reactive &amp; Functional Polymers. 75, 16-21 (2014).</li><li>He, L., Szameit, K., Zhao, H., Hahn, U., Theato, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postpolymerization+modification+using+less+cytotoxic+activated+ester+polymers+for+the+synthesis+of+biological+active+polymers.">Postpolymerization modification using less cytotoxic activated ester polymers for the synthesis of biological active polymers.</a> Biomacromolecules. 15 (8), 3197-3205 (2014).</li><li>Arnold, R. M., McNitt, C. D., Popik, V. V., Locklin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+grafting+of+poly(pentafluorophenyl+acrylate)+onto+oxides:+versatile+substrates+for+reactive+microcapillary+printing+and+self-sorting+modification.">Direct grafting of poly(pentafluorophenyl acrylate) onto oxides: versatile substrates for reactive microcapillary printing and self-sorting modification.</a> Chemical Communications. 50 (40), 5307-5309 (2014).</li><li>Son, H., Ku, J., Kim, Y., Li, S., Char, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amine-Reactive+Poly(pentafluorophenyl+acrylate)+Brush+Platforms+for+Cleaner+Protein+Purification.">Amine-Reactive Poly(pentafluorophenyl acrylate) Brush Platforms for Cleaner Protein Purification.</a> Biomacromolecules. 19 (3), 951-961 (2018).</li><li>Cullen, S. E., Schwartz, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+for+isolation+of+H-2+and+Ia+alloantigens+with+immunoprecipitation+induced+by+protein+A-bearing+staphylococci.">An improved method for isolation of H-2 and Ia alloantigens with immunoprecipitation induced by protein A-bearing staphylococci.</a> The Journal of Immunology. 117 (1), 136-142 (1976).</li><li>Sisson, T. H., Castor, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+for+immobilizing+IgG+antibodies+on+protein+A-agarose.">An improved method for immobilizing IgG antibodies on protein A-agarose.</a> Journal of Immunology Methods. 127 (2), 215-220 (1990).</li><li>Peritz, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoprecipitation+of+mRNA-protein+complexes.">Immunoprecipitation of mRNA-protein complexes.</a> Nature Protocols. 1 (2), 577-580 (2006).</li><li>Zhang, Z., Chen, S., Jiang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual-functional+biomimetic+materials:+nonfouling+poly+(carboxybetaine)+with+active+functional+groups+for+protein+immobilization.">Dual-functional biomimetic materials: nonfouling poly (carboxybetaine) with active functional groups for protein immobilization.</a> Biomacromolecules. 7 (12), 3311-3315 (2006).</li><li>Yao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NHS-ester+functionalized+poly(PEGMA)+brushes+on+silicon+surface+for+covalent+protein+immobilization.">NHS-ester functionalized poly(PEGMA) brushes on silicon surface for covalent protein immobilization.</a> Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 66 (2), 233-239 (2008).</li><li>Ma, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Facile+fabrication+of+microsphere-polymer+brush+hierarchically+three-dimensional+(3D)+substrates+for+immunoassays.">Facile fabrication of microsphere-polymer brush hierarchically three-dimensional (3D) substrates for immunoassays.</a> Chemical Communications. 51 (31), 6749-6752 (2015).</li><li>Chong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thiocarbonylthio+compounds+[SC+(Ph)+S&#8722;+R]+in+free+radical+polymerization+with+reversible+addition-fragmentation+chain+transfer+(RAFT+Polymerization).+Role+of+the+free-radical+leaving+group+(R).">Thiocarbonylthio compounds [SC (Ph) S&#8722; R] in free radical polymerization with reversible addition-fragmentation chain transfer (RAFT Polymerization). Role of the free-radical leaving group (R).</a> Macromolecules. 36 (7), 2256-2272 (2003).</li><li>Jochum, F. D., Theato, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature-+and+Light-Responsive+Polyacrylamides+Prepared+by+a+Double+Polymer+Analogous+Reaction+of+Activated+Ester+Polymers.">Temperature- and Light-Responsive Polyacrylamides Prepared by a Double Polymer Analogous Reaction of Activated Ester Polymers.</a> Macromolecules. 42 (16), 5941-5945 (2009).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+The+Western+Blot.">Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot.</a> JoVE. , (2018).</li><li>Chua, G. B. H., Roth, P. J., Duong, H. T. T., Davis, T. P., Lowe, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+Thermoresponsive+Solution+Properties+of+Poly[oligo(ethylene+glycol)+(meth)acrylamide]s:+Biocompatible+PEG+Analogues.">Synthesis and Thermoresponsive Solution Properties of Poly[oligo(ethylene glycol) (meth)acrylamide]s: Biocompatible PEG Analogues.</a> Macromolecules. 45 (3), 1362-1374 (2012).</li></ol>

A síntese de poly(PFPA) enxertados SiO2 grânulos é ilustrado na Figura 1. Empregando APTES como uma molécula de vinculador, escovas poly(PFPA) covalentemente enxertadas de SiO2 substrato podem ser preparadas através de um processo de duas etapas simples. Embora algumas das unidades de PFP são sacrificadas para a reação com APTES, um grande número de unidades a PFP deverão permanecer disponível para posterior reação com anticorpos ou amino-PEG. Os grupos PFP...

Escovas de polímero reativo tem recebido muito interesse nos últimos anos. Eles podem ser usados para imobilizar moléculas funcionais em materiais orgânicos ou inorgânicos para criar superfícies registradas com aplicações em áreas como a deteção e a separação1,2,3,4, 5. Entre os polímeros reativos relatados, aqueles que contêm unidades de éster de pentafluorophenyl são particularmente útil devido a sua alta reatividade com aminas e resistência em direção a hidrólise6. Um tal polímero é poly(PFPA), e pode ser prontamente funcionalizado pós-polimerização com moléculas contendo aminas primárias ou secundárias7,8,9,10. Em um exemplo, escovas de poly(PFPA) foram reagiu com amino-spiropyrans para criar superfícies luz-responsivo7.
A preparação do poly(PFPA) e suas aplicações têm sido descritos em algumas das anteriores Publicações6,7,8,9,10,11,12 ,13,14,15,16,17. Em particular, Theato e colaboradores relataram a síntese de escovas poly(PFPA) via tanto "enxertia para" e "enxertia de" métodos7,8,10,11,12 . Na "enxertia para" abordagem, um poli (methylsilsesquioxane)-poli (acrilato de pentafluorophenyl) (polímero híbrido de poly(MSSQ-PFPA)) foi sintetizado8,10,11,12. O componente de poly(MSSQ) foi capaz de adesão forte de formulário com um número de diferentes superfícies orgânicas e inorgânicas, permitindo assim o componente poly(PFPA) formar uma camada de pincel sobre a superfície revestida de material. Na "enxertia de" abordagem, superfície iniciada adição reversível e polimerização de transferência (SI-JANGADA) fragmentação da cadeia foi empregada para preparar poly(PFPA) pincéis7. Neste caso, um agente de transferência de corrente da superfície de imobilizado (SI-CTA) primeiro era ligado covalentemente ao substrato através de reação sílica-silano. SI-CTA imobilizado em seguida, participou a polimerização de SI-JANGADA de monômeros de espionagem, gerando densamente poly(PFPA) escovas com ligação covalente estável ao substrato.
Utilizando as escovas poly(PFPA) sintetizadas através da polimerização de SI-JANGADA, recentemente Demonstramos a imobilização dos anticorpos sobre partículas de sílica poly(PFPA) enxertados e sua subsequente aplicação na purificação de proteína18. O uso de escovas de poly(PFPA) para a imobilização de anticorpo foi encontrado para resolver uma série de problemas associados a atual separação de proteínas através de IP. IP convencional baseia-se na utilização de proteína A/G como um vinculador para anticorpo imobilização19,20,21. Desde que o uso de proteína A/G permite que os anticorpos ser anexado com uma orientação específica, eficiência de recuperação de antígeno alvo alto é alcançada. No entanto, o uso de proteína A/G sofre de interação de proteínas não específicas, bem como a perda de anticorpos durante a recuperação de proteína, os quais contribuem para um elevado nível de ruído de fundo. Para resolver essas deficiências, ligando direto dos anticorpos a um sólido apoio tem sido explorada22,23,24. A eficiência dessas técnicas é geralmente baixa devido a orientação aleatória dos anticorpos quitosana. Para o substrato poly(PFPA) enxertadas, a imobilização de anticorpos é permanente, conseguida através da reação de troca entre unidades PFP e funcionalidades de amina em anticorpos. Embora a orientação de anticorpo é ainda aleatória, o sistema beneficia-se de ter muitos sites PFP reativas, controláveis pelo grau de polimerização. Além disso, mostramos que, por substituição parcial das unidades PFP com amino-PEG, Hidrofilia superfície pode ser ajustada, melhorando assim a eficiência de recuperação de proteínas do sistema18. Em geral, as partículas de sílica poly(PFPA) enxertadas foram mostradas para ser uma alternativa eficaz ao IP tradicional com razoável eficiência, bem como a experiência mais limpa.
Esta contribuição, nós relatamos um método alternativo para preparar poly(PFPA) superfície enxertados para imobilização de anticorpo e aplicação de IP. Em um processo de duas etapas simples, conforme ilustrado na Figura 1, uma molécula de vinculador APTES é primeiro depositada na superfície da sílica, em seguida, o polímero de poly(PFPA) está covalentemente ligado à molécula de vinculador através da reação entre as unidades PFP a polímero e as funções Amina na APTES. Esse método de preparação permite a reticulação permanente de poly(PFPA) a uma superfície de substrato, mas evita as muitas complicações associadas à síntese de SI-CTA e polimerização de SI-JANGADA de escovas poly(PFPA). Substituição parcial das unidades com amino-PEG PFP ainda pode ser executada, permitindo o ajuste fino de propriedades escova da superfície do polímero. Mostramos que os grânulos de sílica poly(PFPA) enxertado assim preparados podem ser imobilizados com anticorpos e utilizados para o enriquecimento da proteína através do IP. O procedimento de preparação detalhada do grânulo, imobilização do anticorpo e teste de IP estão documentadas neste artigo, para os leitores interessados na busca de uma alternativa à convencional proteína A/G com base em IP.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2,2-Azobisisobutyronitrile, 99%</td>
			<td>Daejung Chemicals</td>
			<td>1102-4405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl alcohol for HPLC, 99.9%</td>
			<td>Duksan Pure Chemicals</td>
			<td>d62</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmagnesium bromide solution 1.0&#160;M in THF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>331376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon disulfide anhydrous, &#8805;99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>335266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzyl bromide, 98%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B17905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petroleum ether, 90%</td>
			<td>Samchun Chemicals</td>
			<td>P0220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl ether, 99%</td>
			<td>Daejung Chemicals</td>
			<td>4025-4404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate anhydrous, powder,&#160;99%</td>
			<td>Daejung Chemicals</td>
			<td>5514-4405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentafluorophenyl acrylate</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-264001</td>
			<td>contains inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium oxide, activated, basic, Brockmann I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>199443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Daejung Chemicals</td>
			<td>7548-4400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anisole anhydrous, 99.7%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>296295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica nanoparticle</td>
			<td>Microparticles GmbH</td>
			<td>SiO2-R-0.7</td>
			<td>5% w/v aqueous suspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Aminopropyltrimethoxysilane, &#62;96.0%</td>
			<td>Tokyo Chemical Industry</td>
			<td>T1255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide for HPLC, &#8805;99.7%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34869</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amino-terminated poly(ethylene glycol) methyl ether</td>
			<td>Polymer Source</td>
			<td>P16082-EGOCH3NH2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline tablet</td>
			<td>Takara</td>
			<td>T9181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>9480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl (pH 8.0)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9855G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9640G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40</td>
			<td>VWR</td>
			<td>E109-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15514-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Biosesang</td>
			<td>D1037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor</td>
			<td>Merck</td>
			<td>535140-1MLCN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromo phenol blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B5525-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl (pH 6.8)</td>
			<td>Biosolution</td>
			<td>BT033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Biosolution</td>
			<td>BS003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21985-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PKR Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>12297S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH Antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-32233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Rabbit IgG</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>2729S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa</td>
			<td>Korea Cell Line Bank</td>
			<td>10002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>DAIHAN Scientific</td>
			<td>WUC-D10H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonicator</td>
			<td>BMBio</td>
			<td>BR2006A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge I</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge II</td>
			<td>LABOGENE</td>
			<td>1736R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator</td>
			<td>FINEPCR</td>
			<td>ROTATOR/AG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum oven</td>
			<td>DAIHAN Scientific</td>
			<td>ThermoStable OV-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel permeation chromatography (THF)</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>1260 Infinity II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-ray photoelectron spectrometer</td>
			<td>Thermo VG Scientific</td>
			<td>Sigma Probe</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynamic light scattering</td>
			<td>Malvern Instruments</td>
			<td>ZEN 3690</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of poly(pentafluorophenyl acrylate) functionalized sio2 beads for protein purification

Vamos demonstrar um método simples para preparar poli (acrilato de pentafluorophenyl) (poly(PFPA)) enxertados grânulos de sílica para imobilização de anticorpo e aplicação subsequente da imunoprecipitação (IP). A superfície enxertados poly(PFPA) é preparada através de um processo de duas etapas simples. Na primeira etapa, 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) é depositado como uma molécula de vinculador na superfície da sílica. Na segunda etapa, poly(PFPA) homopolímero, sintetizado através da adição reversível e polimerização de transferência (balsa) de cadeia de fragmentação, é enxertado à molécula de vinculador através da reação de troca entre as unidades de pentafluorophenyl (PFP) sobre o polímero e os grupos amina na APTES. A deposição de APTES e poly(PFPA) sobre a sílica, partículas são confirmadas por espectroscopia de fotoelétron de raios x (XPS), bem como monitoradas pela alteração de tamanho de partículas medido através de difusão dinâmica da luz (DLS). Para melhorar a superfície Hidrofilia dos grânulos, substituição parcial de poly(PFPA) com poly(ethylene glycol) acrescida de amina (amino-PEG) também é executada. O PEG-substituídos poly(PFPA) enxertados sílica grânulos então são imobilizados com anticorpos para aplicação de IP. Para demonstração, um anticorpo contra uma proteína quinase RNA-ativado (PKR) é empregado, e eficiência IP é determinada pela mancha ocidental. Os resultados da análise mostram que os grânulos de anticorpo imobilizado na verdade podem ser usados para enriquecer PKR enquanto interações não específicas da proteína são mínimas.

Um esquema para a preparação de poly(PFPA) enxertado SiO2 grânulos, com ou sem PEG substituição é mostrada na Figura 1. Para monitorar o APTES e poly(PFPA) enxertia processo, desencapado SiO2 grânulos, APTES acrescida de SiO2 grânulos, e poly(PFPA) enxertados SiO2 miçangas caracterizam-se por DLS (Figura 2) e XPS (Figura 3). Eficiências IP dos gr?...

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Preparation of Polypentafluorophenyl acrylate Functionalized SiO2 Beads for Protein Purification

Um protocolo para a preparação de poli (acrilato de pentafluorophenyl) (poly(PFPA)) enxertados grânulos de sílica é apresentado. A superfície funcionalizados poly(PFPA) é então imobilizada com anticorpos e usada com sucesso para a separação de proteínas através da imunoprecipitação.

Preparação de Poly(pentafluorophenyl acrylate) acrescida SiO2 grânulos para purificação de proteínas

We demonstrate a simple method to prepare poly(pentafluorophenyl acrylate) (poly(PFPA)) grafted silica beads for antibody immobilization and subsequent ...

Este método pode ser usado para preparar superfícies ativadas por biomoléculas, que têm aplicações em áreas como entrega de medicamentos, detecção de alvos biológicos e bio separação. A principal vantagem dessa técnica é que os pincéis poly PFPA são altamente reativos com aminas, e a imobilização de anticorpos é alcançada pela incubação em solução tampão por algumas horas. As implicações desta técnica se estendem para a purificação da proteína através da imunopurificação, já que o anticorpo imobilizado pode se ligar com os antígenos alvo.Embora este método seja demonstrado para mobilização de anticorpos e purificação de proteínas, ele também pode ser aplicado a outros sistemas que requerem mobilização biomolecular. Para tratar contas de dióxido de silício com APTES, primeiro obtenha partículas de dióxido de silício na forma de uma suspensão aquosa de volume de peso de 5%. Combine 0,8 mililitros de suspensão de dióxido de silício com 40 miligramas de APTES, e oito mililitros de metanol em um frasco de cintilação de 20 mililitros equipado com uma barra de mexida.Deixe a reação prosseguir à temperatura ambiente por cinco horas com agitação vigorosa. Depois de cinco horas, transfira a solução para um tubo cônico. Para isolar as contas de dióxido de silicone funcionalizadas APTES, centrifugar a solução a 10.000 G durante cinco minutos.Em seguida, remova o supernaspe. Agora lave as contas repaginando-as em três mililitros de metanol fresco. Aperte o tubo à mão para misturar, mas, se necessário, melhore a dispersão por sônica em um banho de água por alguns segundos.Centrifugar como antes, e repetir o passo de lavagem mais uma vez. Combine as contas de dióxido de silicone de lavagem de metanol com três mililitros de sulfóxido de dimetil, ou DMSO. Agite a mistura à mão, ou se necessário, sonicar por alguns segundos até que as contas estejam totalmente dispersas no DMSO.Após a centrifugação antes, remova o sobrenante. Repita a etapa de centrifugação um tempo final para garantir a troca completa de solventes do metanol para o DMSO. Para preparar a solução poly PFPA, dissolva 20 miligramas de pfpa de poli em dois mililitros de DMSO em um frasco de cintilação de 20 mililitros.Para preparar a solução PEG, dissolva peg funcionalizado de amina em um mililitro de DMSO. Agora transfira a solução PEG para a solução poly PFPA. Reaja à temperatura ambiente por uma hora com agitação vigorosa.Transfira um mililitro das contas de dióxido de silício funcionalizadas APTES suspensas em DMSO para a solução DE POLI PFPA substituída pelo PEG. Permita que o enxerto entre as contas de dióxido de silício funcionalizante poly PFPA e APTES prossiga à temperatura ambiente por uma hora com agitação vigorosa. Em seguida, isole as contas por centrifugação a 10.000 G por cinco minutos, seguido pela remoção do supernasce.Lave as contas adicionando três mililitros de DMSO, e misture à mão ou com alguns segundos de sônica. Centrifugar as contas como antes. E remova o supernatante antes de repetir a lavagem do DMSO duas vezes.Lave as contas mais duas vezes com três mililitros de água tripla destilada. Em seguida, misture à mão ou com alguns segundos de sônicação. Centrifugar as contas como antes e remover o supernatante.Por fim, seque as contas a 40 graus celsius em um forno a vácuo durante a noite. Adicione cinco miligramas de contas de dióxido de silício enxertadas de poli PFPA a um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Lave as contas adicionando 800 microliters de PBS, e misture bem com vórtices.Centrifugar as contas a 10.000 G em temperatura ambiente por um minuto. Retire o supernatante e repita o passo de lavagem três vezes. Agora adicione 350 microliters de PBS fresco, 50 microliters de 0,1% PBST e 6,67 microgramas do anticorpo.Incubar aproximadamente 20 horas em uma rotadora a quatro graus celsius. No dia seguinte, lave as contas e a centrífuga a 400 G e 4 graus celsius por um minuto. Em seguida, remova o supernascer e adicione cuidadosamente 400 microliters de tampão de lise.Levemente resuspenque as contas pipetting para cima e para baixo cinco vezes. Repita esta etapa de lavagem três vezes. Após a lavagem final, remova o máximo possível do supernante.Prepare células e tampão de lise conforme descrito no protocolo de texto. Em seguida, resuspenja a pelota celular com 400 microliters do tampão de lise. Sonicar as células usando um ultra sonicator.Após a sônicação, vórtice brevemente. Em seguida, centrifugar o lysate a 20.000 G a quatro graus celsius por 10 minutos. Transfira o supernatante para um novo tubo de centrífuga de 1,5 mililitro.Para realizar a imunoprecipitação, transfira 300 microlitadores de lisato celular para contas de dióxido de silício enxertadas poli PFPA previamente preparadas. Retenha 30 microlitadores do liseto celular como a amostra de entrada em um novo tubo de microcentrifuagem. Incubar a mistura de contas de lise por três horas em um rotador a quatro graus celsius.Após a incubação, centrifugar a mistura a 400 G a quatro graus celsius por um minuto. Remova o supernatante e adicione cuidadosamente 400 microliters de tampão de lavagem. Levemente resuspenque as contas pipetting para cima e para baixo cerca de cinco vezes.Depois de três lavagens, remova o máximo possível do supernante. Adicione 30 microliters de corante de carregamento SDS 2x às contas e à amostra de entrada. Em seguida, aqueça-os por 10 minutos a 95 graus celsius.Após o aquecimento, analise a amostra usando manchas ocidentais ou armazene a amostra a menos 20 graus celsius. As contas de sílica funcionalizada são examinadas por espectroscopia fotoeletrrona de raios-X, ou XPS, para determinar a composição da superfície. Os dados do Representante XPS são mostrados aqui.Após o tratamento APTES, o pico de nitrogênio 1s associado à zona do grupo de amina APTES é detectado. Após o tratamento de poli PFPA, o pico de flúor 1s associado às unidades pfp no polímero é detectado. RNA de quinase proteica ativado, ou enriquecimento PKR através da imunoprecipitação é realizado, e a amostra de proteína aludida é analisada usando mancha ocidental.Como esperado, contas imobilizadas sem anticorpos, ou uma mixtura de anticorpos não específica não mostram recuperação de PKR. As contas incubadas com anti-PKR podem enriquecer com sucesso o PKR, como indicado pela presença de uma banda PKR e pela ausência de banda GAPDH. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que, ao comparar sistemas, os experimentos ip, bem como a análise subsequente de manchas ocidentais devem ser feitos simultaneamente.Após seu desenvolvimento, essa técnica pode ser utilizada para a imobilização de diferentes substratos biomoleculares ou materiais. Além disso, este método tem o benefício adicional de sintonizar apenas a propriedade de superfície a ser adaptada para atender à necessidade de cada aplicativo.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Preparation of Poly(pentafluorophenyl acrylate) Functionalized SiO2 Beads for Protein Purification

Synthesis and Characterization of Functionalized Metal-organic Frameworks

Síntese e caracterização de funcionalizados metal-organic frameworks

Metal-organic frameworks have attracted extraordinary amounts of research attention, as they are attractive candidates for numerous industrial and ...

Química

Microbubble Fabrication of Concave-porosity PDMS Beads

Fabricação de microbolhas de Côncavo-porosidade Beads PDMS

Microbubble fabrication (by use of a fine emulsion) provides a means of increasing the surface-area-to-volume (SAV) ratio of polymer materials, which is ...

Immobilization of Multi-biocatalysts in Alginate Beads for Cofactor Regeneration and Improved Reusability

Imobilização de Multi-biocatalisadores em alginato Beads para Cofator Regeneração e melhorada Reutilização

We have recently developed a simple, reusable and coupled whole-cell biocatalytic system with the capability of cofactor regeneration and biocatalyst ...

Preparation of a Corannulene-functionalized Hexahelicene by Copper(I)-catalyzed Alkyne-azide Cycloaddition of Nonplanar Polyaromatic Units

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Preparação de um Hexahelicene Corannulene-funcionalizado por cobre (I) catalisada por cicloadição alcino azida de unidades não planar aromáticos policíclicos

The main purpose of this video is to show 6 reaction steps of a convergent synthesis and prepare a complex molecule containing up to three nonplanar ...

The Effect of Interfacial Chemical Bonding in TiO2-SiO2 Composites on Their Photocatalytic NOx Abatement Performance

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O efeito da Ligação Química Interfacial em Compósitos de TiO2-SiO2 em seu Desempenho Fotocatalítico de Redução de NOx

The chemical bonding of particulate photocatalysts to supporting material surfaces is of great importance in engineering more efficient and practical ...

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Reversible addition-fragmentation chain transfer (RAFT) polymerization integrates the advantages of radical polymerization and living polymerization. This ...

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Síntese eficiente de todos os centros quaternários de carbono através da adição conjugada de brometos Monoorganozinc funcionalizados

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Precipitação de proteína orgânica baseada em solventes para purificação robusta de proteome antes da espectrometria de massa

While multiple advances in mass spectrometry (MS) instruments have improved qualitative and quantitative proteome analysis, more reliable front-end ...

Porphyrin-Modified Beads in Flow Cytometry

Porphyrin-Modified Beads for Use as Compensation Controls in Flow Cytometry

Porphyrin-Modified Beads for Use as Compensation Controls in Flow Cytometry (Video) | JoVE 

Pérolas Modificadas com Porfirina para Uso como Controle de Compensação em Citometria de Fluxo

Flow cytometry can rapidly characterize and quantify diverse cell populations based on fluorescence measurements. The cells are first stained with one or ...