Name: preparation of poly(pentafluorophenyl acrylate) functionalized sio2 beads for protein purification
Uploaded: 2018-11-19T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Polypentafluorophenyl acrylate Functionalized SiO2 Beads for Protein Purification at JoVE.com

Bu eser için savunma geliştirme (Grant No ajansı tarafından desteklenmiştir UD170039ID).

1. Poly(PFPA) Homopolymer hazırlanması
<ol><li>AIBN in rekristalizasyon<ol>
<li>2,2'-azobis(2-methylpropionitrile) (AIBN) 5 g 25 mL metanol bir 250 mL ölçek ile birleştirir. 60 ° C yağ banyosu kabı bırakın, sonra AIBN tamamen eriyene kadar karışımı heyecan bar ile karistirin.</li>
		<li>Filtre kağıdı (5-8 mikron partikül tutma) aracılığıyla sıcak çözüm filtre ve filtrate 4 ° C'de forma kristalleri yavaş yavaş izin vermek için saklayın.</li>
		<li>Recrystallized AIBN filtrasyon tarafından...

<ol>
	<li>Johnsson, B., L&#246;f&#229;s, S., Lindquist, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilization+of+proteins+to+a+carboxymethyldextran-modified+gold+surface+for+biospecific+interaction+analysis+in+surface+plasmon+resonance+sensors.">Immobilization of proteins to a carboxymethyldextran-modified gold surface for biospecific interaction analysis in surface plasmon resonance sensors.</a> Analytical Biochemistry. 198 (2), 268-277 (1991).</li><li>Kurzawa, C., Hengstenberg, A., Schuhmann, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilization+method+for+the+preparation+of+biosensors+based+on+pH+shift-induced+deposition+of+biomolecule-containing+polymer+films.">Immobilization method for the preparation of biosensors based on pH shift-induced deposition of biomolecule-containing polymer films.</a> Analytical Chemistry. 74 (2), 355-361 (2002).</li><li>You, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+identification+of+proteins+using+nanoparticle-fluorescent+polymer+'chemical+nose'+sensors.">Detection and identification of proteins using nanoparticle-fluorescent polymer 'chemical nose' sensors.</a> Nature Nanotechnology. 2 (5), 318-323 (2007).</li><li>Roberts, M. W., Ongkudon, C. M., Forde, G. M., Danquah, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatility+of+polymethacrylate+monoliths+for+chromatographic+purification+of+biomolecules.">Versatility of polymethacrylate monoliths for chromatographic purification of biomolecules.</a> Journal of Separation Science. 32 (15-16), 2485-2494 (2009).</li><li>Sandison, M. E., Cumming, S. A., Kolch, W., Pitt, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On-chip+immunoprecipitation+for+protein+purification.">On-chip immunoprecipitation for protein purification.</a> Lab on a Chip. 10 (20), 2805-2813 (2010).</li><li>Das, A., Theato, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activated+Ester+Containing+Polymers:+Opportunities+and+Challenges+for+the+Design+of+Functional+Macromolecules.">Activated Ester Containing Polymers: Opportunities and Challenges for the Design of Functional Macromolecules.</a> Chemical Reviews. 116 (3), 1434-1495 (2016).</li><li>Choi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functionalization+and+patterning+of+reactive+polymer+brushes+based+on+surface+reversible+addition+and+fragmentation+chain+transfer+polymerization.">Functionalization and patterning of reactive polymer brushes based on surface reversible addition and fragmentation chain transfer polymerization.</a> Journal of Polymer Science Part A: Polymer Chemistry. 50 (19), 4010-4018 (2012).</li><li>Kessler, D., Jochum, F. D., Choi, J., Char, K., Theato, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+surface+coatings+based+on+polysilsesquioxanes:+universal+method+toward+light-responsive+surfaces.">Reactive surface coatings based on polysilsesquioxanes: universal method toward light-responsive surfaces.</a> ACS Applied Materials &amp; Interfaces. 3 (2), 124-128 (2011).</li><li>Son, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Penetration+and+exchange+kinetics+of+primary+alkyl+amines+applied+to+reactive+poly(pentafluorophenyl+acrylate)+thin+films.">Penetration and exchange kinetics of primary alkyl amines applied to reactive poly(pentafluorophenyl acrylate) thin films.</a> Polymer Journal. 48 (4), 487-495 (2016).</li><li>Kessler, D., Roth, P. J., Theato, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+surface+coatings+based+on+polysilsesquioxanes:+controlled+functionalization+for+specific+protein+immobilization.">Reactive surface coatings based on polysilsesquioxanes: controlled functionalization for specific protein immobilization.</a> Langmuir. 25 (17), 10068-10076 (2009).</li><li>Kessler, D., Theato, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+surface+coatings+based+on+polysilsesquioxanes:+defined+adjustment+of+surface+wettability.">Reactive surface coatings based on polysilsesquioxanes: defined adjustment of surface wettability.</a> Langmuir. 25 (24), 14200-14206 (2009).</li><li>Kessler, D., Nilles, K., Theato, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modular+approach+towards+multi-functional+surfaces+with+adjustable+and+dual-responsive+wettability+using+a+hybrid+polymer+toolbox.">Modular approach towards multi-functional surfaces with adjustable and dual-responsive wettability using a hybrid polymer toolbox.</a> Journal of Materials Chemistry. 19 (43), 8184-8189 (2009).</li><li>Eberhardt, M., Mruk, R., Zentel, R., Theato, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+pentafluorophenyl(meth)acrylate+polymers:+new+precursor+polymers+for+the+synthesis+of+multifunctional+materials.">Synthesis of pentafluorophenyl(meth)acrylate polymers: new precursor polymers for the synthesis of multifunctional materials.</a> European Polymer Journal. 41 (7), 1569-1575 (2005).</li><li>Jochum, F. D., Forst, F. R., Theato, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PNIPAM+copolymers+containing+light-responsive+chromophores:+a+method+toward+molecular+logic+gates.">PNIPAM copolymers containing light-responsive chromophores: a method toward molecular logic gates.</a> Macromolecular Rapid Communications. 31 (16), 1456-1461 (2010).</li><li>Schattling, P., Pollmann, I., Theato, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+CO2-responsive+polymers+by+post-polymerization+modification.">Synthesis of CO2-responsive polymers by post-polymerization modification.</a> Reactive &amp; Functional Polymers. 75, 16-21 (2014).</li><li>He, L., Szameit, K., Zhao, H., Hahn, U., Theato, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postpolymerization+modification+using+less+cytotoxic+activated+ester+polymers+for+the+synthesis+of+biological+active+polymers.">Postpolymerization modification using less cytotoxic activated ester polymers for the synthesis of biological active polymers.</a> Biomacromolecules. 15 (8), 3197-3205 (2014).</li><li>Arnold, R. M., McNitt, C. D., Popik, V. V., Locklin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+grafting+of+poly(pentafluorophenyl+acrylate)+onto+oxides:+versatile+substrates+for+reactive+microcapillary+printing+and+self-sorting+modification.">Direct grafting of poly(pentafluorophenyl acrylate) onto oxides: versatile substrates for reactive microcapillary printing and self-sorting modification.</a> Chemical Communications. 50 (40), 5307-5309 (2014).</li><li>Son, H., Ku, J., Kim, Y., Li, S., Char, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amine-Reactive+Poly(pentafluorophenyl+acrylate)+Brush+Platforms+for+Cleaner+Protein+Purification.">Amine-Reactive Poly(pentafluorophenyl acrylate) Brush Platforms for Cleaner Protein Purification.</a> Biomacromolecules. 19 (3), 951-961 (2018).</li><li>Cullen, S. E., Schwartz, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+for+isolation+of+H-2+and+Ia+alloantigens+with+immunoprecipitation+induced+by+protein+A-bearing+staphylococci.">An improved method for isolation of H-2 and Ia alloantigens with immunoprecipitation induced by protein A-bearing staphylococci.</a> The Journal of Immunology. 117 (1), 136-142 (1976).</li><li>Sisson, T. H., Castor, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+for+immobilizing+IgG+antibodies+on+protein+A-agarose.">An improved method for immobilizing IgG antibodies on protein A-agarose.</a> Journal of Immunology Methods. 127 (2), 215-220 (1990).</li><li>Peritz, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoprecipitation+of+mRNA-protein+complexes.">Immunoprecipitation of mRNA-protein complexes.</a> Nature Protocols. 1 (2), 577-580 (2006).</li><li>Zhang, Z., Chen, S., Jiang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual-functional+biomimetic+materials:+nonfouling+poly+(carboxybetaine)+with+active+functional+groups+for+protein+immobilization.">Dual-functional biomimetic materials: nonfouling poly (carboxybetaine) with active functional groups for protein immobilization.</a> Biomacromolecules. 7 (12), 3311-3315 (2006).</li><li>Yao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NHS-ester+functionalized+poly(PEGMA)+brushes+on+silicon+surface+for+covalent+protein+immobilization.">NHS-ester functionalized poly(PEGMA) brushes on silicon surface for covalent protein immobilization.</a> Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 66 (2), 233-239 (2008).</li><li>Ma, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Facile+fabrication+of+microsphere-polymer+brush+hierarchically+three-dimensional+(3D)+substrates+for+immunoassays.">Facile fabrication of microsphere-polymer brush hierarchically three-dimensional (3D) substrates for immunoassays.</a> Chemical Communications. 51 (31), 6749-6752 (2015).</li><li>Chong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thiocarbonylthio+compounds+[SC+(Ph)+S&#8722;+R]+in+free+radical+polymerization+with+reversible+addition-fragmentation+chain+transfer+(RAFT+Polymerization).+Role+of+the+free-radical+leaving+group+(R).">Thiocarbonylthio compounds [SC (Ph) S&#8722; R] in free radical polymerization with reversible addition-fragmentation chain transfer (RAFT Polymerization). Role of the free-radical leaving group (R).</a> Macromolecules. 36 (7), 2256-2272 (2003).</li><li>Jochum, F. D., Theato, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature-+and+Light-Responsive+Polyacrylamides+Prepared+by+a+Double+Polymer+Analogous+Reaction+of+Activated+Ester+Polymers.">Temperature- and Light-Responsive Polyacrylamides Prepared by a Double Polymer Analogous Reaction of Activated Ester Polymers.</a> Macromolecules. 42 (16), 5941-5945 (2009).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+The+Western+Blot.">Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot.</a> JoVE. , (2018).</li><li>Chua, G. B. H., Roth, P. J., Duong, H. T. T., Davis, T. P., Lowe, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+Thermoresponsive+Solution+Properties+of+Poly[oligo(ethylene+glycol)+(meth)acrylamide]s:+Biocompatible+PEG+Analogues.">Synthesis and Thermoresponsive Solution Properties of Poly[oligo(ethylene glycol) (meth)acrylamide]s: Biocompatible PEG Analogues.</a> Macromolecules. 45 (3), 1362-1374 (2012).</li></ol>

Poly(PFPA) sentezi SiO2 boncuk Şekil 1' de gösterildiği aşılı. APTES bir bağlayıcı molekül istihdam ederek, kovalent SiO2 substrat için aşılı poly(PFPA) fırçalar basit bir işlemdir yolu ile hazırlanabilir. Her ne kadar bazı Bio birimlerinin APTES ile reaksiyonu için feda, Bio birimleri çok sayıda amino-PEG veya antikorlar ile daha sonra tepki için kullanılabilir kalması beklenir. Bio grupları poly(PFPA) fırçalar değil solvate su<sup class="x...

Reaktif polimer fırçaları çok ilgi son yıllarda almış. Algılama ve ayırma1,2,3,4gibi alanlarda uygulamaları ile aktif yüzey oluşturmak için organik veya inorganik malzemeler üzerinde fonksiyonel molekülleri hareketsiz için kullanılabilir, 5. Rapor reaktif polimerler arasında pentafluorophenyl ester birimleri içeren aminler ve direnç hidroliz6doğru onların yüksek reaktivite nedeniyle özellikle yararlı olur. Böyle bir polimer poly(PFPA) ve birincil veya İkincil aminler7,8,9,10içeren moleküller ile kolayca functionalized sonrası polimerizasyon olabilir. Bir örnekte, poly(PFPA) fırçalar amino-ışık duyarlı yüzeyler7oluşturmak için spiropyrans ile tepki.
Poly(PFPA) ve uygulamaları hazırlanması, önceki yayınları6,7,8,9,10,11,12 sayısında açıklanan ,13,14,15,16,17. Özellikle, Theato ve iş poly(PFPA) fırçalar "aşılama" hem de "dan aşılama yöntemleri7,8,10,11,12" ile sentezi bildirdi . "İçin yaklaşım, bir poli (methylsilsesquioxane) aşılama" içinde-poli (pentafluorophenyl akrilat) (poly(MSSQ-PFPA)) Hibrit Polimer sentez8,10,11,12oldu. Poly(MSSQ) bileşeni ile bir dizi farklı organik ve inorganik yüzeyler, böylece kaplanmış malzeme yüzeyinde bir fırça katman oluşturmak poly(PFPA) bileşen izin formu güçlü yapışma başardı. "Üzerinden yaklaşım aşılama", tersinir ek yüzey başlatılan ve parçalanma zincir transfer (SI-sal) polimerizasyon poly(PFPA) fırçalar7hazırlamak için kullanıldı. Bu durumda, bir yüzey immobilize zinciri Aktarım Aracısı (SI-CTA) ilk kovalent substrat silis-silane reaksiyon ile bağlı. İmmobilize SI-CTA substrat için kararlı kovalent bağ ile yoğun paketlenmiş poly(PFPA) fırçalar üreten PFPA monomerleri, SI-Sal polimerizasyon daha sonra katıldı.
SI-Sal polimerizasyonu sentez poly(PFPA) fırçalar kullanarak, biz son zamanlarda antikorlar aşılı poly(PFPA) silika partikülleri ve protein saflaştırma18sonraki uygulama onların immobilizasyon gösterdi. Poly(PFPA) fırçalar kullanıma antikor immobilizasyon IP üzerinden geçerli protein ayırma ile ilgili konularda bir dizi çözmek için bulundu. Geleneksel IP antikor immobilizasyon19,20,21Protein A/bir bağlayıcı G kullanımına dayanır. Belirli bir yönlendirme ile bağlanmak antikor Protein A/G kullanımı sağlar beri yüksek hedef antijen kurtarma verimliliği elde edilir. Ancak, Protein A/G kullanımı ikisi de arka plan gürültü yüksek bir düzeyde katkıda protein kurtarma sırasında--dan non-spesifik protein etkileşim hem hem antikorlar kaybına uğrar. Bu eksiklikleri gidermek için sağlam bir destek için antikorlar doğrudan polietilenin keşfedilmeyi22,23,24oldu. Bu tür teknikler verimliliğini çapraz antikorlar rasgele yönelimi nedeniyle genellikle düşüktür. Aşılı poly(PFPA) substrat için antikorlar immobilizasyon Satım tepki Bio birimleri ve amin functionalities antikorlar tarih arasında yoluyla elde, kalıcıdır. Antikor yönelimi hala rasgele olsa da, sistem çok reaktif Bio sitelerinde, polimerizasyon derecesine tarafından kontrol edilebilir olan faydaları. Ayrıca, biz gösterdi ki Bio birimleri ile amino-PEG, kısmi ikame tarafından yüzey hydrophilicity, daha fazla sistem18protein kurtarma verimliliğini artırmak ayarlanabilir. Genel olarak, aşılı poly(PFPA) silika partikülleri makul verimliliği hem de çok temiz arka plan ile geleneksel IP etkili bir alternatif gösterilmiştir.
Bu katkı antikor immobilizasyon ve IP uygulama için poly(PFPA) aşılı yüzey hazırlamak için alternatif bir yöntem rapor. Basit bir işlemdir Şekil 1' de gösterildiği gibi bir APTES bağlayıcı molekül ilk silis yüzey yatırılır, sonra poly(PFPA) polimer kovalent Bio birimler arasında tepki ile bağlayıcı molekül üzerinde bağlı olduğu Polimer ve APTES Amin işlevleri. Bu hazırlama yöntemi poly(PFPA) bir substrat yüzeye kalıcı polietilenin izin veren ancak SI-CTA sentezi ve SI-Sal polimerizasyon poly(PFPA) fırça ile ilgili birçok komplikasyonları önler. Amino-PEG Bio birimleriyle kısmi ikame hala, polimer fırça yüzey özelliklerini ince ayar sağlayan gerçekleştirilebilir. Biz böylece hazırlanan aşılı poly(PFPA) silika boncuk ile antikorlar immobilize ve protein zenginleştirme IP üzerinden için kullanılan gösterir. Detaylı boncuk hazırlık prosedürü, antikor immobilizasyon ve IP test bu makalede belgelenen, okuyucular arayışında baktılar için geleneksel Protein A/G alternatif IP tabanlı.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2,2-Azobisisobutyronitrile, 99%</td>
			<td>Daejung Chemicals</td>
			<td>1102-4405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl alcohol for HPLC, 99.9%</td>
			<td>Duksan Pure Chemicals</td>
			<td>d62</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmagnesium bromide solution 1.0&#160;M in THF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>331376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon disulfide anhydrous, &#8805;99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>335266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzyl bromide, 98%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B17905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petroleum ether, 90%</td>
			<td>Samchun Chemicals</td>
			<td>P0220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl ether, 99%</td>
			<td>Daejung Chemicals</td>
			<td>4025-4404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate anhydrous, powder,&#160;99%</td>
			<td>Daejung Chemicals</td>
			<td>5514-4405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentafluorophenyl acrylate</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-264001</td>
			<td>contains inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium oxide, activated, basic, Brockmann I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>199443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Daejung Chemicals</td>
			<td>7548-4400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anisole anhydrous, 99.7%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>296295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica nanoparticle</td>
			<td>Microparticles GmbH</td>
			<td>SiO2-R-0.7</td>
			<td>5% w/v aqueous suspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Aminopropyltrimethoxysilane, &#62;96.0%</td>
			<td>Tokyo Chemical Industry</td>
			<td>T1255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide for HPLC, &#8805;99.7%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34869</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amino-terminated poly(ethylene glycol) methyl ether</td>
			<td>Polymer Source</td>
			<td>P16082-EGOCH3NH2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline tablet</td>
			<td>Takara</td>
			<td>T9181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>9480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl (pH 8.0)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9855G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9640G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40</td>
			<td>VWR</td>
			<td>E109-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15514-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Biosesang</td>
			<td>D1037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor</td>
			<td>Merck</td>
			<td>535140-1MLCN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromo phenol blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B5525-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl (pH 6.8)</td>
			<td>Biosolution</td>
			<td>BT033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Biosolution</td>
			<td>BS003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21985-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PKR Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>12297S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH Antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-32233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Rabbit IgG</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>2729S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa</td>
			<td>Korea Cell Line Bank</td>
			<td>10002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>DAIHAN Scientific</td>
			<td>WUC-D10H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonicator</td>
			<td>BMBio</td>
			<td>BR2006A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge I</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge II</td>
			<td>LABOGENE</td>
			<td>1736R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator</td>
			<td>FINEPCR</td>
			<td>ROTATOR/AG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum oven</td>
			<td>DAIHAN Scientific</td>
			<td>ThermoStable OV-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel permeation chromatography (THF)</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>1260 Infinity II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-ray photoelectron spectrometer</td>
			<td>Thermo VG Scientific</td>
			<td>Sigma Probe</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynamic light scattering</td>
			<td>Malvern Instruments</td>
			<td>ZEN 3690</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of poly(pentafluorophenyl acrylate) functionalized sio2 beads for protein purification

Biz poli (pentafluorophenyl akrilat) hazırlamak için basit bir yöntem göstermek (poly(PFPA)) aşılı silis boncuk antikor immobilizasyon ve sonraki immunoprecipitation (IP) uygulama için. Poly(PFPA) aşılı yüzey yolu ile basit bir işlemdir hazırlanır. İlk adımda, 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) silis yüzeyine bir bağlayıcı molekül olarak yatırılır. İkinci adımda, poly(PFPA) homopolymer, tersine çevrilebilir toplama ve parçalanma zincir transfer (Sal) polimerizasyonu, yolu ile sentezlenmiş aracılığıyla exchange tepki pentafluorophenyl (Bio) birimler arasında bağlayıcı molekül için üzerine aşılı Polimer ve APTES Amin gruplarında. Devrilmesinden sonra APTES ve poly(PFPA) silika partikülleri x-ışını photoelectron spektroskopisi (XPS) tarafından teyit yanı sıra parçacık Boyut değişikliği tarafından izlenen üzerinde dinamik ışık saçılma (DL) ile ölçülür. Boncuklar, kısmi ikame poly(PFPA) Amin functionalized poly(ethylene glycol) ile yüzey hydrophilicity geliştirmek için (amino-PEG) de gerçekleştirilir. PEG yerine poly(PFPA) boncuk sonra ile IP uygulama için antikorlar immobilize silis aşılı. Gösteri, bir antikor protein kinaz RNA-harekete geçirmek (PKR) karşı istihdam ve IP etkinliği Western blot tarafından belirlenir. Çözümleme sonuçlarını immobilize antikor boncuk gerçekten de non-spesifik protein etkileşimleri çok az olmakla birlikte PKR zenginleştirmek için kullanılabileceğini göstermektedir.

Poly(PFPA) hazırlanması için bir şema ile SiO2 boncuklar, aşılı veya PEG ikame Şekil 1' de gösterilen. Poly(PFPA) işlemi, çıplak SiO2 boncuklar, aşılama ve APTES izlemek için APTES SiO2 boncuk functionalized ve poly(PFPA) aşılı SiO2 boncuk DLS (Şekil 2) ve XPS (Şekil 3) ile karakterizedir. IP verimliliği boncuk Western blot tarafından ...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Polypentafluorophenyl acrylate Functionalized SiO2 Beads for Protein Purification at JoVE.com

Preparation of Polypentafluorophenyl acrylate Functionalized SiO2 Beads for Protein Purification

Poli (pentafluorophenyl akrilat) hazırlanması için bir protokol (aşılı poly(PFPA)) silika boncuk sunulur. Poly(PFPA) functionalized yüzey o zaman ile antikorlar immobilize ve başarıyla immunoprecipitation yoluyla protein ayrılması için kullanılır.

Poly(pentafluorophenyl acrylate) Functionalized SiO2 boncuk hazırlanması için Protein Saflaştırma

We demonstrate a simple method to prepare poly(pentafluorophenyl acrylate) (poly(PFPA)) grafted silica beads for antibody immobilization and subsequent ...

Bu yöntem, ilaç dağıtımı, biyolojik hedef tespiti ve biyo ayrışma gibi alanlarda uygulamaları olan biyomolekülle aktive edilmiş yüzeylerin hazırlanmasında kullanılabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, poli PFPA fırçaların aminlerle son derece reaktif olması ve antikorların immobilizasyonunun tampon çözeltide birkaç saat kuluçka ile elde edilmesidir. Immobilize antikor başarıyla hedef antijenler ile bağlamak gibi bu tekniğin etkileri, immünpurifikasyon yoluyla protein saflaştırma doğru uzanır.Bu yöntem antikor mobilizasyonu ve protein arınması için gösterilmiş olsa da, biyomoleküler mobilizasyon gerektiren diğer sistemlere de uygulanabilir. APTES ile silikon dioksit boncukları tedavi etmek için, ilk% 5 ağırlık hacmi sulu süspansiyon şeklinde silikon dioksit parçacıkları elde. Bir karıştırma çubuğu ile donatılmış bir 20 mililitre scintillation vial 40 miligram APTES ile silikon dioksit süspansiyon 0.8 mililitre ve metanol sekiz mililitre birleştirin.Reaksiyonun oda sıcaklığında beş saat boyunca kuvvetli karıştırma ile devam etmesine izin verin. Beş saat sonra, konik bir tüp için çözüm aktarın. APTES fonksiyonel silikon dioksit boncukları izole etmek için, çözeltiyi 10,000 G'de beş dakika santrifüj edin.Sonra supernatant çıkarın. Şimdi taze metanol üç mililitre onları redispursing tarafından boncukyı yıkayın. Karıştırma için elle tüp çalkalayın, ancak gerekirse, birkaç saniye için bir su banyosunda sonication tarafından dağılım geliştirmek.Santrifüj daha önce olduğu gibi, ve yıkama adım ını bir kez daha tekrarlayın. Metanol yıkama silikon dioksit boncuklar dimetil sülfoksit üç mililitre veya DMSO ile birleştirin. Karışımı elle çalkalayın veya gerekirse boncuklar DMSO'da tamamen dağılana kadar birkaç saniye sonicate yapın.Daha önce santrifüj den sonra, supernatant çıkarın. Metanolden DMSO'ya tam çözücü değişimi sağlamak için santrifüj adımını son bir kez tekrarlayın. Poli PFPA çözeltisini hazırlamak için, 20 mililitrelik sintilasyon flakonunda iki mililitre DMSO'da 20 miligram poli PFPA çözün.PEG çözeltisi hazırlamak için amin fonksiyonel PEG'i bir mililitre DMSO'da çözün. Şimdi PEG çözeltisini poli PFPA çözeltisine aktarın. Güçlü karıştırma ile bir saat oda sıcaklığında tepki.DMSO'da askıya alınan APTES fonksiyonel silikon dioksit boncuklarının bir mililitresini PEG yerine bulunan poli PFPA çözeltisine aktarın. Poli PFPA ve APTES fonksiyonel silikon dioksit boncuklar arasındaki greftleme kuvvetli karıştırma ile bir saat oda sıcaklığında devam etmek için izin verin. Daha sonra 10, 000 G'de beş dakika boyunca santrifüj le boncukları izole edin ve ardından süpernatantın çıkarılmasını bekleyin.DMSO üç mililitre ekleyerek boncukyı yıkayın ve elle veya sonication birkaç saniye ile karıştırın. Boncukları daha önce olduğu gibi santrifüj edin. DMSO yıkamayı iki kez tekrarlamadan önce supernatant'ı çıkarın.Üç mililitre üç distile su ile boncukları iki kez daha yıkayın. Sonra elle veya sonication birkaç saniye ile karıştırın. Daha önce olduğu gibi boncuk santrifüj ve supernatant kaldırın.Son olarak bir vakum fırında bir gecede 40 derece santigrat boncuk kuru. 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne beş miligram poli PFPA aşılı silikon dioksit boncuk ekleyin. 800 mikrolitre PBS ekleyerek boncukları yıkayın ve girdap yaparak iyice karıştırın.Boncukları 10,000 G'de oda sıcaklığında bir dakika santrifüj edin. Supernatant çıkarın ve yıkama adımı üç kez tekrarlayın. Şimdi taze PBS 350 mikrolitre, 0.1% PBST 50 mikrolitre ve antikor 6.67 mikrogram ekleyin.Dört santigrat derecede bir rotator üzerinde yaklaşık 20 saat kuluçka. Ertesi gün, boncukları ve santrifüjleri 400 G ve 4 derece santigrat derecede bir dakika yıkayın. Sonra supernatant çıkarın ve dikkatle lysis tampon 400 mikrolitre ekleyin.Boncukları beş kez aşağı yukarı borulandırarak yavaşça askıya alın. Bu yıkama adımLarını üç kez tekrarlayın. Son yıkamadan sonra, mümkün olduğunca supernatant kadar çıkarın.Metin protokolünde açıklandığı gibi hücreleri ve lysis arabelleği hazırlayın. Daha sonra 400 mikrolitre likis tamponu ile hücre peletini yeniden askıya alın. Ultra sonicator kullanarak hücreleri sonicate.Sonication sonra, girdap kısaca. Sonra 20, 000 G'de 4 santigrat derecede 10 dakika boyunca lysate santrifüj edin. Supernatant'ı yeni, 1,5 mililitrelik bir santrifüj tüpe aktarın.İmmünoenare rendelenerek, 300 mikrolitre hücre lisatını daha önce hazırlanmış antikor immobilize edilmiş poli PFPA aşılı silikon dioksit boncuklarına aktarın. Yeni bir mikrosantrifüj tüpte giriş örneği olarak hücre lisatının 30 mikrolitresini saklayın. Lysate boncuk karışımını dört derece lik bir rotatörde üç saat kuluçkaya yatırın.Kuluçkadan sonra karışımı 400 G'de 4 derece santigrat derecede bir dakika santrifüj edin. Supernatant çıkarın ve dikkatle yıkama tampon 400 mikrolitre ekleyin. Boncukları yaklaşık beş kez yukarı ve aşağı borulandırarak yavaşça askıya alın.Üç yıkar sonra, mümkün olduğunca supernatant kadar çıkarın. Boncuklara ve giriş örneğine 30 mikrolitre 2x SDS yükleme boyası ekleyin. Sonra 95 santigrat derecede 10 dakika ısıtın.Isıtma dan sonra, batı lekeleme kullanarak örnek analiz veya eksi 20 derece santigrat derece de örnek saklayın. İşlevselleştirilmiş silika boncuklar yüzey kompozisyonu belirlemek için x-ışını fotoelektron spektroskopisi veya XPS ile incelenir. Temsilci XPS verileri burada gösterilmiştir.APTES tedavisinden sonra, amin grubu bölgesi APTES ile ilişkili azot 1s tepe saptanır. Poli PFPA tedavisinden sonra polimer üzerindeki PFP üniteleri ile ilişkili flor 1s tepe saptanır. Protein kinaz RNA aktive, veya immünopredi ile PKR zenginleştirme yapılır, ve ima protein örneği batı blotting kullanılarak analiz edilir.Beklendiği gibi, hiçbir antikor ile immobilize boncuklar, ya da non-spesifik antikor mikser hiçbir PKR kurtarma göstermektedir. Anti-PKR ile inkübe boncukbaşarıyla pkr bandı varlığı ve GAPDH bandının yokluğunda belirtildiği gibi PKR zenginleştirmek olabilir. Bu yordamı denerken, sistemlerin karşılaştırılması sırasında, IP deneyleri ve sonraki batı lekeleme analizinin aynı anda yapılması gerektiğini unutmamak gerekir.Gelişiminden sonra, bu teknik farklı biyomoleküler veya malzeme substrat immobilizasyonu için kullanılabilir. Ayrıca, bu yöntem, her uygulamanın ihtiyacına göre uyarlanacak yalnızca yüzey özelliğini ayarı ek yararı vardır.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Preparation of Poly(pentafluorophenyl acrylate) Functionalized SiO2 Beads for Protein Purification

Synthesis and Characterization of Functionalized Metal-organic Frameworks

Fonksiyonlu Sentezi ve Karakterizasyonu Metal-organik Altyapıları

Metal-organic frameworks have attracted extraordinary amounts of research attention, as they are attractive candidates for numerous industrial and ...

Microbubble Fabrication of Concave-porosity PDMS Beads

Konkav-gözenek PDMS Boncuk mikro-Fabrikasyon

Microbubble fabrication (by use of a fine emulsion) provides a means of increasing the surface-area-to-volume (SAV) ratio of polymer materials, which is ...

Immobilization of Multi-biocatalysts in Alginate Beads for Cofactor Regeneration and Improved Reusability

Kofaktör Yenilenme ve Geliştirilmiş kullanırlılık için Aljinat Boncuk Multi-biyokatalizi immobilizasyonu

We have recently developed a simple, reusable and coupled whole-cell biocatalytic system with the capability of cofactor regeneration and biocatalyst ...

Preparation of a Corannulene-functionalized Hexahelicene by Copper(I)-catalyzed Alkyne-azide Cycloaddition of Nonplanar Polyaromatic Units

Preparation of a Corannulene-functionalized Hexahelicene by CopperI-catalyzed Alkyne-azide Cycloaddition of Nonplanar Polyaromatic Units

Bakır (I) &#39;in bir Corannulene-işlevselleştirilmiş Hexahelicene hazırlanması düzlemsel olmayan Poliaromatik Birimleri alkin azid siklo, paladyum

The main purpose of this video is to show 6 reaction steps of a convergent synthesis and prepare a complex molecule containing up to three nonplanar ...

The Effect of Interfacial Chemical Bonding in TiO2-SiO2 Composites on Their Photocatalytic NOx Abatement Performance

The Effect of Interfacial Chemical Bonding in TiO2-SiO2 Composites on Their Photocatalytic NOx Abatement Performance

Yüzeyel Kimyasal Yapıştırmanın TiO&#39;ya Etkisi<sub&gt; 2</sub&gt; -SiO<sub&gt; 2</sub&gt; Fotokatalitik NOx Azaltma Performansına Sahip Kompozitler

The chemical bonding of particulate photocatalysts to supporting material surfaces is of great importance in engineering more efficient and practical ...

Methionine Functionalized Biocompatible Block Copolymers for Targeted Plasmid DNA Delivery

Hedeflenen Plasmid DNA teslim için metiyonin functionalized biyouyumlu blok kopolimerler

Reversible addition-fragmentation chain transfer (RAFT) polymerization integrates the advantages of radical polymerization and living polymerization. This ...

Efficient Synthesis of All-Carbon Quaternary Centers via the Conjugate Addition of Functionalized Monoorganozinc Bromides

Fonksiyonel Monoorganozinc Bromides Conjugate Ilavesi ile tüm karbon Dörernary merkezlerinin verimli sentezi

The conjugate addition of organometallic reagents to &#945;,&#946;-unsaturated carbonyls represents an important method to generate C&#8211;C bonds in the ...

Organic Solvent-Based Protein Precipitation for Robust Proteome Purification Ahead of Mass Spectrometry

Kütle Spektrometrisinden Önce Sağlam Proteom Saflaştırması için Organik Solvent Bazlı Protein Yağışı

While multiple advances in mass spectrometry (MS) instruments have improved qualitative and quantitative proteome analysis, more reliable front-end ...

Porphyrin-Modified Beads in Flow Cytometry

Porphyrin-Modified Beads for Use as Compensation Controls in Flow Cytometry

Porphyrin-Modified Beads for Use as Compensation Controls in Flow Cytometry (Video) | JoVE 

Akış sitometrisinde kompanzasyon kontrolleri olarak kullanılmak üzere porfirin modifiye edilmiş boncuklar

Flow cytometry can rapidly characterize and quantify diverse cell populations based on fluorescence measurements. The cells are first stained with one or ...