Name: multicolor flow cytometry-based quantification of mitochondria and lysosomes in t cells
Uploaded: 2019-01-09T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multicolor Flow Cytometry-based Quantification of Mitochondria and Lysosomes in T Cells at JoVE.com

Udviklingen af denne protokol blev støttet af tilskud fra Taiwan Ministeriet for videnskab og teknologi (mest) NSC103-2320-B-010-002-MY2 og MOST104-2628-B-010-002-MY4 til CL Hsu. C.W. Wei er en modtager af fremragende afhandling Award af Institut for Mikrobiologi og Immunologi, National Yang-Ming University.

Musen væv høst proceduren beskrevet her er blevet godkendt af institutionelle Animal Care og brug udvalg (IACUC) af National Yang-Ming University.
1. forberedelse af lymfocyt Suspension fra lymfoide organer
<ol><li>Aflive mus en godkendt metode som CO2 ved indånding i en gennemsigtig akryl kammer efterfulgt af cervikal dislokation at sikre død. Bemærk: Hold strømningshastigheden af CO2 for en 20% forskydning pr. minut for afdeling, og ikke er højere end 5 psi ...

<ol>
	<li>Buck, M. D., O'Sullivan, D., Pearce, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+metabolism+drives+immunity.">T cell metabolism drives immunity.</a> Journal of Experimental Medicine. 212 (9), 1345-1360 (2015).</li><li>Marelli-Berg, F. M., Fu, H., Mauro, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+metabolic+reprogramming+in+proliferating+cells:+implications+for+T-cell-mediated+immunity.">Molecular mechanisms of metabolic reprogramming in proliferating cells: implications for T-cell-mediated immunity.</a> Immunology. 136 (4), 363-369 (2012).</li><li>Pua, H. H., Guo, J., Komatsu, M., He, Y. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+is+essential+for+mitochondrial+clearance+in+mature+T+lymphocytes.">Autophagy is essential for mitochondrial clearance in mature T lymphocytes.</a> The Journal of Immunology. 182 (7), 4046-4055 (2009).</li><li>Chao, T., Wang, H., Ho, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Control+and+Guidance+of+Cellular+Activities+of+T+Cells.">Mitochondrial Control and Guidance of Cellular Activities of T Cells.</a> Frontiers in Immunology. 8, 473 (2017).</li><li>Youle, R. J., Narendra, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+mitophagy.">Mechanisms of mitophagy.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (1), 9-14 (2011).</li><li>Diogo, C. V., Yambire, K. F., Fern&#225;ndez Mosquera, L., Branco, F. T., Raimundo, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+adventures+at+the+organelle+society.">Mitochondrial adventures at the organelle society.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 500 (1), 87-93 (2018).</li><li>Todkar, K., Ilamathi, H. S., Germain, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+and+Lysosomes:+Discovering+Bonds.">Mitochondria and Lysosomes: Discovering Bonds.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 5, 106 (2017).</li><li>McLelland, G. L., Soubannier, V., Chen, C. X., McBride, H. M., Fon, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parkin+and+PINK1+function+in+a+vesicular+trafficking+pathway+regulating+mitochondrial+quality+control.">Parkin and PINK1 function in a vesicular trafficking pathway regulating mitochondrial quality control.</a> The EMBO Journal. 33 (4), 282 (2014).</li><li>Wrighton, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism:+Mitophagy+turns+beige+adipocytes+white.">Metabolism: Mitophagy turns beige adipocytes white.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (10), 607 (2016).</li><li>Altshuler-Keylin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beige+Adipocyte+Maintenance+Is+Regulated+by+Autophagy-Induced+Mitochondrial+Clearance.">Beige Adipocyte Maintenance Is Regulated by Autophagy-Induced Mitochondrial Clearance.</a> Cell Metabolism. 24 (3), 402-419 (2016).</li><li>Settembre, C., Fraldi, A., Medina, D. L., Ballabio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signals+from+the+lysosome:+a+control+centre+for+cellular+clearance+and+energy+metabolism.">Signals from the lysosome: a control centre for cellular clearance and energy metabolism.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (5), 283-296 (2013).</li><li>Qu, P., Du, H., Wilkes, D. S., Yan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+roles+of+lysosomal+acid+lipase+in+T+cell+development+and+function.">Critical roles of lysosomal acid lipase in T cell development and function.</a> The American Journal of Pathology. 174 (3), 944-956 (2009).</li><li>Wei, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Equilibrative+Nucleoside+Transporter+3+Regulates+T+Cell+Homeostasis+by+Coordinating+Lysosomal+Function+with+Nucleoside+Availability.">Equilibrative Nucleoside Transporter 3 Regulates T Cell Homeostasis by Coordinating Lysosomal Function with Nucleoside Availability.</a> Cell Reports. 23 (8), 2330-2341 (2018).</li><li>Baixauli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Respiration+Controls+Lysosomal+Function+during+Inflammatory+T+Cell+Responses.">Mitochondrial Respiration Controls Lysosomal Function during Inflammatory T Cell Responses.</a> Cell Metabolism. 22 (3), 485-498 (2015).</li><li>Piantadosi, C. A., Suliman, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+transcription+factor+A+induction+by+redox+activation+of+nuclear+respiratory+factor+1.">Mitochondrial transcription factor A induction by redox activation of nuclear respiratory factor 1.</a> The Journal of Biological Chemistry. 281 (1), 324-333 (2006).</li><li>Zhu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constitutive+association+of+the+proapoptotic+protein+Bim+with+Bcl-2-related+proteins+on+mitochondria+in+T+cells.">Constitutive association of the proapoptotic protein Bim with Bcl-2-related proteins on mitochondria in T cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (20), 7681-7686 (2004).</li><li>Ding, W. X., Yin, X. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitophagy:+mechanisms,+pathophysiological+roles,+and+analysis.">Mitophagy: mechanisms, pathophysiological roles, and analysis.</a> Biological Chemistry. 393 (7), 547-564 (2012).</li><li>van der Windt, G. J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD8+memory+T+cells+have+a+bioenergetic+advantage+that+underlies+their+rapid+recall+ability.">CD8 memory T cells have a bioenergetic advantage that underlies their rapid recall ability.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (35), 14336 (2013).</li><li>Chikte, S., Panchal, N., Warnes, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Lyso+dyes:+A+flow+cytometric+study+of+autophagy.">Use of Lyso dyes: A flow cytometric study of autophagy.</a> Cytometry Part A. 85 (2), 169-178 (2013).</li><li>Allan, A. L., Keeney, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+cell+analysis:+technical+and+statistical+considerations+for+application+to+the+clinic.">Circulating tumor cell analysis: technical and statistical considerations for application to the clinic.</a> Journal of Oncology. 2010, 426218 (2010).</li><li>Curtsinger, J. M., Lins, D. C., Johnson, C. M., Mescher, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+3+tolerant+CD8+T+cells+degranulate+in+response+to+antigen+but+lack+granzyme+B+to+mediate+cytolysis.">Signal 3 tolerant CD8 T cells degranulate in response to antigen but lack granzyme B to mediate cytolysis.</a> The Journal of Immunology. 175 (7), 4392-4399 (2005).</li><li>Wolint, P., Betts, M. R., Koup, R. A., Oxenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immediate+cytotoxicity+but+not+degranulation+distinguishes+effector+and+memory+subsets+of+CD8++T+cells.">Immediate cytotoxicity but not degranulation distinguishes effector and memory subsets of CD8+ T cells.</a> Journal of Experimental Medicine. 199 (7), 925-936 (2004).</li><li>Van den Bossche, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Dysfunction+Prevents+Repolarization+of+Inflammatory+Macrophages.">Mitochondrial Dysfunction Prevents Repolarization of Inflammatory Macrophages.</a> Cell Reports. 17 (3), 684-696 (2016).</li><li>Pearce, E. J., Everts, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cell+metabolism.">Dendritic cell metabolism.</a> Nature Reviews Immunology. 15 (1), 18-29 (2015).</li><li>Dugnani, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+T+cell+metabolism+in+cancer+immunotherapy.">Integrating T cell metabolism in cancer immunotherapy.</a> Cancer Letters. 411, 12-18 (2017).</li><li>Yang, Z., Matteson, E. L., Goronzy, J. J., Weyand, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+metabolism+in+autoimmune+disease.">T-cell metabolism in autoimmune disease.</a> Arthritis Research &amp; Therapy. 17 (1), 29 (2015).</li></ol>

Denne protokol kombinerer organelle-specifikke farvestoffer og overflade markør farvning for at kvantificere mængden af mitokondrier eller lysosomer i forskellige T-cellepopulationer. Denne metode blev udviklet for at overvinde begrænsningen af celle nummer og homogenitet krav til traditionelle metoder, såsom elektronmikroskopi og immunblot analyse. Det er især nyttigt i at analysere sjældne cellepopulationer og samtidig undersøge flere celletyper på samme tid.
Procedurens varighed og ...

Aktivering og spredning af T-celler er kritiske trin til montering vellykket immunrespons. De seneste fremskridt tyder på, at den cellulære metabolisme er tæt forbundet med både udvikling og funktioner af T-celler. For eksempel, stole naive T celler i vid udstrækning på oxidativ fosforylering (OXPHOS) til at opfylde efterspørgslen efter energi under recirkulation blandt sekundære lymfoide organer. Ved aktivering undergår naive T celler drastiske metaboliske omprogrammering, inklusive induktion af aerobe glykolyse at øge ATP produktionen og opfylde de enorme metaboliske krav under Celledifferentiering og spredning. De celler, der undlader at følge gennem metaboliske behov dør af apoptose1,2. Under den metaboliske omprogrammering, spiller mitokondrier en vigtig rolle siden de er de hovedansvarlige for produktionen af ATP til at levere energi til cellens organeller, og cellulære mitokondrier indhold svinger under metaboliske switche hele T-celle udvikling og aktivering3. Men ophobning af overflødige eller beskadigede mitokondrier kan producere overskydende ROS, der skader lipider, proteiner og DNA, og kan i sidste ende føre til celle død4
Overdreven eller beskadigede mitokondrier skyldes stofskifteforandringer er fjernet af en specialiseret form for autophagy5, kendt som mitophagy. Mitokondrier er pakket med autophagosomes og derefter sammensmeltet med lysosomer for nedbrydning. Disse tæt kommunikation mellem mitokondrier og lysosomer har skabt stor interesse6,7. For eksempel, oxidativ stress stimulerer mitokondrier at danne mitokondrier-afledte vesikler (MDVs), der er målrettet til lysosomer for nedbrydning i en fosfatase og tensin homolog (PT)-induceret formodede kinase 1 (PINK1) og parkin (en E3 ubiquitin ligase) afhængige måde8. Det konstateredes også, at mitophagy er afgørende for beige til hvid adipocyt overgang9,10. Endnu vigtigere, er lysosomer ikke blot en nedbrydning rum, men også en regulator af cellulær signalering. Overdreven substrat ophobning på grund af enzymet mangler resulterer i lysosomale dysfunktion ved at forstyrre lysosomale membran permeabilitet og påvirker Ca2 + homøostase11. T-celle funktionelle defekter i lysosomale syre lipase (LAL)12 eller lysosomale metabolit transporter knockout mus model13 viste yderligere betydningen af lysosomer for opretholdelsen af T celle homøostase. Både mitokondrier og lysosomer er uadskillelige dele af cellulære metaboliske forordning. Derfor, måling af cellulære mitokondrie indhold har været en afgørende indikator til at evaluere T-celle metaboliske og funktionelle status.
Assays almindeligvis anvendes til at kvantificere cellulære mitokondrie eller lysosomale indholdet omfatter immunblot, elektronmikroskopi, immunfluorescent (IF) farvning og PCR analyse af mitokondriel DNA kopi numre14,15, 16. mens immunblot kan kvantitativt sammenligner protein niveauer på tværs af forskellige prøver og elektron eller hvis mikroskopi kan visualisere morfologiske kendetegnende for disse organeller17, disse assays bærer visse tekniske ulemper. For eksempel, er det tidskrævende at erhverve tilstrækkeligt antal celle billeder med høj forstørrelse og opløsning eller til at sammenligne udtryk niveauet af et protein på tværs af snesevis af prøver, hvilket gør disse assays, anses for at være lav dataoverførselshastighed metoder. Desuden kan disse assays kun anvendes til homogen celle population, såsom cellelinjer, men ikke til vævsprøver, der består af blandede befolkninger.
Det er også vanskeligt at anvende disse assays til sjældne populationer, som krav om minimal celle numre fra 106 108 er umuligt at opfylde. Endelig er celler normalt mængden eller fast under processen, hvilket gør dem uforenelige med andre metoder til at ekstrahere yderligere oplysninger. Sammenlignet med de traditionelle metoder, fluorescerende-baserede flowcytometri har en relativt høj overførselshastighed - oplysninger for alle celler i en stikprøve bestående af blandet cellepopulationer kan analyseres og indsamlet samtidig. Derudover kan registrere mere end 10 parametre på den samme celle og sortere cellerne baseret på ønskede fænotyper for yderligere assays. Reaktiv fluorescerende sonder har været brugt til at mærke lysosomer og mitokondrier i levende celler og kan påvises ved flow flowcytometri18,19. Disse organelle-specifikke sonder har celle gennemtrængelige og fysisk-kemiske egenskaber, som tillader dem at være koncentreret i bestemte subcellulært steder eller organeller. Bekvemt, disse sonder er tilgængelige i forskellige fluorescerende formater, således at deres ansøgning om multicolor analyse.
Denne protokol beskriver i detaljer hvordan man kan kombinere overflade markør farvning med lysosomet eller mitokondrier specifikke farvestoffer til etiketten lysosomer eller mitokondrier i levende celler. Dette er især nyttigt for prøver genereret fra primære væv og organer, der ofte består af heterogene cellepopulationer. Forskere kan identificere cellepopulationer af interesse ved deres overflade markør udtryk og specielt måle lysosomale eller mitokondrie indholdet gennem organelle-specifikke farvestoffer i disse celler. Her viser vi en detaljeret procedure for flow cytometric analyse, der evaluerer den lysosomale eller mitokondrie masse i de store milt T celle delpopulationer.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:763px;" width="762">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">10 cm Graefe forceps (straight and serrated)</td>
			<td style="width:179px;">Dimeda</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">11 cm Iris scissors (straight with sharp/sharp heads)</td>
			<td>Dimeda</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">15 mL centrifuge tube</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">339650</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">5 mL syringe</td>
			<td style="width:179px;">TERUMO&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">6 cm Petri dish</td>
			<td style="width:179px;">&#945;-plus</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">70 &#181;m nylon cell strainer</td>
			<td style="width:179px;">SPL Lifesciences</td>
			<td style="width:119px;">93070</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Ammonium chloride (NH4Cl) &#160;&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A9434</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Anti-mouse CD25</td>
			<td style="width:179px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;">102007</td>
			<td style="width:167px;">Clone:PC61</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Anti-mouse CD4</td>
			<td style="width:179px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;">100453</td>
			<td style="width:167px;">Clone:GK1.5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Anti-mouse CD44</td>
			<td style="width:179px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;">103029</td>
			<td style="width:167px;">Clone:IM7</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Anti-mouse CD62L</td>
			<td style="width:179px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;">104407</td>
			<td style="width:167px;">Clone:MEL-14</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Anti-mouse CD8</td>
			<td style="width:179px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;">100713</td>
			<td style="width:167px;">Clone:53-6.7</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Anti-mouse TCR&#946;</td>
			<td style="width:179px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;">109233</td>
			<td style="width:167px;">Clone:H57-579</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">BD LSRFortessa</td>
			<td style="width:179px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td style="width:179px;">Bio basic</td>
			<td style="width:119px;">6381-92-6</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">FALCON 5ml Polystyrene Round-Bottom Tube (FACS tube)</td>
			<td style="width:179px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">352052</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">FcRgamma II (CD32) Hybridoma (2.4G2)</td>
			<td style="width:179px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">HB-197&#12288;</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:179px;">Hyclone</td>
			<td>ATD161145</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Flowjo, LLC</td>
			<td style="width:179px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hydroxyethyl piperazineethanesulfonic acid (HEPES)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-glutamine (200 mM)</td>
			<td style="width:179px;">Gibco</td>
			<td>A2916801</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">LysoTracker Green DND26</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">L7526</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">MEM Non-essential amino acids (100X)</td>
			<td style="width:179px;">Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">MitoTracker Green FM</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">M7514</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td style="width:179px;">Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium bicarbonate (KHCO3)</td>
			<td style="width:179px;">J.T.baker</td>
			<td style="width:119px;">298-14-6</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Propidium iodide solution</td>
			<td style="width:179px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">25535-16-4</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">RPMI 1640 medium (powder)</td>
			<td style="width:179px;">Gibco</td>
			<td>31800089</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium bicarbonate (NaHCO3)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Sodium pyruvate (100 mM)</td>
			<td style="width:179px;">Gibco</td>
			<td>11360070</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multicolor flow cytometry-based quantification of mitochondria and lysosomes in t cells

T-celler udnytte forskellige metaboliske programmer til at matche deres funktionelle behov under differentiering og spredning. Mitokondrier er afgørende cellulære komponenter, der er ansvarlige for at levere celle energi; dog producere overskydende mitokondrier også reaktive ilt arter (ROS), som kunne forårsage celledød. Antallet af mitokondrier skal derfor hele tiden justeres for at passe behov af celler. Denne dynamiske forordning opnås delvis gennem funktionen af lysosomer at fjerner overskud/beskadiget organeller og makromolekyler. Derfor, cellulære mitokondrie og lysosomale indhold er vigtige indikatorer til at vurdere den metaboliske justering af celler. Med udviklingen af sonder til organeller, er godt karakteriseret lysosomet eller mitokondrier-specifikke farvestoffer blevet tilgængelige i forskellige formater til at mærke cellulære lysosomer og mitokondrier. Flerfarvet flowcytometri er et fælles redskab til profil celle fænotyper, og har kapacitet til at blive integreret med andre assays. Vi præsenterer her, en detaljeret protokol af hvordan man kan kombinere organelle-specifikke farvestoffer med celleoverflademarkører farvning for at måle mængden af lysosomer og mitokondrier i forskellige T-cellepopulationer på en flow Flowcytometret.

Identifikation af store T celle subsets i milt og thymus
I korte, var enkelt celle suspensioner fra milt og thymus mængden af røde blodlegemer, inkuberes med 2.4G2 supernatanten, efterfulgt af organelle-specifikke farve og overflade markør farvning med fluorescens-konjugerede antistoffer (tabel 1). Udviklingsmæssige progression af thymocytter kan beskrives ved hjælp af antistoffer til co-re...

Watch this Scientific Journal Video about Multicolor Flow Cytometry-based Quantification of Mitochondria and Lysosomes in T Cells at JoVE.com

Multicolor Flow Cytometry-based Quantification of Mitochondria and Lysosomes in T Cells

Denne artikel illustrerer en kraftfuld metode til at anslå mitokondrier eller lysosomer i levende celler. Kombinationen af lysosomet eller mitokondrier specifikke farvestoffer med fluorescently konjugerede antistoffer mod celleoverflademarkører giver mulighed for kvantificering af disse organeller i blandet cellepopulationer, som primær celler høstet fra vævsprøver, ved hjælp af flerfarvet flowcytometri.

Flerfarvet Flow flowcytometri-baserede kvantificering af mitokondrier og lysosomer i T celler

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular ...

Denne metode kan hjælpe os med at besvare centrale spørgsmål i immun-metabolisme området. Fordelen ved denne teknik er, at det giver mulighed for kvantificering af mitokondrier eller lysosomer i de enkelte levende celler, i en kompleks blanding af forskellige celletyper. Denne metode til at studere T- og B-celler kan også anvendes på mange andre celletyper såsom makrofager, dendritiske celler eller eventuelle primærceller, der er høstet fra en vævsprøve.Proceduren vil blive demonstreret af Chin-Wen Wei, en kandidatstuderende fra mit laboratorium. For at mærke organellerne til kvantificering skal du først tilføje en gang ti til den sjette mus T-celler til et rundt bundfaxrør pr. markør. Og pellet cellerne ved centrifugering.forvard til 37 grader Celsius serumfrit dyringsmedie for at fortynde de organellespecifikke sondebestandløsninger til de endelige arbejdskoncentrationer i mediet. Og re-suspendere cellerne i 100 mikroliter af sonde farvestof pr rør. Derefter inkuberes cellerne i en cellekulturinkubator i den relevante farvningsperiode, hvilket stopper reaktionen ved slutningen af inkubationen med en milliliter iskold faxbuffer pr. rør.Derefter indsamles cellerne med en anden centrifugering og re-suspendere pellets i 100 mikroliter af den præ-titrerede 24G2 hybridoma supernatant på is. Efter ti minutter tilsættes en milliliter faxbuffer pr. rør. Cellerne opsamles ved centrifugering, og mærk cellerne med 50 mikroliter af den fortitrede fluorescenskonjugeret antistofcocktail af interesse.Den relevante koncentration i henhold til tabellen. Og fax buffer i 20 minutter på is, beskyttet mod lys. Ved inkubationens afslutning tilsættes en milliliter faxbuffer pr. rør.Indsamle cellerne ved centrifugering. Og re-suspendere cellerne i 300 mikroliter af fax buffer suppleret med et mikrogram pr. milliliter propidium iodid. Umiddelbart efter tilføjelse af nukleare og kromosom counterstain, tænde flow cytometer analyse computer, flow cytometer, fax erhvervelse software, og andre tilbehør enheder afhængigt af maskinen platform.Kør PBS gennem systemet i ca. et minut for at sikre, at flowlinjen er fyldt med PBS og hylsterbuffer. Åbn et nyt eksperiment, og angiv cytometerparametrene i henhold til producentens anvisninger. Cellerne filtreres gennem en 70 mikrometercelles si.Og vortex forud for erhvervelsen af hver prøve for at undgå klumper og doublet formation. Åbn indstillingen Automatisk kompensation, og opret prikplots for hver fluorescerende parameter. Når alle spændingerne er indstillet, skal du justere kompensationen og anvende kompensationen på prøverne.Opret en fremad scatter versus side scatter plot og optimere spændingerne, så cellerne af interesse vises i plottet. Opret en fremad scatter versus fremad scatter højde plot og gate de enkelte celler. Opret en fremad scatter område versus side scatter område plot og gate lymfocytter.Opret en fremad scatter område versus propidium iodid plot og gate de levende celler. Når alle spændingerne er indstillet, skal du justere kompensationen og anvende kompensationen på prøverne. Derefter indlæses det første prøverør, der skal oprettes de relevante celleoverflademarkørområder, og der indsamles mindst 1.000 hændelser i den befolkning, der er af interesse.Når alle prøverne er kørt, skal flowdataene eksporteres til efterfølgende analyse. Og gem eksperimentet som en skabelon for at bevare cytometerindstillingerne og parametrene for lignende eksperimenter i fremtiden. Endelige site mitokondrielt indhold er de laveste i dobbelt negative en T-celler, peak på dobbelt negative fase to og tre, og lidt fald i dobbelt negative fase fire.Med dobbelt positive thymocytter demonstrere højere antal mitokondrier end CD4 og CD8 enkelt positive thymocytter, hvilket tyder på, at mitokondrielt indhold svinger under udviklingen. CD4 og CD8 enkelt positive thymocytter udviser en højere mitokondriel middelffluorescensintensitet end milt CD4 eller CD8 T-celler, hvilket tyder på, at naive T-celler, der recirkulation i det iltrige blodmiljø har en endnu lavere mitokondriel masse end thymocytter. Interessant, denne reduktion af mitokondrielt indhold er mere fremtrædende i CD8 end CD4 T celle afstamning, og T-celle aktivering yderligere nedsætter tilstedeværelsen af disse organeller.Relativt lavt, men påviseligt, lysosomalt indhold er observeret i alle thymocyt populationer, med en mere fremtrædende tilstedeværelse i dobbelt negative en thymocytter. I periferien, et relativt højt antal lysosomer påvises i hukommelse og effektor CD8 positive T-celler. Ved at kombinere organelle specifikke farvestoffer og overflademarkør med flowcytometri er en effektiv måde at karakterisere cellernes metaboliske status på i en kompleks blanding.Yderligere organelle specifikke farvestof kan bruges til at opdage endoplasmatisk reticulum, autophagic vakuol, eller andre intracellulære rum af interesse.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Multicolor Flow Cytometry Analyses of Cellular Immune Response in Rhesus Macaques

The rhesus macaque model is currently the best available model for HIV-AIDS with respect to understanding the pathogenesis as well as for the development ...

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Ændring af primære humane T-celler

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

The Use of Flow Cytometry to Assess the State of Chromatin in T Cells

Brug af flowcytometri at vurdere tilstanden af ​​kromatin i T-celler

During a proper immune response, quiescent T cells become activated upon antigen presentation to their antigen-specific T cell receptor. This leads to ...

Flow Cytometry-based Assay for the Monitoring of NK Cell Functions

Flowcytometri-baserede assay for Overvågning af NK cellefunktioner

Natural killer (NK) cells are an important part of the human tumor immune surveillance system. NK cells are able to distinguish between healthy and ...

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Vurdering Retinal mikrogliaceller fagocytotisk funktion<em&gt; In vivo</em&gt; Brug en flowcytometri-baseret assay

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Gamma Delta T Cells

Isolering og flowcytometrisk analyse for Human endocervikale Gamma Delta T-celler

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore ...

A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity

En Flow flowcytometri-baserede cytotoksicitet analyse til vurdering af menneskers NK celleaktivitet

Within the innate immune system, effector lymphocytes known as natural killer (NK) cells play an essential role in host defense against aberrant cells, ...

Quantification of Proliferating Human Antigen-specific CD4+ T Cells using Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester

Quantification of Proliferating Human Antigen-specific CD4+ T Cells using Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester

Kvantificering af prolifererende humane antigen-specifikke CD4+ T-celler ved hjælp af Carboxyfluorescein Succinimidyl ester

Described is a simple, in vitro, dye dilution-based method for measuring antigen-specific CD4+ T cell proliferation in human peripheral blood mononuclear ...

Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis

Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis

Isolering af musenyrnyre resident CD8+ T-celler til flowcytometrianalyse

Tissue-resident memory T cell (TRM) is a rapidly expanding field of immunology research. Isolating T cells from various non-lymphoid tissues is one of the ...