Name: preparation of poly(pentafluorophenyl acrylate) functionalized sio2 beads for protein purification
Uploaded: 2018-11-19T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Polypentafluorophenyl acrylate Functionalized SiO2 Beads for Protein Purification at JoVE.com

Detta arbete stöds av byrån för Defense utveckling (Grant nr. UD170039ID).

1. beredning av Poly(PFPA) Homopolymer
<ol><li>Omkristallisering av AIBN<ol>
<li>Kombinera 5 g 2,2'-azobis(2-methylpropionitrile) (AIBN) med 25 mL metanol i en 250 mL bägare. Fördjupa bägaren i ett oljebad för 60 ° C, då kraftigt rör blandningen med en uppståndelse bar tills AIBN är helt upplöst.</li>
		<li>Filtrera den varma lösningen genom filterpapper (5-8 μm partikel kvarhållande) och lagra filtratet vid 4 ° C för att kristaller bildas långsamt.</li>
		<li>Samla de recrystallized AIBN genom filtreri...

<ol>
	<li>Johnsson, B., L&#246;f&#229;s, S., Lindquist, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilization+of+proteins+to+a+carboxymethyldextran-modified+gold+surface+for+biospecific+interaction+analysis+in+surface+plasmon+resonance+sensors.">Immobilization of proteins to a carboxymethyldextran-modified gold surface for biospecific interaction analysis in surface plasmon resonance sensors.</a> Analytical Biochemistry. 198 (2), 268-277 (1991).</li><li>Kurzawa, C., Hengstenberg, A., Schuhmann, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilization+method+for+the+preparation+of+biosensors+based+on+pH+shift-induced+deposition+of+biomolecule-containing+polymer+films.">Immobilization method for the preparation of biosensors based on pH shift-induced deposition of biomolecule-containing polymer films.</a> Analytical Chemistry. 74 (2), 355-361 (2002).</li><li>You, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+identification+of+proteins+using+nanoparticle-fluorescent+polymer+'chemical+nose'+sensors.">Detection and identification of proteins using nanoparticle-fluorescent polymer 'chemical nose' sensors.</a> Nature Nanotechnology. 2 (5), 318-323 (2007).</li><li>Roberts, M. W., Ongkudon, C. M., Forde, G. M., Danquah, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatility+of+polymethacrylate+monoliths+for+chromatographic+purification+of+biomolecules.">Versatility of polymethacrylate monoliths for chromatographic purification of biomolecules.</a> Journal of Separation Science. 32 (15-16), 2485-2494 (2009).</li><li>Sandison, M. E., Cumming, S. A., Kolch, W., Pitt, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On-chip+immunoprecipitation+for+protein+purification.">On-chip immunoprecipitation for protein purification.</a> Lab on a Chip. 10 (20), 2805-2813 (2010).</li><li>Das, A., Theato, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activated+Ester+Containing+Polymers:+Opportunities+and+Challenges+for+the+Design+of+Functional+Macromolecules.">Activated Ester Containing Polymers: Opportunities and Challenges for the Design of Functional Macromolecules.</a> Chemical Reviews. 116 (3), 1434-1495 (2016).</li><li>Choi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functionalization+and+patterning+of+reactive+polymer+brushes+based+on+surface+reversible+addition+and+fragmentation+chain+transfer+polymerization.">Functionalization and patterning of reactive polymer brushes based on surface reversible addition and fragmentation chain transfer polymerization.</a> Journal of Polymer Science Part A: Polymer Chemistry. 50 (19), 4010-4018 (2012).</li><li>Kessler, D., Jochum, F. D., Choi, J., Char, K., Theato, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+surface+coatings+based+on+polysilsesquioxanes:+universal+method+toward+light-responsive+surfaces.">Reactive surface coatings based on polysilsesquioxanes: universal method toward light-responsive surfaces.</a> ACS Applied Materials &amp; Interfaces. 3 (2), 124-128 (2011).</li><li>Son, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Penetration+and+exchange+kinetics+of+primary+alkyl+amines+applied+to+reactive+poly(pentafluorophenyl+acrylate)+thin+films.">Penetration and exchange kinetics of primary alkyl amines applied to reactive poly(pentafluorophenyl acrylate) thin films.</a> Polymer Journal. 48 (4), 487-495 (2016).</li><li>Kessler, D., Roth, P. J., Theato, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+surface+coatings+based+on+polysilsesquioxanes:+controlled+functionalization+for+specific+protein+immobilization.">Reactive surface coatings based on polysilsesquioxanes: controlled functionalization for specific protein immobilization.</a> Langmuir. 25 (17), 10068-10076 (2009).</li><li>Kessler, D., Theato, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+surface+coatings+based+on+polysilsesquioxanes:+defined+adjustment+of+surface+wettability.">Reactive surface coatings based on polysilsesquioxanes: defined adjustment of surface wettability.</a> Langmuir. 25 (24), 14200-14206 (2009).</li><li>Kessler, D., Nilles, K., Theato, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modular+approach+towards+multi-functional+surfaces+with+adjustable+and+dual-responsive+wettability+using+a+hybrid+polymer+toolbox.">Modular approach towards multi-functional surfaces with adjustable and dual-responsive wettability using a hybrid polymer toolbox.</a> Journal of Materials Chemistry. 19 (43), 8184-8189 (2009).</li><li>Eberhardt, M., Mruk, R., Zentel, R., Theato, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+pentafluorophenyl(meth)acrylate+polymers:+new+precursor+polymers+for+the+synthesis+of+multifunctional+materials.">Synthesis of pentafluorophenyl(meth)acrylate polymers: new precursor polymers for the synthesis of multifunctional materials.</a> European Polymer Journal. 41 (7), 1569-1575 (2005).</li><li>Jochum, F. D., Forst, F. R., Theato, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PNIPAM+copolymers+containing+light-responsive+chromophores:+a+method+toward+molecular+logic+gates.">PNIPAM copolymers containing light-responsive chromophores: a method toward molecular logic gates.</a> Macromolecular Rapid Communications. 31 (16), 1456-1461 (2010).</li><li>Schattling, P., Pollmann, I., Theato, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+CO2-responsive+polymers+by+post-polymerization+modification.">Synthesis of CO2-responsive polymers by post-polymerization modification.</a> Reactive &amp; Functional Polymers. 75, 16-21 (2014).</li><li>He, L., Szameit, K., Zhao, H., Hahn, U., Theato, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postpolymerization+modification+using+less+cytotoxic+activated+ester+polymers+for+the+synthesis+of+biological+active+polymers.">Postpolymerization modification using less cytotoxic activated ester polymers for the synthesis of biological active polymers.</a> Biomacromolecules. 15 (8), 3197-3205 (2014).</li><li>Arnold, R. M., McNitt, C. D., Popik, V. V., Locklin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+grafting+of+poly(pentafluorophenyl+acrylate)+onto+oxides:+versatile+substrates+for+reactive+microcapillary+printing+and+self-sorting+modification.">Direct grafting of poly(pentafluorophenyl acrylate) onto oxides: versatile substrates for reactive microcapillary printing and self-sorting modification.</a> Chemical Communications. 50 (40), 5307-5309 (2014).</li><li>Son, H., Ku, J., Kim, Y., Li, S., Char, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amine-Reactive+Poly(pentafluorophenyl+acrylate)+Brush+Platforms+for+Cleaner+Protein+Purification.">Amine-Reactive Poly(pentafluorophenyl acrylate) Brush Platforms for Cleaner Protein Purification.</a> Biomacromolecules. 19 (3), 951-961 (2018).</li><li>Cullen, S. E., Schwartz, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+for+isolation+of+H-2+and+Ia+alloantigens+with+immunoprecipitation+induced+by+protein+A-bearing+staphylococci.">An improved method for isolation of H-2 and Ia alloantigens with immunoprecipitation induced by protein A-bearing staphylococci.</a> The Journal of Immunology. 117 (1), 136-142 (1976).</li><li>Sisson, T. H., Castor, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+for+immobilizing+IgG+antibodies+on+protein+A-agarose.">An improved method for immobilizing IgG antibodies on protein A-agarose.</a> Journal of Immunology Methods. 127 (2), 215-220 (1990).</li><li>Peritz, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoprecipitation+of+mRNA-protein+complexes.">Immunoprecipitation of mRNA-protein complexes.</a> Nature Protocols. 1 (2), 577-580 (2006).</li><li>Zhang, Z., Chen, S., Jiang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual-functional+biomimetic+materials:+nonfouling+poly+(carboxybetaine)+with+active+functional+groups+for+protein+immobilization.">Dual-functional biomimetic materials: nonfouling poly (carboxybetaine) with active functional groups for protein immobilization.</a> Biomacromolecules. 7 (12), 3311-3315 (2006).</li><li>Yao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NHS-ester+functionalized+poly(PEGMA)+brushes+on+silicon+surface+for+covalent+protein+immobilization.">NHS-ester functionalized poly(PEGMA) brushes on silicon surface for covalent protein immobilization.</a> Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 66 (2), 233-239 (2008).</li><li>Ma, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Facile+fabrication+of+microsphere-polymer+brush+hierarchically+three-dimensional+(3D)+substrates+for+immunoassays.">Facile fabrication of microsphere-polymer brush hierarchically three-dimensional (3D) substrates for immunoassays.</a> Chemical Communications. 51 (31), 6749-6752 (2015).</li><li>Chong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thiocarbonylthio+compounds+[SC+(Ph)+S&#8722;+R]+in+free+radical+polymerization+with+reversible+addition-fragmentation+chain+transfer+(RAFT+Polymerization).+Role+of+the+free-radical+leaving+group+(R).">Thiocarbonylthio compounds [SC (Ph) S&#8722; R] in free radical polymerization with reversible addition-fragmentation chain transfer (RAFT Polymerization). Role of the free-radical leaving group (R).</a> Macromolecules. 36 (7), 2256-2272 (2003).</li><li>Jochum, F. D., Theato, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature-+and+Light-Responsive+Polyacrylamides+Prepared+by+a+Double+Polymer+Analogous+Reaction+of+Activated+Ester+Polymers.">Temperature- and Light-Responsive Polyacrylamides Prepared by a Double Polymer Analogous Reaction of Activated Ester Polymers.</a> Macromolecules. 42 (16), 5941-5945 (2009).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+The+Western+Blot.">Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot.</a> JoVE. , (2018).</li><li>Chua, G. B. H., Roth, P. J., Duong, H. T. T., Davis, T. P., Lowe, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+Thermoresponsive+Solution+Properties+of+Poly[oligo(ethylene+glycol)+(meth)acrylamide]s:+Biocompatible+PEG+Analogues.">Synthesis and Thermoresponsive Solution Properties of Poly[oligo(ethylene glycol) (meth)acrylamide]s: Biocompatible PEG Analogues.</a> Macromolecules. 45 (3), 1362-1374 (2012).</li></ol>

Syntesen av poly(PFPA) ympade SiO2 pärlor illustreras i figur 1. Genom att använda APTES som en länkare molekyl, kan poly(PFPA) borstar kovalent ympade SiO2 substratet förberedas via en enkel tvåstegsprocess. Även om vissa av enheterna som PFP offras för reaktionen med APTES, förväntas ett stort antal PFP enheterna förbli tillgängliga för senare reaktion med antingen amino-PEG eller antikroppar. PFP grupper är kända för att bilda låg energi ytor så poly...

Reaktiva polymer borstar har fått stort intresse under de senaste åren. De kan användas för att immobilisera funktionella molekyler på organiska eller oorganiska material att skapa aktiverade ytor med tillämpningar inom områden som upptäckt och separation1,2,3,4, 5. Bland den reaktiva polymerer rapporterade, är de som innehåller pentafluorophenyl ester enheter särskilt användbart på grund av deras höga reaktivitet med aminer och beständighet mot hydrolys6. En sådan polymer är poly(PFPA), och det kan vara lätt functionalized efter polymerisation med molekyler som innehåller primära eller sekundära aminer7,8,9,10. I ett exempel, var poly(PFPA) borstar reagerade med amino-spiropyrans att skapa ljus-lyhörd ytor7.
Utarbetandet av poly(PFPA) och dess tillämpningar har beskrivits i ett antal tidigare publikationer6,7,8,9,10,11,12 ,13,14,15,16,17. I synnerhet rapporterade Theato och medarbetare syntesen av poly(PFPA) borstar via både ”ympning till” och ”ympning från” metoder7,8,10,11,12 . I den ”ympning till” tillvägagångssätt, en poly (methylsilsesquioxane)-poly (pentafluorophenyl akrylat) (poly(MSSQ-PFPA)) hybrid polymer var syntetiseras8,10,11,12. Komponenten poly(MSSQ) kunde form stark vidhäftning med ett antal olika organiska och oorganiska ytor, vilket gör att komponenten poly(PFPA) att bilda en borste lager på belagda materialets yta. I den ”ympning från” tillvägagångssätt, ytan initierade reversibel tillägg och fragmentering kedja överföring (SI-flotte) polymerisation anställdes att förbereda poly(PFPA) borstar7. I det här fallet fästes en surface immobiliserade kedja överföring agent (SI-CTA) först kovalent till substratet via kiseldioxid-silane reaktion. Den immobiliserade SI-CTA deltog sedan i SI-flotte polymerisation av PFPA monomerer, generera tätt packade poly(PFPA) borstar med stabil kovalent koppling till substratet.
Genom att utnyttja poly(PFPA) borstarna syntetiseras via SI-flotte polymerisation, visat vi nyligen immobilisering av antikroppar på poly(PFPA) ympade kiseldioxid partiklar och deras efterföljande ansökan i protein rening18. Användning av poly(PFPA) borstar för antikropp immobilisering konstaterades för att lösa ett antal frågor i samband med nuvarande protein avskiljande via IP. Konventionella IP är beroende av användningen av Protein A/G som en länkare för antikropp immobilisering19,20,21. Eftersom användningen av Protein från A/G tillåter antikropparna bifogas med en specifik orientering, uppnås höga mål antigen återhämtning effektivitet. Men lider användningen av Protein från A/G av icke-specifika protein interaktion samt förlust av antikroppar under protein återhämtning, vilka båda bidrar till en hög nivå av bakgrundsbrus. Lös dessa brister genom varit direkta crosslinking av antikroppar till ett fast stöd utforskade22,23,24. Effektiviteten av sådana tekniker är vanligtvis låg på grund av slumpmässig orientering av tvärbunden antikroppar. För poly(PFPA) ympade substratet är immobilisering av antikroppar permanent, uppnås genom exchange reaktion mellan PFP enheter och amine funktioner på antikroppar. Även om antikroppar orientering är fortfarande slumpmässigt förmåner systemet från att ha många reaktiva PFP platser, kontrollerbar av graden av polymerisation. Dessutom visade vi som av delvis ersättning av PFP enheter med amino-PEG, surface hydrophilicitet kan stämmas, ytterligare förbättra protein återvinning effektiviteten av systemet18. Sammantaget har poly(PFPA) ympade kiseldioxid partiklar visat sig vara ett effektivt alternativ till traditionella IP med rimlig effektivitet samt mycket renare bakgrund.
I detta bidrag redovisar vi en alternativ metod att förbereda poly(PFPA) ympade yta för antikropp immobilisering och IP-program. I en enkel tvåstegsprocess, som illustreras i figur 1, är en APTES linker molekyl först deponeras på kisel ytan, sedan poly(PFPA) polymeren bifogas kovalent linker molekylen genom reaktion mellan PFP enheter på den polymer och amine funktioner på APTES. Denna förberedelse metod möjliggör den permanenta crosslinking av poly(PFPA) till en yta med substrat, men undviker många komplikationer i samband med SI-CTA syntes och SI-flotte polymerisation av poly(PFPA) penslar. Delvis ersättning av PFP aggregat med amino-PEG kan fortfarande utföras, möjliggör finjustering av polymer borste ytegenskaper. Vi visar poly(PFPA) ympade kiseldioxid pärlorna således beredd kan vara orörlig med antikroppar och används för protein berikning via IP. Den detaljerade pärla arbetsgången, antikropp immobilisering och IP-testning är dokumenterade i denna artikel, för läsare intresserade söker ett alternativ till konventionella Protein A/G baserat IP.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2,2-Azobisisobutyronitrile, 99%</td>
			<td>Daejung Chemicals</td>
			<td>1102-4405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl alcohol for HPLC, 99.9%</td>
			<td>Duksan Pure Chemicals</td>
			<td>d62</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmagnesium bromide solution 1.0&#160;M in THF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>331376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon disulfide anhydrous, &#8805;99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>335266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzyl bromide, 98%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B17905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petroleum ether, 90%</td>
			<td>Samchun Chemicals</td>
			<td>P0220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl ether, 99%</td>
			<td>Daejung Chemicals</td>
			<td>4025-4404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate anhydrous, powder,&#160;99%</td>
			<td>Daejung Chemicals</td>
			<td>5514-4405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentafluorophenyl acrylate</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-264001</td>
			<td>contains inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium oxide, activated, basic, Brockmann I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>199443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Daejung Chemicals</td>
			<td>7548-4400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anisole anhydrous, 99.7%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>296295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica nanoparticle</td>
			<td>Microparticles GmbH</td>
			<td>SiO2-R-0.7</td>
			<td>5% w/v aqueous suspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Aminopropyltrimethoxysilane, &#62;96.0%</td>
			<td>Tokyo Chemical Industry</td>
			<td>T1255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide for HPLC, &#8805;99.7%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34869</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amino-terminated poly(ethylene glycol) methyl ether</td>
			<td>Polymer Source</td>
			<td>P16082-EGOCH3NH2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline tablet</td>
			<td>Takara</td>
			<td>T9181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>9480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl (pH 8.0)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9855G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9640G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40</td>
			<td>VWR</td>
			<td>E109-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15514-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Biosesang</td>
			<td>D1037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor</td>
			<td>Merck</td>
			<td>535140-1MLCN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromo phenol blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B5525-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl (pH 6.8)</td>
			<td>Biosolution</td>
			<td>BT033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Biosolution</td>
			<td>BS003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21985-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PKR Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>12297S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH Antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-32233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Rabbit IgG</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>2729S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa</td>
			<td>Korea Cell Line Bank</td>
			<td>10002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>DAIHAN Scientific</td>
			<td>WUC-D10H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonicator</td>
			<td>BMBio</td>
			<td>BR2006A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge I</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge II</td>
			<td>LABOGENE</td>
			<td>1736R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator</td>
			<td>FINEPCR</td>
			<td>ROTATOR/AG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum oven</td>
			<td>DAIHAN Scientific</td>
			<td>ThermoStable OV-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel permeation chromatography (THF)</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>1260 Infinity II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-ray photoelectron spectrometer</td>
			<td>Thermo VG Scientific</td>
			<td>Sigma Probe</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynamic light scattering</td>
			<td>Malvern Instruments</td>
			<td>ZEN 3690</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of poly(pentafluorophenyl acrylate) functionalized sio2 beads for protein purification

Vi visar en enkel metod för att förbereda poly (pentafluorophenyl akrylat) (poly(PFPA)) ympade kiseldioxid pärlor för antikropp immobilisering och efterföljande immunoprecipitation (IP) ansökan. Poly(PFPA) ympade ytan är beredd via en enkel tvåstegsprocess. I det första steget sätts 3-aminopropyltrietoxisilan (APTES) som en länkare molekyl på kisel ytan. I det andra steget, poly(PFPA) homopolymer, syntetiseras via reversibel tillägg och fragmentering kedja överföring (flotte) polymerisation, ympas till länkaren molekylen genom exchange reaktion mellan pentafluorophenyl (PFP) enheter på den polymer och amine grupperna på APTES. Nedfallet av APTES och poly(PFPA) på kiseldioxid partiklar är bekräftat av röntgen fotoelektronen spektroskopi (XPS), såväl som övervakas av partikel storlek förändringen mätt via dynamiska ljusspridning (DLS). För att förbättra den ytan hydrophilicitet av pärlor, delvis ersättning av poly(PFPA) med amine-functionalized poly(ethylene glycol) (amino-PEG) utförs också. Den PEG-substituerade poly(PFPA) ympade kiseldioxid pärlor immobilizeds sedan med antikroppar för IP-programmet. För demonstration, en antikropp mot proteinkinas RNA-aktiverat (PKR) är anställd, och IP-effektivitet bestäms av Western blotting. Analysresultaten visar att antikropp orörlig pärlorna faktiskt kan användas för att berika PKR medan icke-specifika proteininteraktioner är minimal.

En schematisk för beredning av poly(PFPA) ympade SiO2 pärlor, med eller utan PEG substitution visas i figur 1. För övervakning av APTES och poly(PFPA) ympning process, bare SiO2 pärlor, APTES functionalized SiO2 pärlor, och poly(PFPA) ympade SiO2 pärlor kännetecknas av både DLS (figur 2) och XPS (figur 3). IP-effektivitetsvinsterna av pärlorna bes...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Polypentafluorophenyl acrylate Functionalized SiO2 Beads for Protein Purification at JoVE.com

Preparation of Polypentafluorophenyl acrylate Functionalized SiO2 Beads for Protein Purification

Ett protokoll för beredning av poly (pentafluorophenyl akrylat) (poly(PFPA)) ympade kiseldioxid pärlor presenteras. Poly(PFPA) functionalized ytan sedan orörlig med antikroppar och används framgångsrikt för protein separation genom immunoprecipitation.

Beredning av Poly(pentafluorophenyl acrylate) Functionalized SiO2 pärlor för Protein rening

We demonstrate a simple method to prepare poly(pentafluorophenyl acrylate) (poly(PFPA)) grafted silica beads for antibody immobilization and subsequent ...

Denna metod kan användas för att förbereda biomolekylaktiverade ytor, som har tillämpningar inom områden som läkemedelsleverans, biologisk måldetektering och bioseparation. Den största fördelen med denna teknik är att poly PFPA-borstarna är mycket reaktiva med aminer, och immobiliseringen av antikroppar uppnås genom inkubation i buffertlösning under några timmar. Konsekvenserna av denna teknik sträcker sig mot proteinet rening genom immunopurification, som immobiliserade antikroppen framgångsrikt kan binda med mål antigener.Även om denna metod är påvis för antikropp mobilisering och protein rening, kan det också tillämpas på andra system som kräver biomolekylär mobilisering. För att behandla kiseldioxidpärlor med APTES, först erhålla kiseldioxidpartiklar i form av en 5%vikt volym vattenhaltig suspension. Kombinera 0,8 milliliter kiseldioxid suspension med 40 milligram APTES, och åtta milliliter metanol i en 20 milliliter scintillation injektionsflaska utrustad med en rör bar.Låt reaktionen fortsätta i rumstemperatur i fem timmar med kraftig omrörning. Efter fem timmar, överför lösningen till ett koniskt rör. För att isolera APTES-funktionaliserade silikondioxidpärlor, centrifug lösningen vid 10, 000 G i fem minuter.Ta sedan bort supernatanten. Nu tvätta pärlorna genom att återanvända dem i tre milliliter färsk metanol. Skaka röret för hand för blandning, men om det behövs, förbättra spridningen genom ultraljudsbehandling i ett vattenbad i några sekunder.Centrifugera som tidigare, och upprepa tvättsteget en gång till. Kombinera metanol tvätta silikondioxid pärlor med tre milliliter dimetylsulfioxid, eller DMSO. Skaka blandningen för hand, eller om det behövs, sonikera i några sekunder tills pärlorna är helt spridda i DMSO.Efter centrifugeringen före, ta bort supernatanten. Upprepa centrifugeringen steg en sista gång för att säkerställa fullständig lösningsmedel utbyte från metanol till DMSO. För att förbereda poly PFPA-lösningen, lös 20 milligram poly PFPA i två milliliter DMSO i en 20 milliliter scintillations injektionsflaska.För att förbereda PEG-lösning, lös upp amin funktionaliserad PEG i en milliliter av DMSO. Nu överför PEG-lösningen till poly PFPA-lösningen. Reagera i rumstemperatur i en timme med kraftig omrörning.Överför en milliliter av APTES-funktionaliserade kiseldioxidpärlor som är upphängda i DMSO till PEG-substituerade poly PFPA-lösningen. Låt ympningen mellan poly PFPA och APTES funktionaliserade kiseldioxidpärlor fortsätta i rumstemperatur i en timme med kraftig omrörning. Isolera sedan pärlorna genom centrifugering vid 10, 000 G i fem minuter, följt av borttagande av supernatanten.Tvätta pärlorna genom att lägga till tre milliliter DMSO, och blanda för hand eller med några sekunder av ultraljudsbehandling. Centrifugera pärlorna som förut. Och ta bort supernatanten innan du upprepar DMSO-tvätten två gånger.Tvätta pärlorna två gånger till med tre milliliter trippeldestillerat vatten. Blanda sedan för hand eller med några sekunder av ultraljudsbehandling. Centrifugera pärlorna som tidigare och ta bort supernatanten.Torka slutligen pärlorna vid 40 grader celsius i en vakuumugn över natten. Lägg till fem milligram poly PFPA ympade kiseldioxid pärlor till en 1,5 milliliter microcentrifug röret. Tvätta pärlorna genom att lägga till 800 mikroliter pbs, och blanda väl genom att virvelning.Centrifugera pärlorna vid 10, 000 G vid rumstemperatur i en minut. Ta bort supernatanten och upprepa tvättsteget tre gånger. Nu lägga till 350 mikroliter av färska PBS, 50 mikroliter av 0,1%PBST, och 6,67 mikrogram av antikroppen.Inkubera cirka 20 timmar på en rotator vid fyra grader celsius. Nästa dag, tvätta pärlor och centrifug vid 400 G och fyra grader celsius i en minut. Ta sedan bort supernatanten och tillsätt försiktigt 400 mikroliter av lysbuffert.Försiktigt resuspend pärlorna genom pipettering upp och ner fem gånger. Upprepa detta tvättsteg tre gånger. Efter den sista tvätten, ta bort så mycket av supernatanten som möjligt.Förbered celler och lysbuffert enligt beskrivningen i textprotokollet. Sedan resuspend cell pelleten med 400 mikroliter av lysbuffert. Sonikera cellerna med hjälp av en ultra sonicator.Efter ultraljudsbehandling, vortex kort. Sedan centrifugera lysate vid 20, 000 G vid fyra grader celsius i 10 minuter. Överför supernatanten till ett nytt, 1,5 milliliter centrifugrör.För att utföra immunoprecipitation, överför 300 mikroliter av cell lysate till tidigare beredda antikroppar immobiliserade poly PFPA ympade kiseldioxid pärlor. Behålla 30 mikroliter av cellen lysate som ingångsprov i ett nytt mikrocentrifugrör. Inkubera blandning av lysatepärlor i tre timmar på en rotator vid fyra grader celsius.Efter inkubation, centrifug blandningen vid 400 G vid fyra grader celsius i en minut. Ta bort supernatanten och tillsätt försiktigt 400 mikroliter tvättbuffert. Försiktigt återanvänd pärlorna genom pipettering upp och ner ungefär fem gånger.Efter tre tvättar, ta bort så mycket av supernatanten som möjligt. Tillsätt 30 mikroliter av 2x SDS lastning färgämne till pärlorna och till indata provet. Värm dem sedan i 10 minuter vid 95 grader celsius.Efter uppvärmning, analysera provet med hjälp av västra blotting, eller lagra provet på minus 20 grader celsius. De funktionaliserade kiseldioxidpärlorna undersöks genom röntgenfotoelektronspektroskopi, eller XPS, för att bestämma ytsammansättning. Representativa XPS-data visas här.Efter APTES-behandling påvisas den kväve 1s-topp som är associerad med amingruppens zon APTES. Efter poly PFPA-behandling detekteras fluor 1s-toppen som är associerad med PFP-enheterna på polymeren. Proteinkinas RNA aktiverat, eller PKR-anrikning genom immunoprecipitation utförs, och det anspelade proteinprovet analyseras med hjälp av western blotting.Som väntat visar pärlor som immobiliseras utan antikropp, eller en icke-specifik antikroppsblandningsyr ingen PKR-återhämtning. Pärlorna som inkuberas med anti-PKR kan med framgång berika PKR som indikeras av närvaron av ett PKR-band och frånvaron av GAPDH-band. Medan du försöker detta förfarande, Det är viktigt att komma ihåg att när man jämför av system, IP experiment samt den efterföljande västra blotting analys bör göras samtidigt.Efter dess utveckling kan denna teknik användas för immobilisering av olika biomolekylära eller material substrat. Dessutom har denna metod den ytterligare fördelen av tuning Endast yta egendom som skall skräddarsys för att passa varje applikations behov.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Preparation of Poly(pentafluorophenyl acrylate) Functionalized SiO2 Beads for Protein Purification

Synthesis and Characterization of Functionalized Metal-organic Frameworks

Syntes och karakterisering av funktionaliserad metal-organic frame

Metal-organic frameworks have attracted extraordinary amounts of research attention, as they are attractive candidates for numerous industrial and ...

Microbubble Fabrication of Concave-porosity PDMS Beads

Mikrobubbel Tillverkning av konkav-porositet PDMS Pärlor

Microbubble fabrication (by use of a fine emulsion) provides a means of increasing the surface-area-to-volume (SAV) ratio of polymer materials, which is ...

Immobilization of Multi-biocatalysts in Alginate Beads for Cofactor Regeneration and Improved Reusability

Immobilisering av Multi-biokatalysatorer i alginatpärlor för Cofactor Regeneration och förbättrad Återanvändning

We have recently developed a simple, reusable and coupled whole-cell biocatalytic system with the capability of cofactor regeneration and biocatalyst ...

Preparation of a Corannulene-functionalized Hexahelicene by Copper(I)-catalyzed Alkyne-azide Cycloaddition of Nonplanar Polyaromatic Units

Preparation of a Corannulene-functionalized Hexahelicene by CopperI-catalyzed Alkyne-azide Cycloaddition of Nonplanar Polyaromatic Units

Framställning av en Corannulene-funktionaliserad Hexahelicene av koppar (I) -catalyzed alkyn-azid cykloaddition av icke-plan Polyaromatiska Units

The main purpose of this video is to show 6 reaction steps of a convergent synthesis and prepare a complex molecule containing up to three nonplanar ...

The Effect of Interfacial Chemical Bonding in TiO2-SiO2 Composites on Their Photocatalytic NOx Abatement Performance

The Effect of Interfacial Chemical Bonding in TiO2-SiO2 Composites on Their Photocatalytic NOx Abatement Performance

Effekten av gränsytisk kemisk bindning i TiO<sub&gt; 2</sub&gt; SiO<sub&gt; 2</sub&gt; Kompositioner på deras fotokatalytiska NOx-överföringsprestanda

The chemical bonding of particulate photocatalysts to supporting material surfaces is of great importance in engineering more efficient and practical ...

Methionine Functionalized Biocompatible Block Copolymers for Targeted Plasmid DNA Delivery

Metionin funktionaliserade biokompatibla Blocksampolymerer för riktad plasmid DNA-leverans

Reversible addition-fragmentation chain transfer (RAFT) polymerization integrates the advantages of radical polymerization and living polymerization. This ...

Efficient Synthesis of All-Carbon Quaternary Centers via the Conjugate Addition of Functionalized Monoorganozinc Bromides

Effektiv syntes av alla kol Quaternary Centers via konjugatet tillägg av Functionalized Monoorganozinc Bromides

The conjugate addition of organometallic reagents to &#945;,&#946;-unsaturated carbonyls represents an important method to generate C&#8211;C bonds in the ...

Organic Solvent-Based Protein Precipitation for Robust Proteome Purification Ahead of Mass Spectrometry

Organisk lösningsmedelsbaserad proteinutfällning för robust proteomrening före masspektrometri

While multiple advances in mass spectrometry (MS) instruments have improved qualitative and quantitative proteome analysis, more reliable front-end ...

Porphyrin-Modified Beads in Flow Cytometry

Porphyrin-Modified Beads for Use as Compensation Controls in Flow Cytometry

Porphyrin-Modified Beads for Use as Compensation Controls in Flow Cytometry (Video) | JoVE 

Porfyrinmodifierade pärlor för användning som kompensationskontroller i flödescytometri

Flow cytometry can rapidly characterize and quantify diverse cell populations based on fluorescence measurements. The cells are first stained with one or ...