Name: preparation of poly(pentafluorophenyl acrylate) functionalized sio2 beads for protein purification
Uploaded: 2018-11-19T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Polypentafluorophenyl acrylate Functionalized SiO2 Beads for Protein Purification at JoVE.com

Эта работа была поддержана агентство развития (Грант № обороны UD170039ID).

1. Подготовка гомополимер Poly(PFPA)
<ol><li>Рекристаллизация Динитрила<ol>
<li>Комбинат 5 g 2,2'-azobis(2-methylpropionitrile) (АО) с 25 мл метанола в стакан 250 мл. Погружать стакан в масляной ванне 60 ° C, а затем энергично перемешать смесь с баром перемешать до полного растворения Динитрила.</li>
		<li>Фильтр теплым раст?...

<ol>
	<li>Johnsson, B., L&#246;f&#229;s, S., Lindquist, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilization+of+proteins+to+a+carboxymethyldextran-modified+gold+surface+for+biospecific+interaction+analysis+in+surface+plasmon+resonance+sensors.">Immobilization of proteins to a carboxymethyldextran-modified gold surface for biospecific interaction analysis in surface plasmon resonance sensors.</a> Analytical Biochemistry. 198 (2), 268-277 (1991).</li><li>Kurzawa, C., Hengstenberg, A., Schuhmann, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilization+method+for+the+preparation+of+biosensors+based+on+pH+shift-induced+deposition+of+biomolecule-containing+polymer+films.">Immobilization method for the preparation of biosensors based on pH shift-induced deposition of biomolecule-containing polymer films.</a> Analytical Chemistry. 74 (2), 355-361 (2002).</li><li>You, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+identification+of+proteins+using+nanoparticle-fluorescent+polymer+'chemical+nose'+sensors.">Detection and identification of proteins using nanoparticle-fluorescent polymer 'chemical nose' sensors.</a> Nature Nanotechnology. 2 (5), 318-323 (2007).</li><li>Roberts, M. W., Ongkudon, C. M., Forde, G. M., Danquah, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatility+of+polymethacrylate+monoliths+for+chromatographic+purification+of+biomolecules.">Versatility of polymethacrylate monoliths for chromatographic purification of biomolecules.</a> Journal of Separation Science. 32 (15-16), 2485-2494 (2009).</li><li>Sandison, M. E., Cumming, S. A., Kolch, W., Pitt, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On-chip+immunoprecipitation+for+protein+purification.">On-chip immunoprecipitation for protein purification.</a> Lab on a Chip. 10 (20), 2805-2813 (2010).</li><li>Das, A., Theato, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activated+Ester+Containing+Polymers:+Opportunities+and+Challenges+for+the+Design+of+Functional+Macromolecules.">Activated Ester Containing Polymers: Opportunities and Challenges for the Design of Functional Macromolecules.</a> Chemical Reviews. 116 (3), 1434-1495 (2016).</li><li>Choi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functionalization+and+patterning+of+reactive+polymer+brushes+based+on+surface+reversible+addition+and+fragmentation+chain+transfer+polymerization.">Functionalization and patterning of reactive polymer brushes based on surface reversible addition and fragmentation chain transfer polymerization.</a> Journal of Polymer Science Part A: Polymer Chemistry. 50 (19), 4010-4018 (2012).</li><li>Kessler, D., Jochum, F. D., Choi, J., Char, K., Theato, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+surface+coatings+based+on+polysilsesquioxanes:+universal+method+toward+light-responsive+surfaces.">Reactive surface coatings based on polysilsesquioxanes: universal method toward light-responsive surfaces.</a> ACS Applied Materials &amp; Interfaces. 3 (2), 124-128 (2011).</li><li>Son, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Penetration+and+exchange+kinetics+of+primary+alkyl+amines+applied+to+reactive+poly(pentafluorophenyl+acrylate)+thin+films.">Penetration and exchange kinetics of primary alkyl amines applied to reactive poly(pentafluorophenyl acrylate) thin films.</a> Polymer Journal. 48 (4), 487-495 (2016).</li><li>Kessler, D., Roth, P. J., Theato, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+surface+coatings+based+on+polysilsesquioxanes:+controlled+functionalization+for+specific+protein+immobilization.">Reactive surface coatings based on polysilsesquioxanes: controlled functionalization for specific protein immobilization.</a> Langmuir. 25 (17), 10068-10076 (2009).</li><li>Kessler, D., Theato, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+surface+coatings+based+on+polysilsesquioxanes:+defined+adjustment+of+surface+wettability.">Reactive surface coatings based on polysilsesquioxanes: defined adjustment of surface wettability.</a> Langmuir. 25 (24), 14200-14206 (2009).</li><li>Kessler, D., Nilles, K., Theato, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modular+approach+towards+multi-functional+surfaces+with+adjustable+and+dual-responsive+wettability+using+a+hybrid+polymer+toolbox.">Modular approach towards multi-functional surfaces with adjustable and dual-responsive wettability using a hybrid polymer toolbox.</a> Journal of Materials Chemistry. 19 (43), 8184-8189 (2009).</li><li>Eberhardt, M., Mruk, R., Zentel, R., Theato, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+pentafluorophenyl(meth)acrylate+polymers:+new+precursor+polymers+for+the+synthesis+of+multifunctional+materials.">Synthesis of pentafluorophenyl(meth)acrylate polymers: new precursor polymers for the synthesis of multifunctional materials.</a> European Polymer Journal. 41 (7), 1569-1575 (2005).</li><li>Jochum, F. D., Forst, F. R., Theato, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PNIPAM+copolymers+containing+light-responsive+chromophores:+a+method+toward+molecular+logic+gates.">PNIPAM copolymers containing light-responsive chromophores: a method toward molecular logic gates.</a> Macromolecular Rapid Communications. 31 (16), 1456-1461 (2010).</li><li>Schattling, P., Pollmann, I., Theato, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+CO2-responsive+polymers+by+post-polymerization+modification.">Synthesis of CO2-responsive polymers by post-polymerization modification.</a> Reactive &amp; Functional Polymers. 75, 16-21 (2014).</li><li>He, L., Szameit, K., Zhao, H., Hahn, U., Theato, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postpolymerization+modification+using+less+cytotoxic+activated+ester+polymers+for+the+synthesis+of+biological+active+polymers.">Postpolymerization modification using less cytotoxic activated ester polymers for the synthesis of biological active polymers.</a> Biomacromolecules. 15 (8), 3197-3205 (2014).</li><li>Arnold, R. M., McNitt, C. D., Popik, V. V., Locklin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+grafting+of+poly(pentafluorophenyl+acrylate)+onto+oxides:+versatile+substrates+for+reactive+microcapillary+printing+and+self-sorting+modification.">Direct grafting of poly(pentafluorophenyl acrylate) onto oxides: versatile substrates for reactive microcapillary printing and self-sorting modification.</a> Chemical Communications. 50 (40), 5307-5309 (2014).</li><li>Son, H., Ku, J., Kim, Y., Li, S., Char, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amine-Reactive+Poly(pentafluorophenyl+acrylate)+Brush+Platforms+for+Cleaner+Protein+Purification.">Amine-Reactive Poly(pentafluorophenyl acrylate) Brush Platforms for Cleaner Protein Purification.</a> Biomacromolecules. 19 (3), 951-961 (2018).</li><li>Cullen, S. E., Schwartz, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+for+isolation+of+H-2+and+Ia+alloantigens+with+immunoprecipitation+induced+by+protein+A-bearing+staphylococci.">An improved method for isolation of H-2 and Ia alloantigens with immunoprecipitation induced by protein A-bearing staphylococci.</a> The Journal of Immunology. 117 (1), 136-142 (1976).</li><li>Sisson, T. H., Castor, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+for+immobilizing+IgG+antibodies+on+protein+A-agarose.">An improved method for immobilizing IgG antibodies on protein A-agarose.</a> Journal of Immunology Methods. 127 (2), 215-220 (1990).</li><li>Peritz, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoprecipitation+of+mRNA-protein+complexes.">Immunoprecipitation of mRNA-protein complexes.</a> Nature Protocols. 1 (2), 577-580 (2006).</li><li>Zhang, Z., Chen, S., Jiang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual-functional+biomimetic+materials:+nonfouling+poly+(carboxybetaine)+with+active+functional+groups+for+protein+immobilization.">Dual-functional biomimetic materials: nonfouling poly (carboxybetaine) with active functional groups for protein immobilization.</a> Biomacromolecules. 7 (12), 3311-3315 (2006).</li><li>Yao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NHS-ester+functionalized+poly(PEGMA)+brushes+on+silicon+surface+for+covalent+protein+immobilization.">NHS-ester functionalized poly(PEGMA) brushes on silicon surface for covalent protein immobilization.</a> Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 66 (2), 233-239 (2008).</li><li>Ma, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Facile+fabrication+of+microsphere-polymer+brush+hierarchically+three-dimensional+(3D)+substrates+for+immunoassays.">Facile fabrication of microsphere-polymer brush hierarchically three-dimensional (3D) substrates for immunoassays.</a> Chemical Communications. 51 (31), 6749-6752 (2015).</li><li>Chong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thiocarbonylthio+compounds+[SC+(Ph)+S&#8722;+R]+in+free+radical+polymerization+with+reversible+addition-fragmentation+chain+transfer+(RAFT+Polymerization).+Role+of+the+free-radical+leaving+group+(R).">Thiocarbonylthio compounds [SC (Ph) S&#8722; R] in free radical polymerization with reversible addition-fragmentation chain transfer (RAFT Polymerization). Role of the free-radical leaving group (R).</a> Macromolecules. 36 (7), 2256-2272 (2003).</li><li>Jochum, F. D., Theato, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature-+and+Light-Responsive+Polyacrylamides+Prepared+by+a+Double+Polymer+Analogous+Reaction+of+Activated+Ester+Polymers.">Temperature- and Light-Responsive Polyacrylamides Prepared by a Double Polymer Analogous Reaction of Activated Ester Polymers.</a> Macromolecules. 42 (16), 5941-5945 (2009).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+The+Western+Blot.">Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot.</a> JoVE. , (2018).</li><li>Chua, G. B. H., Roth, P. J., Duong, H. T. T., Davis, T. P., Lowe, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+Thermoresponsive+Solution+Properties+of+Poly[oligo(ethylene+glycol)+(meth)acrylamide]s:+Biocompatible+PEG+Analogues.">Synthesis and Thermoresponsive Solution Properties of Poly[oligo(ethylene glycol) (meth)acrylamide]s: Biocompatible PEG Analogues.</a> Macromolecules. 45 (3), 1362-1374 (2012).</li></ol>

Синтез poly(PFPA) привитые SiO2 бусины иллюстрируется на рисунке 1. Используя APTES как компоновщик молекулы, poly(PFPA) щетки ковалентно привитыми к SiO2 субстрата может быть подготовлен через простой двухэтапный процесс. Хотя некоторые подразделения ПРМ приносятся в жер?...

Реактивные полимерной щетки получили большой интерес в последние годы. Они могут быть использованы для иммобилизации функциональные молекулы органических или неорганических материалов для создания активированных поверхностей с приложениями в таких областях, как обнаружение и разделения1,2,3,4, 5. Среди полимеров сообщили содержащие пентафторфенилгидразин эфира единицы являются особенно полезными ввиду их высокой реактивности с аминами и стойкость к гидролизу6. Один из таких полимеров является poly(PFPA), и она может быть легко функционализированных после полимеризации с молекул, содержащих первичных или вторичных аминов7,8,9,10. Одним из примеров poly(PFPA) щетки были прореагировало с амино spiropyrans для создания поверхности свет отзывчивым7.
Подготовка poly(PFPA) и его приложений были описаны в ряде предыдущих публикаций6,,78,9,10,11,12 ,13,14,,1516,17. В частности Theato и коллеги сообщили синтез poly(PFPA) щетки через «прививки» и «прививки от «методы7,8,10,11,12 . В «прививки» подход, поли (methylsilsesquioxane)-поли (пентафторфенилгидразин акрилатные) (poly(MSSQ-PFPA)) гибридный полимер был синтезированных8,10,,1112. Компонент poly(MSSQ) был в состоянии формы сильная адгезия с рядом различных органических и неорганических поверхностей, таким образом позволяя poly(PFPA) компонент для формирования кистью слой на поверхности с покрытием материала. В «прививки от «подход, поверхность начато реверсивные сложения и фрагментации цепной передачи (SI-плот) полимеризации был нанят подготовить poly(PFPA) щетки7. В этом случае агент передачи поверхности иммобилизованных цепи (SI-CTA) был впервые ковалентно присоединяется к подложке через кремний силана реакции. Иммобилизованных SI-CTA затем участвовала в SI-плот полимеризации мономеров Стихийного, генерации плотно упакованных poly(PFPA) щетки с стабильной ковалентная связь к подложке.
Используя кисти poly(PFPA), синтезированных через SI-плот полимеризации, мы недавно продемонстрировали иммобилизации антител на poly(PFPA) привитые частиц кремнезема и их последующего применения в очистки белков18. Использование poly(PFPA) щетки для иммобилизации антитело было обнаружено решить ряд вопросов, связанных с текущей разделение белков через IP. Обычные IP основывается на использовании белка A/G как компоновщик для антитела иммобилизации19,,2021. Поскольку использование белка A/G позволяет антитела к быть присоединен с конкретной ориентации, высокие цели антигена восстановления эффективность достигается. Однако использование белка A/G страдает от неспецифических белков взаимодействия, а также потеря антител при восстановлении белка, оба из которых способствуют высокий уровень фонового шума. Для устранения этих недостатков, прямые сшивки антител к твердой поддержки был изучены22,,23-24. Эффективность таких методов обычно низка из-за случайной ориентации crosslinked антителами. Для poly(PFPA) привитые субстрата иммобилизация антител является постоянным, благодаря реакции обмена между подразделениями ПРМ и Амин функциональности на антитела. Хотя антитела ориентации по-прежнему случайных, система преимущества при использовании многих реактивной ПРМ сайты, управляемые по степени полимеризации. Кроме того мы показали, что путем частичной замены ПРМ единиц с амино PEG, гидрофильность поверхности могут быть настроены, дальнейшего повышения эффективности белка восстановления системы18. В целом частиц кремнезема poly(PFPA) привитые были продемонстрированы быть эффективной альтернативой традиционным IP с разумной эффективности, а также много чистых фона.
В этот вклад мы сообщаем альтернативный метод для подготовки poly(PFPA) привитые поверхность для иммобилизации антитела и IP приложения. В простой двухэтапный процесс, как показано на рисунке 1, молекула APTES компоновщика сначала осаждается на поверхности кремния, то poly(PFPA) полимер ковалентно прикрепляется к молекуле компоновщик через реакции между ПРМ единиц на полимерные и Амин функции на APTES. Этот метод подготовки позволяет постоянным сшивки poly(PFPA) к поверхности субстрата, но избегает многих осложнений, связанных с SI-CTA синтеза и SI-плот полимеризации poly(PFPA) кистей. Можно по-прежнему выполняться частичного замещения ПРМ единиц с амино PEG, позволяет тонкой настройки свойств поверхности кисти полимера. Мы покажем, poly(PFPA) привитые кремнезема бусы подготовленный таким образом может быть прикол с антителами и используется для обогащения белка через IP. Процедура подготовки подробных шарик, антитела иммобилизации и IP тестирования документируются в этой статье, для читателей, заинтересованных в поисках альтернативы обычного белка A/G на основе IP.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2,2-Azobisisobutyronitrile, 99%</td>
			<td>Daejung Chemicals</td>
			<td>1102-4405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl alcohol for HPLC, 99.9%</td>
			<td>Duksan Pure Chemicals</td>
			<td>d62</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmagnesium bromide solution 1.0&#160;M in THF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>331376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon disulfide anhydrous, &#8805;99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>335266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzyl bromide, 98%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B17905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petroleum ether, 90%</td>
			<td>Samchun Chemicals</td>
			<td>P0220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl ether, 99%</td>
			<td>Daejung Chemicals</td>
			<td>4025-4404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate anhydrous, powder,&#160;99%</td>
			<td>Daejung Chemicals</td>
			<td>5514-4405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentafluorophenyl acrylate</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-264001</td>
			<td>contains inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium oxide, activated, basic, Brockmann I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>199443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Daejung Chemicals</td>
			<td>7548-4400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anisole anhydrous, 99.7%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>296295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica nanoparticle</td>
			<td>Microparticles GmbH</td>
			<td>SiO2-R-0.7</td>
			<td>5% w/v aqueous suspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Aminopropyltrimethoxysilane, &#62;96.0%</td>
			<td>Tokyo Chemical Industry</td>
			<td>T1255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide for HPLC, &#8805;99.7%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34869</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amino-terminated poly(ethylene glycol) methyl ether</td>
			<td>Polymer Source</td>
			<td>P16082-EGOCH3NH2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline tablet</td>
			<td>Takara</td>
			<td>T9181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>9480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl (pH 8.0)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9855G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9640G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40</td>
			<td>VWR</td>
			<td>E109-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15514-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Biosesang</td>
			<td>D1037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor</td>
			<td>Merck</td>
			<td>535140-1MLCN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromo phenol blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B5525-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl (pH 6.8)</td>
			<td>Biosolution</td>
			<td>BT033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Biosolution</td>
			<td>BS003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21985-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PKR Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>12297S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH Antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-32233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Rabbit IgG</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>2729S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa</td>
			<td>Korea Cell Line Bank</td>
			<td>10002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>DAIHAN Scientific</td>
			<td>WUC-D10H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonicator</td>
			<td>BMBio</td>
			<td>BR2006A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge I</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge II</td>
			<td>LABOGENE</td>
			<td>1736R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator</td>
			<td>FINEPCR</td>
			<td>ROTATOR/AG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum oven</td>
			<td>DAIHAN Scientific</td>
			<td>ThermoStable OV-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel permeation chromatography (THF)</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>1260 Infinity II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-ray photoelectron spectrometer</td>
			<td>Thermo VG Scientific</td>
			<td>Sigma Probe</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynamic light scattering</td>
			<td>Malvern Instruments</td>
			<td>ZEN 3690</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of poly(pentafluorophenyl acrylate) functionalized sio2 beads for protein purification

Мы демонстрируем простой способ подготовить поли (пентафторфенилгидразин акрилатные) (poly(PFPA)) привитые кремнезема Бусины для иммобилизации антитела и последующих иммунопреципитации (IP) приложения. Poly(PFPA) привитые поверхность готова через простой двухэтапный процесс. На первом шаге как компоновщик молекулы на поверхности кремния осаждается 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES). На втором шаге, poly(PFPA) гомополимер, синтезированных через реверсивный сложения и фрагментации цепной передачи (РАФТ) полимеризации, является привитыми к молекуле компоновщик через реакции обмена между пентафторфенилгидразин (ПРМ) единиц на полимерные и амины группы на APTES. Осаждения APTES и poly(PFPA) на кремний частицы являются подтверждается Рентгеновская фотоэлектронная спектроскопия (XPS), а также контролируется изменения размера частиц измеряется через Динамическое рассеяние света (DLS). Для улучшения поверхности гидрофильность бусы, частичная замена poly(PFPA) с Амин функционализированных poly(ethylene glycol) также производится (амино PEG). ПЭГ замещенных poly(PFPA) привитые кремнезема, который бусины затем прикол с антитела для IP приложения. Для демонстрации занятых антитело против протеинкиназы РНК активированный (PKR), и эффективность IP определяется Западный blotting. Результаты анализа показывают, что бусины иммобилизованные антитела действительно может использоваться для обогащения PKR, в то время как неспецифический белковых взаимодействий являются минимальными.

Схема для подготовки poly(PFPA) привитые SiO2 бусины, с или без ПЭГ замены показан на рисунке 1. Для контроля за APTES и poly(PFPA), прививки процесса, голые SiO2 бусины, APTES функционализированных SiO2 бусины, и poly(PFPA) привитые SiO2 бусины характеризуют...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Polypentafluorophenyl acrylate Functionalized SiO2 Beads for Protein Purification at JoVE.com

Preparation of Polypentafluorophenyl acrylate Functionalized SiO2 Beads for Protein Purification

Протокол для подготовки поли (пентафторфенилгидразин акрилатные) (poly(PFPA)) привитые кремнезема бусины представлены. Функционализированных поверхность poly(PFPA) затем прикол с антителами и успешно используется для разделения белков через иммунопреципитации.

Подготовка Poly(pentafluorophenyl acrylate) функционализированных SiO2 бусины очищение протеина

We demonstrate a simple method to prepare poly(pentafluorophenyl acrylate) (poly(PFPA)) grafted silica beads for antibody immobilization and subsequent ...

Этот метод может быть использован для подготовки биомолекулы активированных поверхностей, которые имеют применение в таких областях, как доставка наркотиков, биологическое обнаружение цели, и био разделения. Основным преимуществом этого метода является то, что кисти поли PFPA очень реактивны с аминами, и иммобилизация антител достигается путем инкубации в буферном растворе в течение нескольких часов. Последствия этого метода распространяются на очищение белка путем иммунопрофилизации, так как иммобилизованные антитела могут успешно связываться с целевыми антигенами.Хотя этот метод демонстрирует мобилизацию антител и очищение белка, он также может быть применен к другим системам, требующим биомолекулярной мобилизации. Для лечения диоксида кремния шарики с APTES, сначала получить частицы диоксида кремния в виде 5%weight объем aqueous подвески. Смешайте 0,8 миллилитров подвески диоксида кремния с 40 миллиграммами APTES и восемью миллилитров метанола в 20-миллилитровом сцинтилляционном флаконе, оснащенном батончиком для перемешивания.Разрешить реакцию, чтобы продолжить при комнатной температуре в течение пяти часов с энергичным перемешиванием. Через пять часов перенесите раствор в коническую трубку. Чтобы изолировать функционализированные бусинки диоксида силикона, центрифуга раствора на 10 000 Г в течение пяти минут.Затем удалите супернатант. Теперь мыть бисер, переочистив их в три миллилитров свежего метанола. Встряхните трубку вручную для смешивания, но при необходимости, улучшить дисперсию с помощью sonication в водяной бане в течение нескольких секунд.Центрифуга, как и прежде, и повторить шаг мыть еще раз. Комбинат метанола мыть силиконовый диоксид бисера с тремя миллилитров диметилсуфсид, или DMSO. Встряхните смесь вручную, или, при необходимости, sonicate в течение нескольких секунд, пока шарики полностью рассеяны в DMSO.После центрифугации раньше, удалить супернатант. Повторите шаг центрифуги в последний раз, чтобы обеспечить полный обмен растворителя от метанола до DMSO. Чтобы подготовить раствор поли ПФПА, растворите 20 миллиграммов поли ПФПА в двух миллилитров DMSO в 20 миллилитров сцинтилляционного флакона.Чтобы подготовить раствор PEG, растворите амин функционализированный ПЭГ в одном миллилитре DMSO. Теперь перенесите решение PEG на раствор poly PFPA. Реагируть при комнатной температуре в течение одного часа с энергичным перемешиванием.Перенесите один миллилитр функционализированных бусинок диоксида кремния APTES, подвешенных в DMSO, в раствор PEG, заменяемый поли PFPA. Разрешить прививки между поли PFPA и APTES функционализированных бусинок диоксида кремния, чтобы продолжить при комнатной температуре в течение одного часа с энергичным перемешиванием. Затем изолировать бисер центрифугой при 10 000 Г в течение пяти минут, а затем удаление супернатанта.Вымойте бисер, добавив три миллилитров DMSO, и перемешать вручную или с помощью нескольких секунд sonication. Центрифуга бисера, как и раньше. И удалить супернатант, прежде чем повторить DMSO мыть дважды.Вымойте бисер в два раза больше с тремя миллилитров тройной дистиллированной воды. Затем смешайте вручную или с помощью нескольких секунд звуковой связи. Центрифуга бисера, как и раньше, и удалить супернатант.Наконец высушите бисер при температуре 40 градусов по Цельсию в вакуумной печи на ночь. Добавьте пять миллиграммов поли PFPA привитых бусин диоксида кремния в 1,5 миллилитров микроцентрифуг трубки. Вымойте бисер, добавив 800 микролитров PBS, и хорошо перемешать вихрем.Центрифуга бисера при температуре 10 000 Г при комнатной температуре в течение одной минуты. Удалите супернатант и повторите шаг мытья три раза. Теперь добавьте 350 микролитров свежего PBS, 50 микролитров 0,1%PBST и 6,67 микрограмма антител.Инкубировать около 20 часов на ротатор при четырех градусах по Цельсию. На следующий день, мыть бисер и центрифугу при 400 G и четыре градуса по Цельсию в течение одной минуты. Затем удалите супернатант и аккуратно добавьте 400 микролитров буфера лиза.Аккуратно resuspend шарики путем pipetting вверх и вниз пять раз. Повторите этот шаг мытья три раза. После окончательной стирки удалите как можно больше супернатанта.Подготовка ячеек и буфера лиза, как описано в текстовом протоколе. Затем повторно посовещение клеточной гранулы с 400 микролитров буфера лиза. Sonicate клетки с помощью ультра sonicator.После звуковой, вихрь кратко. Затем центрифуга лисировать при 20 000 Г при четырех градусах по Цельсию в течение 10 минут. Перенесите супернатант в новую, 1,5 миллилитровую центрифугу.Для выполнения иммунопреципиентации перенесите 300 микролитров клеточного лизата на ранее подготовленные антитела иммобилизованных поли ПФПА, привитых бусинками диоксида кремния. Сохраните 30 микролитров лизайта клетки в качестве входного образца в новой микроцентрифугной трубке. Инкубировать смесь лисатных бусин в течение трех часов на ротатор при четырех градусах по Цельсию.После инкубации центрифуга смеси при 400 Г при четырех градусах цельсия в течение одной минуты. Удалите супернатант и аккуратно добавьте 400 микролитров буфера для мытья. Аккуратно resuspend шарики по трубопроводу вверх и вниз около пяти раз.После трех моет, удалить как можно больше супернатантов, как это возможно. Добавьте 30 микролитров 2x SDS погрузочного красителя в бисер и в образец ввода. Затем нагрейте их в течение 10 минут при температуре 95 градусов по Цельсию.После нагрева проанализируйте образец с помощью западного blotting, или хранить образец при минус 20 градусов по Цельсию. Функциональные бусинки кремнезема изучаются рентгеновской фотоэлектроно-спектроскопией, или XPS, для определения состава поверхности. Репрезентативные данные XPS показаны здесь.После лечения APTES, пик азота 1s, связанный с зоной группы амина APTES обнаруживается. После поли PFPA лечения, фтор 1s пик, связанный с PFP единиц на полимере обнаруживается. Белка киназы РНК активирована, или PKR обогащения через иммунопреципиентации выполняется, и ссылаются образца белка анализируются с помощью западных blotting.Как и ожидалось, бисер обездвижен без антител, или неспецифические антитела mixuture показать не PKR восстановления. Бисер, инкубированный анти-PKR, может успешно обогатить PKR, о чем свидетельствует наличие группы PKR и отсутствие группы GAPDH. При попытке этой процедуры, важно помнить, что при сравнении систем, IP эксперименты, а также последующий западный анализ blotting должно быть сделано одновременно.После его разработки этот метод можно использовать для иммобилизации различных биомолекулярных или материальных субстратов. Кроме того, этот метод имеет дополнительное преимущество настройки только поверхностного свойства, которое должно быть адаптировано в соответствии с потребностью каждого приложения.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Preparation of Poly(pentafluorophenyl acrylate) Functionalized SiO2 Beads for Protein Purification

Synthesis and Characterization of Functionalized Metal-organic Frameworks

Синтеза и характеристики функционализированным Металл-органические каркасы

Metal-organic frameworks have attracted extraordinary amounts of research attention, as they are attractive candidates for numerous industrial and ...

Microbubble Fabrication of Concave-porosity PDMS Beads

Микросепаратор Изготовление вогнутая пористости PDMS шариков

Microbubble fabrication (by use of a fine emulsion) provides a means of increasing the surface-area-to-volume (SAV) ratio of polymer materials, which is ...

Immobilization of Multi-biocatalysts in Alginate Beads for Cofactor Regeneration and Improved Reusability

Иммобилизация Multi-биокатализаторов в альгинатные гранулы для регенерации кофактора и улучшены возможности повторного использования

We have recently developed a simple, reusable and coupled whole-cell biocatalytic system with the capability of cofactor regeneration and biocatalyst ...

Preparation of a Corannulene-functionalized Hexahelicene by Copper(I)-catalyzed Alkyne-azide Cycloaddition of Nonplanar Polyaromatic Units

Preparation of a Corannulene-functionalized Hexahelicene by CopperI-catalyzed Alkyne-azide Cycloaddition of Nonplanar Polyaromatic Units

Получение коранулен-функционализированного Hexahelicene по меди (I) -catalyzed алкине-азида циклоприсоединения непланарной полиароматических единиц

The main purpose of this video is to show 6 reaction steps of a convergent synthesis and prepare a complex molecule containing up to three nonplanar ...

The Effect of Interfacial Chemical Bonding in TiO2-SiO2 Composites on Their Photocatalytic NOx Abatement Performance

The Effect of Interfacial Chemical Bonding in TiO2-SiO2 Composites on Their Photocatalytic NOx Abatement Performance

Влияние межфазного химического связывания в TiO<sub&gt; 2</sub&gt; -SiO<sub&gt; 2</sub&gt; Композиты на их фотокаталитической эффективности по снижению выбросов NOx

The chemical bonding of particulate photocatalysts to supporting material surfaces is of great importance in engineering more efficient and practical ...

Methionine Functionalized Biocompatible Block Copolymers for Targeted Plasmid DNA Delivery

Метионин функционально совместимые биосовместимые блок кополимеры для целевой плазмидной доставки ДНК

Reversible addition-fragmentation chain transfer (RAFT) polymerization integrates the advantages of radical polymerization and living polymerization. This ...

Efficient Synthesis of All-Carbon Quaternary Centers via the Conjugate Addition of Functionalized Monoorganozinc Bromides

Эффективный синтез всех углеродных четвертичных центров через сопряженное Добавление функционализированных Моноорганоцинк бромиды

The conjugate addition of organometallic reagents to &#945;,&#946;-unsaturated carbonyls represents an important method to generate C&#8211;C bonds in the ...

Organic Solvent-Based Protein Precipitation for Robust Proteome Purification Ahead of Mass Spectrometry

Осаждение белка на основе органических растворителей для надежной очистки протеома перед масс-спектрометрией

While multiple advances in mass spectrometry (MS) instruments have improved qualitative and quantitative proteome analysis, more reliable front-end ...

Porphyrin-Modified Beads in Flow Cytometry

Porphyrin-Modified Beads for Use as Compensation Controls in Flow Cytometry

Porphyrin-Modified Beads for Use as Compensation Controls in Flow Cytometry (Video) | JoVE 

Гранулы, модифицированные порфирином, для использования в качестве компенсационного контроля в проточной цитометрии

Flow cytometry can rapidly characterize and quantify diverse cell populations based on fluorescence measurements. The cells are first stained with one or ...