Name: multicolor flow cytometry-based quantification of mitochondria and lysosomes in t cells
Uploaded: 2019-01-09T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multicolor Flow Cytometry-based Quantification of Mitochondria and Lysosomes in T Cells at JoVE.com

הפיתוח של פרוטוקול זה נתמך על ידי מענקים משרד טייוואן המדע, הטכנולוגיה (רובם) NSC103-2320-B-010-002-MY2, MOST104-2628-B-010-002-MY4 מודיע Hsu. . סי-וו ווי היא נמען של מעולה התזה פרס של המכון של מיקרוביולוגיה, אימונולוגיה, האוניברסיטה הלאומית של יאנג-מינג.

העכבר רקמות הקציר ההליך המתואר כאן אושרה על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) של האוניברסיטה הלאומית של יאנג-מינג.
1. הכנת לימפוציט השעיה של איברי הלימפה
<ol><li>המתת חסד העכבר על ידי שיטה שאושרו כגון CO2 שאיפת בתא אקרילי שקוף ואחריו נקע בצוואר הרחם כדי להבט...

<ol>
	<li>Buck, M. D., O'Sullivan, D., Pearce, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+metabolism+drives+immunity.">T cell metabolism drives immunity.</a> Journal of Experimental Medicine. 212 (9), 1345-1360 (2015).</li><li>Marelli-Berg, F. M., Fu, H., Mauro, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+metabolic+reprogramming+in+proliferating+cells:+implications+for+T-cell-mediated+immunity.">Molecular mechanisms of metabolic reprogramming in proliferating cells: implications for T-cell-mediated immunity.</a> Immunology. 136 (4), 363-369 (2012).</li><li>Pua, H. H., Guo, J., Komatsu, M., He, Y. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+is+essential+for+mitochondrial+clearance+in+mature+T+lymphocytes.">Autophagy is essential for mitochondrial clearance in mature T lymphocytes.</a> The Journal of Immunology. 182 (7), 4046-4055 (2009).</li><li>Chao, T., Wang, H., Ho, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Control+and+Guidance+of+Cellular+Activities+of+T+Cells.">Mitochondrial Control and Guidance of Cellular Activities of T Cells.</a> Frontiers in Immunology. 8, 473 (2017).</li><li>Youle, R. J., Narendra, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+mitophagy.">Mechanisms of mitophagy.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (1), 9-14 (2011).</li><li>Diogo, C. V., Yambire, K. F., Fern&#225;ndez Mosquera, L., Branco, F. T., Raimundo, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+adventures+at+the+organelle+society.">Mitochondrial adventures at the organelle society.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 500 (1), 87-93 (2018).</li><li>Todkar, K., Ilamathi, H. S., Germain, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+and+Lysosomes:+Discovering+Bonds.">Mitochondria and Lysosomes: Discovering Bonds.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 5, 106 (2017).</li><li>McLelland, G. L., Soubannier, V., Chen, C. X., McBride, H. M., Fon, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parkin+and+PINK1+function+in+a+vesicular+trafficking+pathway+regulating+mitochondrial+quality+control.">Parkin and PINK1 function in a vesicular trafficking pathway regulating mitochondrial quality control.</a> The EMBO Journal. 33 (4), 282 (2014).</li><li>Wrighton, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism:+Mitophagy+turns+beige+adipocytes+white.">Metabolism: Mitophagy turns beige adipocytes white.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (10), 607 (2016).</li><li>Altshuler-Keylin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beige+Adipocyte+Maintenance+Is+Regulated+by+Autophagy-Induced+Mitochondrial+Clearance.">Beige Adipocyte Maintenance Is Regulated by Autophagy-Induced Mitochondrial Clearance.</a> Cell Metabolism. 24 (3), 402-419 (2016).</li><li>Settembre, C., Fraldi, A., Medina, D. L., Ballabio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signals+from+the+lysosome:+a+control+centre+for+cellular+clearance+and+energy+metabolism.">Signals from the lysosome: a control centre for cellular clearance and energy metabolism.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (5), 283-296 (2013).</li><li>Qu, P., Du, H., Wilkes, D. S., Yan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+roles+of+lysosomal+acid+lipase+in+T+cell+development+and+function.">Critical roles of lysosomal acid lipase in T cell development and function.</a> The American Journal of Pathology. 174 (3), 944-956 (2009).</li><li>Wei, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Equilibrative+Nucleoside+Transporter+3+Regulates+T+Cell+Homeostasis+by+Coordinating+Lysosomal+Function+with+Nucleoside+Availability.">Equilibrative Nucleoside Transporter 3 Regulates T Cell Homeostasis by Coordinating Lysosomal Function with Nucleoside Availability.</a> Cell Reports. 23 (8), 2330-2341 (2018).</li><li>Baixauli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Respiration+Controls+Lysosomal+Function+during+Inflammatory+T+Cell+Responses.">Mitochondrial Respiration Controls Lysosomal Function during Inflammatory T Cell Responses.</a> Cell Metabolism. 22 (3), 485-498 (2015).</li><li>Piantadosi, C. A., Suliman, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+transcription+factor+A+induction+by+redox+activation+of+nuclear+respiratory+factor+1.">Mitochondrial transcription factor A induction by redox activation of nuclear respiratory factor 1.</a> The Journal of Biological Chemistry. 281 (1), 324-333 (2006).</li><li>Zhu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constitutive+association+of+the+proapoptotic+protein+Bim+with+Bcl-2-related+proteins+on+mitochondria+in+T+cells.">Constitutive association of the proapoptotic protein Bim with Bcl-2-related proteins on mitochondria in T cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (20), 7681-7686 (2004).</li><li>Ding, W. X., Yin, X. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitophagy:+mechanisms,+pathophysiological+roles,+and+analysis.">Mitophagy: mechanisms, pathophysiological roles, and analysis.</a> Biological Chemistry. 393 (7), 547-564 (2012).</li><li>van der Windt, G. J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD8+memory+T+cells+have+a+bioenergetic+advantage+that+underlies+their+rapid+recall+ability.">CD8 memory T cells have a bioenergetic advantage that underlies their rapid recall ability.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (35), 14336 (2013).</li><li>Chikte, S., Panchal, N., Warnes, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Lyso+dyes:+A+flow+cytometric+study+of+autophagy.">Use of Lyso dyes: A flow cytometric study of autophagy.</a> Cytometry Part A. 85 (2), 169-178 (2013).</li><li>Allan, A. L., Keeney, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+cell+analysis:+technical+and+statistical+considerations+for+application+to+the+clinic.">Circulating tumor cell analysis: technical and statistical considerations for application to the clinic.</a> Journal of Oncology. 2010, 426218 (2010).</li><li>Curtsinger, J. M., Lins, D. C., Johnson, C. M., Mescher, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+3+tolerant+CD8+T+cells+degranulate+in+response+to+antigen+but+lack+granzyme+B+to+mediate+cytolysis.">Signal 3 tolerant CD8 T cells degranulate in response to antigen but lack granzyme B to mediate cytolysis.</a> The Journal of Immunology. 175 (7), 4392-4399 (2005).</li><li>Wolint, P., Betts, M. R., Koup, R. A., Oxenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immediate+cytotoxicity+but+not+degranulation+distinguishes+effector+and+memory+subsets+of+CD8++T+cells.">Immediate cytotoxicity but not degranulation distinguishes effector and memory subsets of CD8+ T cells.</a> Journal of Experimental Medicine. 199 (7), 925-936 (2004).</li><li>Van den Bossche, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Dysfunction+Prevents+Repolarization+of+Inflammatory+Macrophages.">Mitochondrial Dysfunction Prevents Repolarization of Inflammatory Macrophages.</a> Cell Reports. 17 (3), 684-696 (2016).</li><li>Pearce, E. J., Everts, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cell+metabolism.">Dendritic cell metabolism.</a> Nature Reviews Immunology. 15 (1), 18-29 (2015).</li><li>Dugnani, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+T+cell+metabolism+in+cancer+immunotherapy.">Integrating T cell metabolism in cancer immunotherapy.</a> Cancer Letters. 411, 12-18 (2017).</li><li>Yang, Z., Matteson, E. L., Goronzy, J. J., Weyand, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+metabolism+in+autoimmune+disease.">T-cell metabolism in autoimmune disease.</a> Arthritis Research &amp; Therapy. 17 (1), 29 (2015).</li></ol>

פרוטוקול זה משלב צבעים ספציפיים אברון סמן משטח מכתים לכמת את כמות המיטוכונדריה או lysosomes באוכלוסיות שונות תא T. שיטה זו פותחה כדי להתגבר על המגבלה של מספר תאים הומוגניות דרישות עבור שיטות מסורתיות, כגון מיקרוסקופ אלקטרונים וניתוח immunoblot. זה שימושי במיוחד ניתוח נדיר תא אוכלוסיות ובדיקת סוגי ?...

הפעלת ושגשוגם של תאי T הם שלבים קריטיים להרכבת תגובות חיסוניות מוצלחת. התפתחויות אחרונות מראים כי החומרים הסלולר קשורה באופן הדוק פיתוח והן פונקציות של תאי T. לדוגמה, תאים נאיביים T מסתמכים בעיקר על זרחון חמצוני (OXPHOS) את הביקוש אנרגיה במהלך מחזור בין איברי הלימפה משני. בעת ההפעלה, תמים T תאים עוברים דרסטית מטבולית התכנות, כולל את אינדוקציה של אירובי גליקוליזה כדי להגביר את ייצור ATP וכדי למלא את דרישות המטבולית אדירה במהלך התמיינות תאים והתפשטות. התאים מתקשה להבין. דרך לצרכים מטבוליים למות על ידי אפופטוזיס1,2. במהלך התיכנות מטבולית המיטוכונדריה לשחק תפקידים חשובים מאז הם organelles אחראי במידה רבה הייצור של ATP לאספקת אנרגיה של התא, התוכן המיטוכונדריה הסלולר תנודות במהלך מתגים מטבולית ברחבי T cell פיתוח והפעלה3. אולם, ההצטברות של המיטוכונדריה מיותר או פגום יכול לייצר עודפי ROS נזק שומנים, חלבונים ו- DNA, והוא יכול להוביל בסופו של דבר לתא המוות4
המיטוכונדריה מוגזם או נזק הנובעים שינויים מטבוליים יוסרו על ידי צורה מיוחדת של autophagy5, המכונה mitophagy. המיטוכונדריה הם עטוף autophagosomes, ואז התמזגו עם lysosomes עבור השפלה. אלה סגור תקשורת בין המיטוכונדריה, lysosomes יצרו עניין רב6,7. לדוגמה, סטרס חמצוני מעוררת את המיטוכונדריה ליצור שלפוחית נגזר המיטוכונדריה (MDVs) המיועדים כדי lysosomes על השפלה פוספטאז, tensin homolog (PTEN)-induced בשם קינאז 1 (PINK1) ואת פרקין (ליגאז אוביקוויטין E3) אופן התלויים8. גם נמצאו ש-mitophagy הזה הוא חיוני עבור adipocyte בז ללבן המעבר9,10. חשוב מכך, lysosomes אינם רק תא השפלה, אלא גם מווסת של איתות. הצטברות מוגזמת המצע עקב ליקויים האנזים מתבטא בתפקוד lysosomal באמצעות שיבוש חדירות הממברנה lysosomal ומשפיע על Ca2 + הומאוסטזיס11. פגמים פונקציונלי תא T ליפאז lysosomal חומצה (LAL)12 או המטבוליט lysosomal טרנספורטר נוקאאוט העכבר דגם13 נוסף הראה את החשיבות של lysosomes בשמירה על הומאוסטזיס תא T. המיטוכונדריה וגם lysosomes הם חלקים בלתי נפרדים של רגולציה חילוף החומרים הסלולר. לכן, מדידה של תכנים סלולריים מיטוכונדריאלי כבר חיווי חיוני כדי להעריך את מצב מטבולי ופונקציונליים של תא T.
מבחני נפוץ לכמת תוכן סלולרי מיטוכונדריאלי או lysosomal כוללים immunoblot, מיקרוסקופ אלקטרונים, immunofluorescent מכתים (אם), וניתוח PCR מיטוכונדריאלי DNA עותק מספרי14,15, 16. בעוד immunoblot יכול באופן כמותי משווים רמות החלבון בין דוגמאות שונות, אלקטרון או אם מיקרוסקופ ניתן להמחיש את מבוקשם מורפולוגי של אלה organelles17, אלה מבחני לשאת חסרונות טכניים מסוימים. לדוגמה, זה זמן רב כדי לרכוש מספר מספיק של התא תמונות בהגדלה וברזולוציה או להשוות את רמות הביטוי של חלבון על פני עשרות של דגימות, ביצוע מבחני אלה נחשבת שיטות תפוקה נמוכה. יתר על כן, מבחני אלה ניתן להחיל רק אוכלוסייה הומוגנית התא, כגון שורות תאים, אך לא דגימות רקמה המורכב של אוכלוסיות מעורבות.
. זה גם קשה להחיל את מבחני אלה אוכלוסיות נדירה, שבה הדרישה תא מינימלי של מספרים מ-106 עד 108 בלתי אפשרי לפגוש. לבסוף, התאים בדרך כלל lysed או קבוע במהלך תהליך שהופך אותם עולה בקנה אחד עם שיטות אחרות כדי לחלץ מידע נוסף. לעומת שיטות מסורתיות, cytometry זרימה מבוססי פלורסנט בעלת תפוקה גבוהה יחסית של - המידע של כל התאים בטווח מדגם המורכב אוכלוסיות מעורבות לתאים יכול להיות מנותח ואסף בו זמנית. בנוסף, אחד יכול לזהות יותר מ- 10 פרמטרים באותו התא, למיין את התאים בהתאם פנוטיפים הרצוי עבור עוד מבחני. תגובתי הגששים פלורסנט שימשו לה תווית lysosomes, המיטוכונדריה בתאים חיים, ניתן להבחין לזרום cytometry18,19. הגששים אברון ספציפיים אלה תא חדיר, יש מאפיינים הכימי פיזיקלי, אשר מאפשרות להם מרוכזים מיקומים ספציפיים subcellular או organelles. בנוחות, רגשים אלו זמינים במגוון פורמטים פלורסנט, ובכך מאפשר היישום שלהם לניתוח ססגוניות.
פרוטוקול זה מתאר בפירוט כיצד לשלב סמן משטח מכתים עם ליזוזום-המיטוכונדריה ספציפיים או צבע כדי lysosomes תווית או במיטוכונדריה לחיות תאים. הדבר שימושי במיוחד עבור דגימות המופקים העיקרי רקמות ואיברים, אשר לעיתים קרובות מורכבים של אוכלוסיות הטרוגניות התא. החוקרים ניתן לזהות אוכלוסיות תאים עניין על-ידי ביטוי סמן משטח שלהם, במיוחד למדוד את התוכן lysosomal או מיטוכונדריאלי באמצעות צבעי אברון ספציפי בתאים אלה. . הנה, נדגים ההליך מפורט של ניתוח cytometric תזרים המעריכה את המיסה lysosomal או מיטוכונדריאלי subpopulations תא T הטחול הגדולות.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:763px;" width="762">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">10 cm Graefe forceps (straight and serrated)</td>
			<td style="width:179px;">Dimeda</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">11 cm Iris scissors (straight with sharp/sharp heads)</td>
			<td>Dimeda</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">15 mL centrifuge tube</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">339650</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">5 mL syringe</td>
			<td style="width:179px;">TERUMO&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">6 cm Petri dish</td>
			<td style="width:179px;">&#945;-plus</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">70 &#181;m nylon cell strainer</td>
			<td style="width:179px;">SPL Lifesciences</td>
			<td style="width:119px;">93070</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Ammonium chloride (NH4Cl) &#160;&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A9434</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Anti-mouse CD25</td>
			<td style="width:179px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;">102007</td>
			<td style="width:167px;">Clone:PC61</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Anti-mouse CD4</td>
			<td style="width:179px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;">100453</td>
			<td style="width:167px;">Clone:GK1.5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Anti-mouse CD44</td>
			<td style="width:179px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;">103029</td>
			<td style="width:167px;">Clone:IM7</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Anti-mouse CD62L</td>
			<td style="width:179px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;">104407</td>
			<td style="width:167px;">Clone:MEL-14</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Anti-mouse CD8</td>
			<td style="width:179px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;">100713</td>
			<td style="width:167px;">Clone:53-6.7</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Anti-mouse TCR&#946;</td>
			<td style="width:179px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;">109233</td>
			<td style="width:167px;">Clone:H57-579</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">BD LSRFortessa</td>
			<td style="width:179px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td style="width:179px;">Bio basic</td>
			<td style="width:119px;">6381-92-6</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">FALCON 5ml Polystyrene Round-Bottom Tube (FACS tube)</td>
			<td style="width:179px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">352052</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">FcRgamma II (CD32) Hybridoma (2.4G2)</td>
			<td style="width:179px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">HB-197&#12288;</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:179px;">Hyclone</td>
			<td>ATD161145</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Flowjo, LLC</td>
			<td style="width:179px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hydroxyethyl piperazineethanesulfonic acid (HEPES)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-glutamine (200 mM)</td>
			<td style="width:179px;">Gibco</td>
			<td>A2916801</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">LysoTracker Green DND26</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">L7526</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">MEM Non-essential amino acids (100X)</td>
			<td style="width:179px;">Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">MitoTracker Green FM</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">M7514</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td style="width:179px;">Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium bicarbonate (KHCO3)</td>
			<td style="width:179px;">J.T.baker</td>
			<td style="width:119px;">298-14-6</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Propidium iodide solution</td>
			<td style="width:179px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">25535-16-4</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">RPMI 1640 medium (powder)</td>
			<td style="width:179px;">Gibco</td>
			<td>31800089</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium bicarbonate (NaHCO3)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Sodium pyruvate (100 mM)</td>
			<td style="width:179px;">Gibco</td>
			<td>11360070</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multicolor flow cytometry-based quantification of mitochondria and lysosomes in t cells

תאי T לנצל תוכניות מטבוליות שונות כדי להתאים לצרכיהם תפקודית במהלך התמיינות והתפשטות. המיטוכונדריה הם רכיבים חיוניים הסלולר אחראית לאספקת אנרגיה תא; עם זאת, המיטוכונדריה עודף גם מייצרים מינים חמצן תגובתי (ROS) שעלולה לגרום מוות של תאים. לכן, ומספר המיטוכונדריה עליך להתאימם כל הזמן להתאים את הצרכים של התאים. תקנה דינמית זו מושגת באופן חלקי באמצעות הפונקציה של lysosomes להסיר את עודף/פגום organelles ו מקרומולקולות. לפיכך, תוכן סלולרי מיטוכונדריאלי, lysosomal הם מחווני מפתח להערכת ההתאמה חילוף החומרים של התאים. עם התפתחות זונדי organelles, ליזוזום מאופיין היטב או צבע ספציפי המיטוכונדריה הפכו זמינים בפורמטים שונים כדי להדביק תווית lysosomes הסלולר ועל המיטוכונדריה. Cytometry זרימה ססגוניות הוא כלי נפוץ פרופיל תא פנוטיפים, יש לו את היכולת להיות משולב עם מבחני אחרים. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט כיצד לשלב צבעים ספציפיים אברון עם סמנים משטח מכתים כדי למדוד את כמות lysosomes של המיטוכונדריה באוכלוסיות שונות תא T על cytometer זרימה.

זיהוי של קבוצות משנה עיקריים T cell הטחול, בלוטת התימוס
בקצרה, המתלים תא בודד מן הטחול ואת בלוטת התימוס lysed של כדוריות דם אדומות, מודגרות עם תגובת שיקוע 2.4G2, ואחריו צבע ספציפי אברון, סמן משטח מכתים עם נוגדנים מצומדת קרינה פלואורסצנטי?...

Watch this Scientific Journal Video about Multicolor Flow Cytometry-based Quantification of Mitochondria and Lysosomes in T Cells at JoVE.com

Multicolor Flow Cytometry-based Quantification of Mitochondria and Lysosomes in T Cells

מאמר זה מדגים שיטה חזקה לכמת המיטוכונדריה או lysosomes בתאים חיים. השילוב של צבעי ספציפיים ליזוזום או המיטוכונדריה עם נוגדנים fluorescently מצומדת סמני פני השטח מאפשר כימות של אלה organelles אוכלוסיות מעורבות לתאים, כמו ראשי תאים שנקטפו דגימות רקמה, באמצעות cytometry זרימה ססגוניות.

כימות מבוססי Cytometry זרימה ססגוניות של המיטוכונדריה, Lysosomes בתאי T

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular ...

שיטה זו יכולה לעזור לנו לענות על שאלות מפתח בתחום חילוף החומרים החיסנותי. היתרון של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת כימות של מיטוכונדריה או ליזוזומים בתאים חיים בודדים, בתערובת מורכבת של סוגי תאים שונים. שיטה זו לחקר תאי T ו- B יכולה להיות מיושמת גם על סוגי תאים רבים אחרים כגון מקרופאגים, תאים דנדריטיים או תאים ראשיים שנקטפו מדגימת רקמה.ההליך יוכח על ידי צ'ין-וון וואי, סטודנט לתואר שני מהמעבדה שלי. כדי לתייג את האורגנות לכמת, ראשית, הוסף פעם אחת עשר לתאי T של העכבר השישי לצינור פקס תחתון עגול אחד לכל סמן. ולכדור את התאים על ידי צנטריפוגה.מחומם מראש למדיום תרבות נטול סרום 37 מעלות כדי לדלל את פתרונות מלאי הבדיקה הספציפיים של organelle לריכוזי עבודה סופיים במדיום. ולהשעות מחדש את התאים ב100 microliters של צבע בדיקה לכל צינור. לאחר מכן, הדגירה את התאים באינקובטור תרבות התא לתקופת הכתמים המתאימה, לעצור את התגובה בסוף הדגירה עם מיליליטר אחד של חיץ פקס קר קרח לכל צינור.לאחר מכן, לאסוף את התאים עם צנטריפוגה אחרת ולהשעות מחדש את כדורי ב 100 microliters של pre-titrated 24G2 היברידית על הקרח. לאחר עשר דקות, הוסף מיליליטר אחד של מאגר פקס לצינור. לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה ולתייג את התאים עם 50 microliters של הפלואורסצנטיות מראש ציצים קוקטייל נוגדנים עניין.מוסיפים את הריכוז המתאים על פי הטבלה. ומאגר פקס במשך 20 דקות על קרח, מוגן מפני אור. בסוף הדגירה, להוסיף מיליליטר אחד של מאגר פקס לכל צינור.לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה. ולהשעות מחדש את התאים ב300 microliters של מאגר פקס בתוספת מיקרוגרם אחד למיליליטר של פרופידיום יודיד. מיד לאחר הוספת הנגד הגרעיני והכרומוזום, הפעל את מחשב ניתוח ציטומטר הזרימה, ציטומטר זרימה, תוכנה לרכישת פקסים וכל התקני עזר אחרים בהתאם לפלטפורמת המכונה.הפעל PBS דרך המערכת במשך כדקה אחת כדי להבטיח שקו הזרימה יתמלא במאגר PBS ונדן. פתח ניסוי חדש והגדר את הפרמטרים של הציטרומטר בהתאם להוראות היצרן. סנן את התאים באמצעות מסננת תאים של 70 מיקרומטר.ומערבולת לפני הרכישה של כל מדגם כדי למנוע גושים היווצרות כפולה. פתח את ההגדרה פיצוי אוטומטי וצור התוויות נקודה עבור כל פרמטר פלואורסצנטי. לאחר שכל המתחים נקבעו, התאימו את הפיצוי והחלו את הפיצוי על הדגימות.צור תרשים פיזור קדמי לעומת פיזור צד ומטב את המתחים כך ותאי העניין יופיעו בתוך ההתוויה. צור פיזור קדימה לעומת תרשים גובה פיזור קדימה ושער התאים הבודדים. צור אזור פיזור קדימה לעומת חלקת אזור פיזור בצד ושער הלימפוציטים.צור אזור פיזור קדימה לעומת חלקת יודיד פרופיד ושער התאים החיים. לאחר שכל המתחים נקבעו, התאימו את הפיצוי והחלו את הפיצוי על הדגימות. לאחר מכן לטעון את הצינור מדגם הראשון, ליצור את החלקות סמן פני התא המתאים, ולאסוף לפחות 1,000 אירועים של האוכלוסייה של עניין.לאחר הפעלת כל הדגימות, יצא את נתוני הזרימה לניתוח הבא. ולשמור את הניסוי כתבנית כדי לשמר את הגדרות הציטרומטר ופרמטרים לניסויים דומים בעתיד. תכולת המיטוכונדריה של האתר הסופי היא הנמוכה ביותר בתאי T שליליים כפולים, שיא בשלב שלילי כפול 2 ו-3, וירידה קלה בשלב שלילי כפול 4.עם thymocytes חיובי כפול המדגים מספרים גבוהים יותר של מיטוכונדריה מאשר CD4 ו CD8 תירוציטים חיוביים יחיד, מה שמרמז כי התוכן המיטוכונדריאלי להשתנות במהלך הפיתוח. CD4 ו- CD8 thymocytes חיובי יחיד להפגין עוצמת פלואורסצנטיות ממוצעת מיטוכונדריאלית גבוהה יותר מאשר תאים CD4 או CD8 T טחול, מה שמרמז כי תאי T נאיביים כי recirculate בסביבת הדם עשיר בחמצן יש מסה מיטוכונדרית נמוכה עוד יותר מאשר thymocytes. מעניין, הפחתה זו של תוכן המיטוכונדריאלי בולטת יותר ב- CD8 מאשר שושלת התאים CD4 T, והפעלת תא T מקטינה עוד יותר את נוכחותם של איברים אלה.תוכן ליזוזומלי נמוך יחסית, אך ניתן לגילוי, נצפה בכל אוכלוסיות התימוסיטים, עם נוכחות בולטת יותר בתימין אחד שלילי כפול. בפריפריה, מספר גבוה יחסית של ליזוזומים מזוהים בתאי T חיוביים של זיכרון ומחולל CD8. שילוב צבעים ספציפיים organelle וסמן פני השטח עם ציטומטריה זרימה היא דרך רבת עוצמה לאפיין את המצב המטבולי של תאים בתערובת מורכבת.ניתן להשתמש בצבע ספציפי נוסף של Organelle כדי לזהות רטיקולום אנדופלסמי, vacuole אוטופגי, או תא עניין תאי אחר.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Multicolor Flow Cytometry Analyses of Cellular Immune Response in Rhesus Macaques

Cytometry ססגוניות אנליזות זרימה של תגובה חיסונית תאית של קופי רזוס

The rhesus macaque model is currently the best available model for HIV-AIDS with respect to understanding the pathogenesis as well as for the development ...

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

התמרה retroviral של T-cell קולטנים עכבר מתאי T

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

שינוי מערכת Transposon piggyBac של תאי T אנושיים ראשוניים

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

The Use of Flow Cytometry to Assess the State of Chromatin in T Cells

השימוש בcytometry הזרימה מנת להעריך את המצב של הכרומטין בתאי T

During a proper immune response, quiescent T cells become activated upon antigen presentation to their antigen-specific T cell receptor. This leads to ...

Flow Cytometry-based Assay for the Monitoring of NK Cell Functions

Flow Cytometry מבוסס Assay עבור הניטור של פונקציות תא NK

Natural killer (NK) cells are an important part of the human tumor immune surveillance system. NK cells are able to distinguish between healthy and ...

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

להערכת תפקוד רשתית microglial Phagocytic<em&gt; In vivo</em&gt; שימוש cytometry זרימה מבוסס Assay

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Gamma Delta T Cells

ניתוח בידוד תזרים Cytometric של האדם תאים האנדוצרוויקאלית גמא דלתא T

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore ...

A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity

וזמינותו Cytotoxicity מבוססי Cytometry זרימה להערכה של פעילות תאי NK אנושי

Within the innate immune system, effector lymphocytes known as natural killer (NK) cells play an essential role in host defense against aberrant cells, ...

Quantification of Proliferating Human Antigen-specific CD4+ T Cells using Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester

Quantification of Proliferating Human Antigen-specific CD4+ T Cells using Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester

קוונפיקציה של מתרבים אנטיגן אנושי-ספציפי CD4+ T תאים באמצעות Carboxyפלואורומיתאת הדיקן אסתר

Described is a simple, in vitro, dye dilution-based method for measuring antigen-specific CD4+ T cell proliferation in human peripheral blood mononuclear ...

Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis

Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis

בידוד של עכבר כליות תושב CD8+ תאי T לניתוח ציטומטריה זרימה

Tissue-resident memory T cell (TRM) is a rapidly expanding field of immunology research. Isolating T cells from various non-lymphoid tissues is one of the ...