Name: preparation of poly(pentafluorophenyl acrylate) functionalized sio2 beads for protein purification
Uploaded: 2018-11-19T14:00:00
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Este trabajo fue financiado por la Agencia para el desarrollo de defensa (Grant no. UD170039ID).

1. preparación de homopolímero de Poly(PFPA)
<ol><li>Recristalización de AIBN<ol>
<li>5 g de 2,2'-azobis(2-methylpropionitrile) (AIBN) se combinan con 25 mL de metanol en un matraz de 250 mL. Sumerja el vaso en un baño de aceite de 60 ° C, luego agitar vigorosamente la mezcla con una barra de agitación hasta que se haya disuelto completamente AIBN.</li>
		<li>Filtrar la solución caliente a través de papel filtro (retención de partículas de 5-8 μm) y guardar el filtrado a 4 ° C para permitir que los cristale...

<ol>
	<li>Johnsson, B., L&#246;f&#229;s, S., Lindquist, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilization+of+proteins+to+a+carboxymethyldextran-modified+gold+surface+for+biospecific+interaction+analysis+in+surface+plasmon+resonance+sensors.">Immobilization of proteins to a carboxymethyldextran-modified gold surface for biospecific interaction analysis in surface plasmon resonance sensors.</a> Analytical Biochemistry. 198 (2), 268-277 (1991).</li><li>Kurzawa, C., Hengstenberg, A., Schuhmann, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilization+method+for+the+preparation+of+biosensors+based+on+pH+shift-induced+deposition+of+biomolecule-containing+polymer+films.">Immobilization method for the preparation of biosensors based on pH shift-induced deposition of biomolecule-containing polymer films.</a> Analytical Chemistry. 74 (2), 355-361 (2002).</li><li>You, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+identification+of+proteins+using+nanoparticle-fluorescent+polymer+'chemical+nose'+sensors.">Detection and identification of proteins using nanoparticle-fluorescent polymer 'chemical nose' sensors.</a> Nature Nanotechnology. 2 (5), 318-323 (2007).</li><li>Roberts, M. W., Ongkudon, C. M., Forde, G. M., Danquah, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatility+of+polymethacrylate+monoliths+for+chromatographic+purification+of+biomolecules.">Versatility of polymethacrylate monoliths for chromatographic purification of biomolecules.</a> Journal of Separation Science. 32 (15-16), 2485-2494 (2009).</li><li>Sandison, M. E., Cumming, S. A., Kolch, W., Pitt, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On-chip+immunoprecipitation+for+protein+purification.">On-chip immunoprecipitation for protein purification.</a> Lab on a Chip. 10 (20), 2805-2813 (2010).</li><li>Das, A., Theato, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activated+Ester+Containing+Polymers:+Opportunities+and+Challenges+for+the+Design+of+Functional+Macromolecules.">Activated Ester Containing Polymers: Opportunities and Challenges for the Design of Functional Macromolecules.</a> Chemical Reviews. 116 (3), 1434-1495 (2016).</li><li>Choi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functionalization+and+patterning+of+reactive+polymer+brushes+based+on+surface+reversible+addition+and+fragmentation+chain+transfer+polymerization.">Functionalization and patterning of reactive polymer brushes based on surface reversible addition and fragmentation chain transfer polymerization.</a> Journal of Polymer Science Part A: Polymer Chemistry. 50 (19), 4010-4018 (2012).</li><li>Kessler, D., Jochum, F. D., Choi, J., Char, K., Theato, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+surface+coatings+based+on+polysilsesquioxanes:+universal+method+toward+light-responsive+surfaces.">Reactive surface coatings based on polysilsesquioxanes: universal method toward light-responsive surfaces.</a> ACS Applied Materials &amp; Interfaces. 3 (2), 124-128 (2011).</li><li>Son, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Penetration+and+exchange+kinetics+of+primary+alkyl+amines+applied+to+reactive+poly(pentafluorophenyl+acrylate)+thin+films.">Penetration and exchange kinetics of primary alkyl amines applied to reactive poly(pentafluorophenyl acrylate) thin films.</a> Polymer Journal. 48 (4), 487-495 (2016).</li><li>Kessler, D., Roth, P. J., Theato, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+surface+coatings+based+on+polysilsesquioxanes:+controlled+functionalization+for+specific+protein+immobilization.">Reactive surface coatings based on polysilsesquioxanes: controlled functionalization for specific protein immobilization.</a> Langmuir. 25 (17), 10068-10076 (2009).</li><li>Kessler, D., Theato, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+surface+coatings+based+on+polysilsesquioxanes:+defined+adjustment+of+surface+wettability.">Reactive surface coatings based on polysilsesquioxanes: defined adjustment of surface wettability.</a> Langmuir. 25 (24), 14200-14206 (2009).</li><li>Kessler, D., Nilles, K., Theato, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modular+approach+towards+multi-functional+surfaces+with+adjustable+and+dual-responsive+wettability+using+a+hybrid+polymer+toolbox.">Modular approach towards multi-functional surfaces with adjustable and dual-responsive wettability using a hybrid polymer toolbox.</a> Journal of Materials Chemistry. 19 (43), 8184-8189 (2009).</li><li>Eberhardt, M., Mruk, R., Zentel, R., Theato, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+pentafluorophenyl(meth)acrylate+polymers:+new+precursor+polymers+for+the+synthesis+of+multifunctional+materials.">Synthesis of pentafluorophenyl(meth)acrylate polymers: new precursor polymers for the synthesis of multifunctional materials.</a> European Polymer Journal. 41 (7), 1569-1575 (2005).</li><li>Jochum, F. D., Forst, F. R., Theato, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PNIPAM+copolymers+containing+light-responsive+chromophores:+a+method+toward+molecular+logic+gates.">PNIPAM copolymers containing light-responsive chromophores: a method toward molecular logic gates.</a> Macromolecular Rapid Communications. 31 (16), 1456-1461 (2010).</li><li>Schattling, P., Pollmann, I., Theato, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+CO2-responsive+polymers+by+post-polymerization+modification.">Synthesis of CO2-responsive polymers by post-polymerization modification.</a> Reactive &amp; Functional Polymers. 75, 16-21 (2014).</li><li>He, L., Szameit, K., Zhao, H., Hahn, U., Theato, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postpolymerization+modification+using+less+cytotoxic+activated+ester+polymers+for+the+synthesis+of+biological+active+polymers.">Postpolymerization modification using less cytotoxic activated ester polymers for the synthesis of biological active polymers.</a> Biomacromolecules. 15 (8), 3197-3205 (2014).</li><li>Arnold, R. M., McNitt, C. D., Popik, V. V., Locklin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+grafting+of+poly(pentafluorophenyl+acrylate)+onto+oxides:+versatile+substrates+for+reactive+microcapillary+printing+and+self-sorting+modification.">Direct grafting of poly(pentafluorophenyl acrylate) onto oxides: versatile substrates for reactive microcapillary printing and self-sorting modification.</a> Chemical Communications. 50 (40), 5307-5309 (2014).</li><li>Son, H., Ku, J., Kim, Y., Li, S., Char, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amine-Reactive+Poly(pentafluorophenyl+acrylate)+Brush+Platforms+for+Cleaner+Protein+Purification.">Amine-Reactive Poly(pentafluorophenyl acrylate) Brush Platforms for Cleaner Protein Purification.</a> Biomacromolecules. 19 (3), 951-961 (2018).</li><li>Cullen, S. E., Schwartz, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+for+isolation+of+H-2+and+Ia+alloantigens+with+immunoprecipitation+induced+by+protein+A-bearing+staphylococci.">An improved method for isolation of H-2 and Ia alloantigens with immunoprecipitation induced by protein A-bearing staphylococci.</a> The Journal of Immunology. 117 (1), 136-142 (1976).</li><li>Sisson, T. H., Castor, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+for+immobilizing+IgG+antibodies+on+protein+A-agarose.">An improved method for immobilizing IgG antibodies on protein A-agarose.</a> Journal of Immunology Methods. 127 (2), 215-220 (1990).</li><li>Peritz, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoprecipitation+of+mRNA-protein+complexes.">Immunoprecipitation of mRNA-protein complexes.</a> Nature Protocols. 1 (2), 577-580 (2006).</li><li>Zhang, Z., Chen, S., Jiang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual-functional+biomimetic+materials:+nonfouling+poly+(carboxybetaine)+with+active+functional+groups+for+protein+immobilization.">Dual-functional biomimetic materials: nonfouling poly (carboxybetaine) with active functional groups for protein immobilization.</a> Biomacromolecules. 7 (12), 3311-3315 (2006).</li><li>Yao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NHS-ester+functionalized+poly(PEGMA)+brushes+on+silicon+surface+for+covalent+protein+immobilization.">NHS-ester functionalized poly(PEGMA) brushes on silicon surface for covalent protein immobilization.</a> Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 66 (2), 233-239 (2008).</li><li>Ma, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Facile+fabrication+of+microsphere-polymer+brush+hierarchically+three-dimensional+(3D)+substrates+for+immunoassays.">Facile fabrication of microsphere-polymer brush hierarchically three-dimensional (3D) substrates for immunoassays.</a> Chemical Communications. 51 (31), 6749-6752 (2015).</li><li>Chong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thiocarbonylthio+compounds+[SC+(Ph)+S&#8722;+R]+in+free+radical+polymerization+with+reversible+addition-fragmentation+chain+transfer+(RAFT+Polymerization).+Role+of+the+free-radical+leaving+group+(R).">Thiocarbonylthio compounds [SC (Ph) S&#8722; R] in free radical polymerization with reversible addition-fragmentation chain transfer (RAFT Polymerization). Role of the free-radical leaving group (R).</a> Macromolecules. 36 (7), 2256-2272 (2003).</li><li>Jochum, F. D., Theato, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature-+and+Light-Responsive+Polyacrylamides+Prepared+by+a+Double+Polymer+Analogous+Reaction+of+Activated+Ester+Polymers.">Temperature- and Light-Responsive Polyacrylamides Prepared by a Double Polymer Analogous Reaction of Activated Ester Polymers.</a> Macromolecules. 42 (16), 5941-5945 (2009).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+The+Western+Blot.">Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot.</a> JoVE. , (2018).</li><li>Chua, G. B. H., Roth, P. J., Duong, H. T. T., Davis, T. P., Lowe, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+Thermoresponsive+Solution+Properties+of+Poly[oligo(ethylene+glycol)+(meth)acrylamide]s:+Biocompatible+PEG+Analogues.">Synthesis and Thermoresponsive Solution Properties of Poly[oligo(ethylene glycol) (meth)acrylamide]s: Biocompatible PEG Analogues.</a> Macromolecules. 45 (3), 1362-1374 (2012).</li></ol>

La síntesis de poly(PFPA) injertado SiO2 cuentas se ilustra en la figura 1. Mediante el empleo de APTES como molécula de vinculador, cepillos de poly(PFPA) covalente injertados a SiO2 substrato pueden prepararse mediante un proceso de dos pasos simples. Aunque algunas de las unidades de la PFP son sacrificados por la reacción con APTES, se espera que un gran número de las unidades de la PFP permanecer disponible para la reacción posterior con amino-PEG o anticuerpo...

Cepillos poliméricos reactivos han recibido mucho interés en los últimos años. Pueden ser utilizados para inmovilizar moléculas funcionales en materiales orgánicos o inorgánicos para crear superficies activadas con aplicaciones en áreas tales como detección y separación1,2,3,4, 5. Entre los polímeros reactivos registrados, los que contienen unidades de ester pentafluorophenyl son particularmente útiles debido a su alta reactividad con aminas y resistencia hacia la hidrólisis6. Un tal polímero es poly(PFPA), y puede ser fácilmente funcionalizada polimerización posterior con moléculas que contienen aminas primaria o secundaria7,8,9,10. Ejemplo, poly(PFPA) cepillos fueron reaccionados con amino-spiropyrans para crear superficies sensibles a la luz7.
La preparación de poly(PFPA) y sus aplicaciones se han descrito en un número de anteriores publicaciones6,7,8,9,10,11,12 ,13,14,15,16,17. En particular, Theato y colaboradores informaron la síntesis de poly(PFPA) cepillos a través de "injerto a" tanto "injerto de" métodos7,8,10,11,12 . En el "injerto a" enfoque, un poli (methylsilsesquioxane)-polivinílico (acrilato del pentafluorophenyl) (polímero híbrido de poly(MSSQ-PFPA)) fue sintetizado8,10,11,12. El componente de poly(MSSQ) fue capaz de adherencia fuerte forma con un número de diferentes superficies orgánicas e inorgánicas, permitiendo así que el componente poly(PFPA) formar una capa de pincel sobre la superficie del material cubierta. En el "injerto de" enfoque de superficie inició además reversible y polimerización de fragmentación cadena transferencia (SI-balsa) se empleó para preparar poly(PFPA) cepillos7. En este caso, un agente de transferencia de cadena inmovilizada de la superficie (SI-CTA) primero fue unido covalentemente al sustrato por reacción sílice-silano. El inmovilizado SI-CTA participó entonces en la polimerización de la SI-balsa de monómeros de la PFPA, generando poly(PFPA) densamente cepillos con enlace covalente estable al sustrato.
Mediante la utilización de los cepillos de poly(PFPA) sintetizados mediante polimerización SI-balsa, hemos demostrado recientemente la inmovilización de anticuerpos en las partículas de sílice poly(PFPA) injertado y su posterior aplicación en la purificación de la proteína18. El uso de cepillos poly(PFPA) para inmovilización de anticuerpos fue encontrado para resolver una serie de problemas asociados con la actual separación de las proteínas a través de IP. Convencional IP se basa en el uso de la proteína A/G como un enlazador para anticuerpo inmovilización19,20,21. Dado que el uso de la proteína A/G permite a los anticuerpos que se unirán con una orientación específica, se logra eficiencia de recuperación de antígeno blanco alto. Sin embargo, el uso de la proteína A/G sufre de interacción de la proteína no específica, así como la pérdida de anticuerpos durante la recuperación de la proteína, los cuales contribuyen a un alto nivel de ruido de fondo. Para resolver estas deficiencias, reticulación directo de los anticuerpos a un soporte sólido ha sido explorado22,23,24. La eficacia de estas técnicas es generalmente baja debido a la orientación aleatoria de los anticuerpos de reticulado. Para el substrato poly(PFPA) injertado, la inmovilización de anticuerpos es permanente, mediante la reacción de intercambio entre las unidades de la PFP y funcionalidad de Amina en anticuerpos. Aunque la orientación de anticuerpo es todavía aleatoria, el sistema se beneficia de tener muchos sitios PFP reactivos, controlables por el grado de polimerización. Además, demostramos que por sustitución parcial de unidades de la PFP con amino-PEG, hydrophilicity superficial puede ajustarse, mejorar la eficiencia de recuperación de proteína del sistema18. En general, las partículas de sílice poly(PFPA) injertadas mostraron ser una alternativa eficaz a IP tradicional con razonable eficiencia como mucho limpiador de fondo.
En esta contribución, se presenta un método alternativo para preparar superficie injertada poly(PFPA) para inmovilización de anticuerpos y la aplicación de la propiedad intelectual. En un proceso de dos pasos simples, como se ilustra en la figura 1, una molécula de vinculador APTES se deposita primero sobre la superficie de sílice, a continuación, el polímero de poly(PFPA) se une covalentemente a la molécula del vinculador mediante la reacción entre las unidades de la PFP en la polímero y las funciones de la amina en APTES. Este método de preparación permite el entrecruzamiento permanente de poly(PFPA) a una superficie del sustrato, pero evita muchas complicaciones asociadas a CTA SI síntesis y polimerización de la SI-balsa de poly(PFPA) cepillos. Sustitución parcial de las unidades de la PFP con amino-PEG puede aún realizarse, permitiendo ajuste de las propiedades superficiales del cepillo de polímeros. Nos muestran los granos de sílice poly(PFPA) injertado así preparados pueden ser inmovilizados con anticuerpos y utilizados para el enriquecimiento de proteínas vía IP. El procedimiento de una preparación detallada del grano, inmovilización de anticuerpos y pruebas de IP se documentan en este artículo, para los lectores interesados en la búsqueda de una alternativa a la proteína convencional A/G basado en IP.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2,2-Azobisisobutyronitrile, 99%</td>
			<td>Daejung Chemicals</td>
			<td>1102-4405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl alcohol for HPLC, 99.9%</td>
			<td>Duksan Pure Chemicals</td>
			<td>d62</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmagnesium bromide solution 1.0&#160;M in THF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>331376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon disulfide anhydrous, &#8805;99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>335266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzyl bromide, 98%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B17905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petroleum ether, 90%</td>
			<td>Samchun Chemicals</td>
			<td>P0220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl ether, 99%</td>
			<td>Daejung Chemicals</td>
			<td>4025-4404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate anhydrous, powder,&#160;99%</td>
			<td>Daejung Chemicals</td>
			<td>5514-4405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentafluorophenyl acrylate</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-264001</td>
			<td>contains inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium oxide, activated, basic, Brockmann I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>199443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Daejung Chemicals</td>
			<td>7548-4400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anisole anhydrous, 99.7%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>296295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica nanoparticle</td>
			<td>Microparticles GmbH</td>
			<td>SiO2-R-0.7</td>
			<td>5% w/v aqueous suspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Aminopropyltrimethoxysilane, &#62;96.0%</td>
			<td>Tokyo Chemical Industry</td>
			<td>T1255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide for HPLC, &#8805;99.7%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34869</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amino-terminated poly(ethylene glycol) methyl ether</td>
			<td>Polymer Source</td>
			<td>P16082-EGOCH3NH2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline tablet</td>
			<td>Takara</td>
			<td>T9181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>9480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl (pH 8.0)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9855G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9640G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40</td>
			<td>VWR</td>
			<td>E109-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15514-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Biosesang</td>
			<td>D1037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor</td>
			<td>Merck</td>
			<td>535140-1MLCN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromo phenol blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B5525-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl (pH 6.8)</td>
			<td>Biosolution</td>
			<td>BT033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Biosolution</td>
			<td>BS003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21985-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PKR Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>12297S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH Antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-32233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Rabbit IgG</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>2729S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa</td>
			<td>Korea Cell Line Bank</td>
			<td>10002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>DAIHAN Scientific</td>
			<td>WUC-D10H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonicator</td>
			<td>BMBio</td>
			<td>BR2006A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge I</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge II</td>
			<td>LABOGENE</td>
			<td>1736R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator</td>
			<td>FINEPCR</td>
			<td>ROTATOR/AG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum oven</td>
			<td>DAIHAN Scientific</td>
			<td>ThermoStable OV-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel permeation chromatography (THF)</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>1260 Infinity II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-ray photoelectron spectrometer</td>
			<td>Thermo VG Scientific</td>
			<td>Sigma Probe</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynamic light scattering</td>
			<td>Malvern Instruments</td>
			<td>ZEN 3690</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of poly(pentafluorophenyl acrylate) functionalized sio2 beads for protein purification

Demostrar un método simple para preparar polivinílico (acrilato del pentafluorophenyl) (poly(PFPA)) injertado granos de sílice para la inmovilización de anticuerpos y aplicación posterior de inmunoprecipitación (IP). La superficie injertada poly(PFPA) es preparada mediante un proceso de dos pasos simples. En el primer paso, 3 aminopropyltriethoxysilane (APTES) se deposita como una molécula de vinculador en la superficie de la sílice. En el segundo paso, poly(PFPA) homopolímero, sintetizado mediante la adición reversible y fragmentación cadena transferencia (balsa) la polimerización, se injerta a la molécula del vinculador mediante la reacción de intercambio entre las unidades del pentafluorophenyl (PFP) en el polímero y los grupos de la amina de APTES. La deposición de APTES y poly(PFPA) en el sílice partículas son confirmadas por espectroscopia de fotoelectrones de rayos x (XPS), así como supervisadas por el cambio de tamaño de partícula medido por dispersión dinámica de la luz (DLS). (Amino-PEG) también se realiza para mejorar el hydrophilicity superficial de los granos, sustitución parcial de poly(PFPA) con poly(ethylene glycol) amine functionalized. La poly(PFPA) PEG-sustituido injertado silicona granos luego se inmovilizan con anticuerpos para el uso de IP. Para la demostración, se emplea un anticuerpo contra la proteína quinasa RNA-activado (PKR) y eficiencia IP se determina por borrar occidental. Los resultados del análisis muestran que los granos de anticuerpo inmovilizado de hecho pueden utilizarse para enriquecer PKR mientras que las interacciones entre proteínas no específicas son mínimas.

Un esquema para la preparación de poly(PFPA) había injertado SiO2 granos, con o sin PEG sustitución se muestra en la figura 1. Para controlar las APTES y poly(PFPA) proceso de pelado SiO2 granos, el injerto APTES funcionalizados SiO2 granos y poly(PFPA) injertado SiO2 granos se caracterizan por DLS (figura 2) y XPS (figura 3). Eficiencias IP de las cuent...

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Preparation of Polypentafluorophenyl acrylate Functionalized SiO2 Beads for Protein Purification

Un protocolo para la preparación de poli (acrilato del pentafluorophenyl) (granos de sílice poly(PFPA)) injertado se presenta. La superficie de poly(PFPA) funcionalizados es inmovilizada con anticuerpos y utilizada con éxito para la separación de proteínas por inmunoprecipitación.

Preparación de Poly(pentafluorophenyl acrylate) funcionalizados SiO2 cuentas para purificación de proteínas

We demonstrate a simple method to prepare poly(pentafluorophenyl acrylate) (poly(PFPA)) grafted silica beads for antibody immobilization and subsequent ...

Este método se puede utilizar para preparar superficies activadas por biomoléculas, que tienen aplicaciones en áreas como la administración de fármacos, la detección biológica de objetivos y la separación biológica. La principal ventaja de esta técnica es que los cepillos poli PFPA son altamente reactivos con aminas, y la inmovilización de anticuerpos se logra mediante la incubación en solución tampón durante unas horas. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la purificación de proteínas a través de la inmunopurificación, ya que el anticuerpo inmovilizado puede unirse con éxito con antígenos diana.Aunque este método está demostrado para la movilización de anticuerpos y la purificación de proteínas, también se puede aplicar a otros sistemas que requieren movilización biomolecular. Para tratar las perlas de dióxido de silicio con APTES, primero obtenga partículas de dióxido de silicio en forma de una suspensión acuosa de volumen de 5% de peso. Combine 0,8 mililitros de suspensión de dióxido de silicio con 40 miligramos de APTES, y ocho mililitros de metanol en un vial de centelleo de 20 mililitros equipado con una barra de agitación.Deje que la reacción continúe a temperatura ambiente durante cinco horas con agitación vigorosa. Después de cinco horas, transfiera la solución a un tubo cónico. Para aislar las perlas de dióxido de silicona funcionalizada APTES, centrifuga la solución a 10.000 G durante cinco minutos.A continuación, retire el sobrenadante. Ahora lave las cuentas redistribuyéndolas en tres mililitros de metanol fresco. Agitar el tubo a mano para mezclar, pero si es necesario, mejorar la dispersión por sonicación en un baño de agua durante unos segundos.Centrifugar como antes, y repita el paso de lavado una vez más. Combine las perlas de dióxido de silicona de lavado de metanol con tres mililitros de dimetil sulfóxido, o DMSO. Agitar la mezcla a mano, o si es necesario, sonicar durante unos segundos hasta que las perlas estén completamente dispersas en el DMSO.Después de la centrifugación antes, retire el sobrenadante. Repita el paso de centrifugación una última vez para garantizar el intercambio completo de disolventes de metanol a DMSO. Para preparar la solución de poli PFPA, disolver 20 miligramos de poli PFPA en dos mililitros de DMSO en un vial de centelleo de 20 mililitros.Para preparar la solución PEG, disolver la amina funcionalizada PEG en un mililitro de DMSO. Ahora transfiera la solución PEG a la solución poly PFPA. Reacciona a temperatura ambiente durante una hora con una agitación vigorosa.Transfiera un mililitro de las perlas de dióxido de silicio funcionalizada APTES suspendidas en DMSO a la solución de poli PFPA sustituida por PEG. Permita que el injerto entre las perlas de dióxido de silicio funcionalizadas poly PFPA y APTES proceda a temperatura ambiente durante una hora con agitación vigorosa. Luego aísle las perlas por centrifugación a 10.000 G durante cinco minutos, seguido de la eliminación del sobrenadante.Lave las cuentas añadiendo tres mililitros de DMSO, y mezcle a mano o con unos segundos de sonicación. Centrifugar las cuentas como antes. Y retire el sobrenadante antes de repetir el lavado DMSO dos veces.Lave las cuentas dos veces más con tres mililitros de agua triple destilada. A continuación, mezcle a mano o con unos segundos de sonicación. Centrifugar las perlas como antes y quitar el sobrenadante.Finalmente secar las cuentas a 40 grados centígrados en un horno de vacío durante la noche. Añadir cinco miligramos de perlas de dióxido de silicio injertado de poli PFPA a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Lave las perlas añadiendo 800 microlitros de PBS, y mezcle bien por vórtice.Centrifugar las perlas a 10.000 G a temperatura ambiente durante un minuto. Retire el sobrenadante y repita el paso de lavado tres veces. Ahora agregue 350 microlitros de PBS fresco, 50 microlitros de 0.1%PBST y 6.67 microgramos del anticuerpo.Incubar aproximadamente 20 horas en un rotador a cuatro grados centígrados. Al día siguiente, lave las cuentas y la centrífuga a 400 G y cuatro grados centígrados durante un minuto. A continuación, retire el sobrenadante y agregue cuidadosamente 400 microlitros de tampón de lelisis.Resuspender suavemente las cuentas pipeteando hacia arriba y hacia abajo cinco veces. Repita este paso de lavado tres veces. Después del lavado final, retire la mayor cantidad posible del sobrenadante.Prepare las celdas y el búfer de lysis como se describe en el protocolo de texto. A continuación, resuspender el pellet celular con 400 microlitros del tampón de lelisis. Sonicar las células usando un ultra sonicador.Después de la sonicación, vórtice brevemente. Luego centrifuga el lysate a 20.000 G a cuatro grados centígrados durante 10 minutos. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo centrífugo de 1,5 mililitros.Para realizar la inmunoprecipitación, transfiera 300 microlitros de izado celular a perlas de dióxido de silicio inmovilizada de poli PFPA previamente preparadas. Conservar 30 microlitros de la célula de licate como muestra de entrada en un nuevo tubo de microcentrífuga. Incubar la mezcla de cuentas de izado durante tres horas en un rotador a cuatro grados centígrados.Después de la incubación, centrifugar la mezcla a 400 G a cuatro grados centígrados durante un minuto. Retire el sobrenadante y agregue cuidadosamente 400 microlitros de tampón de lavado. Resuspender suavemente las cuentas pipeteando hacia arriba y hacia abajo unas cinco veces.Después de tres lavados, retire la mayor cantidad de sobrenadante posible. Agregue 30 microlitros de 2x de tinte de carga SDS a las perlas y a la muestra de entrada. Luego calienta durante 10 minutos a 95 grados centígrados.Después del calentamiento, analice la muestra usando hinchazón occidental, o almacene la muestra a menos 20 grados centígrados. Las perlas de sílice funcionalizadas se examinan mediante espectroscopia de fotoelectrón de rayos X, o XPS, para determinar la composición de la superficie. Los datos XPS representativos se muestran aquí.Tras el tratamiento con APTES, se detecta el pico de nitrógeno 1s asociado con la zona del grupo de aminas APTES. Después del tratamiento con poli PFPA, se detecta el pico de flúor 1s asociado con las unidades PFP en el polímero. Se realiza el ARN de proteína quinasa activado, o el enriquecimiento PKR a través de la inmunoprecipitación, y la muestra de proteína aludida se analiza utilizando la hinchazón occidental.Como era de esperar, las perlas inmovilizadas sin anticuerpos o una mezcla de anticuerpos no específica no muestran ninguna recuperación PKR. Las perlas incubadas con anti-PKR pueden enriquecer con éxito PKR como lo indica la presencia de una banda PKR y la ausencia de banda GAPDH. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que al comparar los sistemas, los experimentos de IP, así como el posterior análisis de hinchazón occidental deben realizarse simultáneamente.Después de su desarrollo, esta técnica se puede utilizar para la inmovilización de diferentes sustratos biomoleculares o materiales. Además, este método tiene la ventaja adicional de ajustar solo la propiedad de superficie para adaptarse a las necesidades de cada aplicación.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Preparation of Poly(pentafluorophenyl acrylate) Functionalized SiO2 Beads for Protein Purification

Synthesis and Characterization of Functionalized Metal-organic Frameworks

Marcos de síntesis y caracterización de funcionalizado metal-orgánico

Metal-organic frameworks have attracted extraordinary amounts of research attention, as they are attractive candidates for numerous industrial and ...

Investigación

Química

Microbubble Fabrication of Concave-porosity PDMS Beads

Fabricación de microburbujas de Cuentas PDMS Cóncavo porosidad

Microbubble fabrication (by use of a fine emulsion) provides a means of increasing the surface-area-to-volume (SAV) ratio of polymer materials, which is ...

Immobilization of Multi-biocatalysts in Alginate Beads for Cofactor Regeneration and Improved Reusability

La inmovilización de Multi-biocatalizadores en perlas de alginato de cofactor de Regeneración y Reutilización mejorada

We have recently developed a simple, reusable and coupled whole-cell biocatalytic system with the capability of cofactor regeneration and biocatalyst ...

Preparation of a Corannulene-functionalized Hexahelicene by Copper(I)-catalyzed Alkyne-azide Cycloaddition of Nonplanar Polyaromatic Units

Preparation of a Corannulene-functionalized Hexahelicene by CopperI-catalyzed Alkyne-azide Cycloaddition of Nonplanar Polyaromatic Units

Preparación de un hexaheliceno funcionalizado-Corannulene por cobre (I) catalizada cicloadición Alquino-azida de Unidades no planas poliaromáticos

The main purpose of this video is to show 6 reaction steps of a convergent synthesis and prepare a complex molecule containing up to three nonplanar ...

The Effect of Interfacial Chemical Bonding in TiO2-SiO2 Composites on Their Photocatalytic NOx Abatement Performance

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El efecto de la unión química interfacial en TiO<sub2</sub&gt; -SiO<sub2</sub&gt; Composites en su desempeño fotocatalítico de reducción de NOx

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