Name: determination of regulatory t cell subsets in murine thymus, pancreatic draining lymph node and spleen using flow cytometry
Uploaded: 2019-02-27T12:30:00
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本研究报告得到瑞典研究理事会、exodiab、瑞典糖尿病基金会、瑞典儿童糖尿病基金、seb diabetesfonden 和 o. e. och edla johansson vetenskapliga stiftelse 的资助。作者还要感谢 per-o拉·卡尔松和 stellan sandler 的支持和讨论。

乌普萨拉大学当地动物伦理委员会批准了这些动物实验。
1. 从动物身上收集器官
<ol><li>用颈椎脱位来牺牲小鼠。</li>
	<li>将胸腺腺体和脾脏放置在20毫升闪烁小瓶或15毫升的锥形管中, 其中填充5毫升的 hanks ' s 平衡盐溶液 (hbss)。将 pdln 放入充满 1 ml rpmi 1640 的 1.5 ml 微管中。使用整个胸腺和脾脏, 以及所有的 pdln。 请注意:器官应保持在冰上整个过程中, 调查人员?...

<ol>
	<li>Fontenot, J. D., Gavin, M. A., Rudensky, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foxp3+programs+the+development+and+function+of+CD4+CD25++regulatory+T+cells.">Foxp3 programs the development and function of CD4+CD25+ regulatory T cells.</a> Nature Immunology. 4 (4), 330-336 (2003).</li><li>Khattri, R., Cox, T., Yasayko, S. A., Ramsdell, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+essential+role+for+Scurfin+in+CD4+CD25++T+regulatory+cells.">An essential role for Scurfin in CD4+CD25+ T regulatory cells.</a> Nature Immunology. 4 (4), 337-342 (2003).</li><li>Hori, S., Nomura, T., Sakaguchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+regulatory+T+cell+development+by+the+transcription+factor+Foxp3.">Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3.</a> Science. 299 (5609), 1057-1061 (2003).</li><li>Sakaguchi, S., Sakaguchi, N., Asano, M., Itoh, M., Toda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunologic+self-tolerance+maintained+by+activated+T+cells+expressing+IL-2+receptor+alpha-chains+(CD25).+Breakdown+of+a+single+mechanism+of+self-tolerance+causes+various+autoimmune+diseases.">Immunologic self-tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alpha-chains (CD25). Breakdown of a single mechanism of self-tolerance causes various autoimmune diseases.</a> The Journal of Immunology. 155 (3), 1151-1164 (1995).</li><li>Vignali, D. A., Collison, L. W., Workman, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+regulatory+T+cells+work.">How regulatory T cells work.</a> Nature Review Immunology. 8 (7), 523-532 (2008).</li><li>Thornton, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+Helios,+an+Ikaros+transcription+factor+family+member,+differentiates+thymic-derived+from+peripherally+induced+Foxp3++T+regulatory+cells.">Expression of Helios, an Ikaros transcription factor family member, differentiates thymic-derived from peripherally induced Foxp3+ T regulatory cells.</a> The Journal of Immunology. 184 (7), 3433-3441 (2010).</li><li>Weiss, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropilin+1+is+expressed+on+thymus-derived+natural+regulatory+T+cells,+but+not+mucosa-generated+induced+Foxp3++T+reg+cells.">Neuropilin 1 is expressed on thymus-derived natural regulatory T cells, but not mucosa-generated induced Foxp3+ T reg cells.</a> Journal of Experimental Medicine. 209 (10), 1723-1742 (2012).</li><li>Yadav, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropilin-1+distinguishes+natural+and+inducible+regulatory+T+cells+among+regulatory+T+cell+subsets+in+vivo.">Neuropilin-1 distinguishes natural and inducible regulatory T cells among regulatory T cell subsets in vivo.</a> Journal of Experimental Medicine. 209 (10), S1711-S1719 (2012).</li><li>Singh, K., Hjort, M., Thorvaldson, L., Sandler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concomitant+analysis+of+Helios+and+Neuropilin-1+as+a+marker+to+detect+thymic+derived+regulatory+T+cells+in+naive+mice.">Concomitant analysis of Helios and Neuropilin-1 as a marker to detect thymic derived regulatory T cells in naive mice.</a> Scientific Reports. 5, 7767 (2015).</li><li>Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+single-cell+suspensions+from+mouse+spleen+with+the+gentleMACS+Dissociator.">Preparation of single-cell suspensions from mouse spleen with the gentleMACS Dissociator.</a> Journal of Visualized Experiments. (22), (2008).</li><li>Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardized+preparation+of+single-cell+suspensions+from+mouse+lung+tissue+using+the+gentleMACS+Dissociator.">Standardized preparation of single-cell suspensions from mouse lung tissue using the gentleMACS Dissociator.</a> Journal of Visualized Experiments. (29), (2009).</li><li>Singh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-35+administration+counteracts+established+murine+type+1+diabetes--possible+involvement+of+regulatory+T+cells.">Interleukin-35 administration counteracts established murine type 1 diabetes--possible involvement of regulatory T cells.</a> Scientific Reports. 5, 12633 (2015).</li><li>Digre, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+heparanase+enhances+T+lymphocyte+activities+and+intensifies+the+inflammatory+response+in+a+model+of+murine+rheumatoid+arthritis.">Overexpression of heparanase enhances T lymphocyte activities and intensifies the inflammatory response in a model of murine rheumatoid arthritis.</a> Scientific Reports. 7, 46229 (2017).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pro-tumoral+immune+cell+alterations+in+wild+type+and+Shb-deficient+mice+in+response+to+4T1+breast+carcinomas.">Pro-tumoral immune cell alterations in wild type and Shb-deficient mice in response to 4T1 breast carcinomas.</a> Oncotarget. 9 (27), 18720-18733 (2018).</li></ol>

在本研究中, 我们从 nod 小鼠胸腺、pdln 和脾脏中分离出单个细胞, 并利用流式细胞仪研究 cd4 + cd8-cd25 + Nrp1+treg 细胞中 helios 和 nrp1的表达.在本研究中, 使用了 nod 小鼠, 这是1型糖尿病的小鼠模型。在之前的一项研究中, 我们使用野生型小鼠株 cd-1 和 c57bl6 小鼠来研究 helios 或 nrp1 是否是区分 ttreg 细胞和 ptreg 细胞的更好标记。在这项研究中, 我们使用了类似的协议来确?...

调节 t (treg) 细胞对免疫系统的稳态是至关重要的。树状细胞是由表面抗原 cd4 和 cd25 的表达和转录因子叉头盒 p3 (foxp3)1,2,3的表达定义的。sakaguchi 等人首先表明, cd25 在小鼠4的 t 抑制细胞上有本构表达, 为人类树状细胞的鉴定提供了开拓性的观察。树状细胞在免疫耐受中发挥着核心作用, 通过各种机制施加抑制能力, 包括通过分泌粒酶进行细胞分裂, 诱导细胞凋亡, 细胞因子消耗和抑制通过细胞毒性的表达t 淋巴细胞抗原 45。此外, 它们还能分泌抑制细胞因子, 如转化生长因子β (tgf-β)、白细胞介素-10 (il-10) 和 il-355。树状细胞可以自然地从胸腺中提取, 在这种情况下, 它们被指定为胸腺衍生的 treg (treg) 细胞, 或者它们可以在外周器官中诱导, 在这种情况下被称为外周诱导的 treg (ptreg) 细胞。
helios 是 icaros 转录因子家族的成员, 据报道, 他是区分 ttreg 细胞和 ptreg 细胞6的标志。后来, 另外两个组报告说, 神经皮素 1 (nrp1), 一个信号素 iii 受体, 可以作为 ttreg 细胞的表面标记在一定条件下7,8。然而, singh 等人已经表明, 在这种情况下, helios 是一个更好的标记在天真的老鼠9。
特雷格细胞的亚群在维持免疫系统的稳态和防止自身免疫和感染方面发挥着关键作用。因此, 重要的是要确定这些人群在淋巴组织和非淋巴组织中的数量和比例。要做到这一点, 就必须准备从这些器官中获得单细胞悬浮液。在以前的研究中描述或使用了一些协议。主要是在以前发表的报告10、11 中使用了自动分离器。使用自动解拿是方便和节省时间, 但它是一个昂贵的程序。因此, 我们使用人工方法制备单细胞悬浮液从小鼠胸腺, 胰腺引流淋巴结 (pdln) 和脾脏从正常血糖非肥胖糖尿病 (nod) 小鼠, 以及从这些器官孤立的单个细胞。该方法已在以往的研究中得到应用, 我们发现人工制备单细胞悬浮液的方法与自动分离器方法9、12、13、14一样有效。此外, 我们使用流式细胞仪来确定 cd4+cd8-cd25 + fffp3+ treg 细胞的比例以及 treg 细胞 ttreg 和 treg 细胞的子集.利用 helios 和 nrp1 作为 ttreg 细胞的标记, 对 ttreg 和 treg 细胞进行了区分。因此, 我们的研究结果表明, 制备单细胞的人工方法确实有效地工作, 制备的单细胞悬浮液可进一步用于流式细胞仪的研究。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>NOD mice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>In-house breading</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Statens veterin&#228;rmedicinska anstalt</td>
			<td>991750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R0883-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4Cl</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>1011450500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>00-5523-00</td>
			<td>Contains Fixation/Permeabilization Concentrate , Fixation/Permeabilization Diluent and Permeabilization Buffer (10X)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eBioscience Flow Cytometry Staining Buffer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>00-4222-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4 Monoclonal Antibody (RM4-5), FITC, eBioscience</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11-0042-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD25 Monoclonal Antibody (PC61.5), PE, eBioscience</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12-0251-83</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Pharmingen&#160;APC-H7 Rat anti-Mouse CD8a</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Neuropilin-1 APC-conjugated Antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>FAB5994A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FOXP3 Monoclonal Antibody (FJK-16s), PE-Cyanine7, eBioscience</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>25-5773-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pacific Blue anti-mouse/human Helios Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>137220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>352235</td>
			<td>A 35 &#181;m nylon mesh is incorporated into the dual-position snap cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube 15ml, 120x17mm, PP</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro tube 1.5ml</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.690.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>disposable scintillation vials</td>
			<td>WHEATON</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometry</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometry analysis software</td>
			<td>Inivai Technologies</td>
			<td>Flowlogic</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determination of regulatory t cell subsets in murine thymus, pancreatic draining lymph node and spleen using flow cytometry

我们的免疫系统由多种免疫细胞组成, 包括调节 t 细胞 (treg)。树状细胞可分为胸腺衍生的特雷格 (treg) 细胞和外周诱导的 treg (treg) 细胞。它们存在于我们身体的不同器官中, 可以通过特定的标记来区分, 如 helios 和 neuspilin 1。据报道, ttreg 细胞在功能上比 ptreg 细胞更具有抑制作用。因此, 在研究异质细胞群时, 确定 ttreg 和 ptreg 细胞的比例是很重要的。在此, 我们收集胸腺腺体, 胰腺引流淋巴结和脾脏从正常血糖非肥胖糖尿病小鼠, 以区分 ttreg 细胞和皮纹细胞流式细胞检查。我们手动准备了这些器官的单个细胞悬浮液。采用氟铬共轭表面 cd4、cd8、cd25 和神经皮素1抗体对细胞进行染色。他们被关押在冰箱里过夜。第二天, 细胞被污染的氟铬共轭细胞内 fffp3 和 helios 抗体。这些标记被用来描述特雷格细胞的两个子集。该方案演示了一种简单而实用的方法来制备来自小鼠胸腺、胰腺引流淋巴结和脾脏的单细胞, 并将其用于随后的流式细胞仪分析。

目的探讨 nrp1 和 helios 在 ttreg 和 treg 细胞上的表达, 我们从正常血糖 nod 小鼠的胸腺腺体、pdln 和脾脏中制备了单个细胞, 并用特雷格细胞标记 cd4、cd25、fffp3、helios 和 nrp1 对它们进行流式细胞测定染色分析。如具有代表性的门控策略所示, 对结果进行了分析 (图 1)。我们发现, 在 cd4+cd8-cd8+ fffp3+ treg 细胞中, 所有三个器官...

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Determination of Regulatory T Cell Subsets in Murine Thymus, Pancreatic Draining Lymph Node and Spleen Using Flow Cytometry

流式细胞术测定小鼠胸腺、胰腺干淋巴结和脾脏的调节 t 细胞亚群

在此, 我们提出了一个方案, 以准备单细胞从小鼠胸腺, 胰腺引流淋巴结和脾脏, 进一步研究这些细胞使用流式细胞仪。此外, 该协议还用于使用流式细胞仪确定调节 t 细胞的子集。

Our immune system consists of a number and variety of immune cells including regulatory T cells (Treg) cells. Treg cells can be divided into two subsets, ...

该协议有助于研究免疫细胞在特定器官在健康和病理学中的作用。这种技术的主要优点是，这是一种经济高效的技术，因为它是一种手动技术。演示手术的将是我实验室的博士生罗正康。首先，将以前安乐死小鼠的胸腺和盐水放入20毫升闪烁的磷或15毫升锥形管中，填充5毫升汉克的平衡盐溶液。将胰腺排干淋巴结放入1.5毫升微管中，内注1mlRPMI-1640。确保使用整个胸腺和脾脏，以及所有的PDLN。在整个过程中，将器官放在冰上。用一把剪刀，彻底挤压胸腺和脾脏，释放免疫细胞。丢弃剩余的胸腺和胶囊。将细胞悬浮液转移到 15 ml 锥形管中。在433倍g和4摄氏度下离心5分钟，并丢弃上一代。为了对红血球进行解酶，在5ml的0.2摩尔氯化铵中重新悬浮细胞悬浮，并在室温下孵育10分钟。每两分钟轻轻反转一次管子。在孵育结束时，加入5mlHSSS，以阻止溶解。在433倍g和4摄氏度下离心管5分钟。丢弃上一级，并在约5ml的HSSS中重新悬浮细胞。然后，用HSSS填充管子。重复此过程，从离心样品到用 HBSS 填充管，一次。将管子再次以433倍g和4摄氏度离心5分钟。丢弃上一液，并在HSSS中重新悬浮颗粒。获得5毫升圆底管与细胞过滤器盖。通过将悬浮液应用于细胞应变盖，将 1 ml 的胸腺细胞悬浮液和 500 微升的胸腺细胞悬浮液转移到管中。首先，将15毫升锥形管放入机架中。将无菌的 250 微米金属网放在管子上。用 1 ml 的 RPMI 冲洗网格。接下来，将淋巴结转移到金属网，并使用一对钳子通过网格研磨它们。在网格上涂抹 1 ml RPMI，将细胞冲洗到管中。重复此过程，对每个样品进行三次淋巴结的转移和研磨，然后移除网格。将管子在433倍g和4摄氏度下离心5分钟。丢弃上一提液，在大约 5 ml 的 RPMI 中重新悬浮细胞。然后，用 RPMI 填充管子。重复此过程，从离心样品到用 RPMI 填充管，一次。再次以 433 倍 g 和 4 摄氏度离心管，5 分钟。丢弃上一提液，并在2mlRPMI中重新悬浮细胞颗粒。将 2 ml 的细胞悬浮液转移到 5 ml 圆底管中，带细胞应变盖。首先，将胸腺、脾脏和PDLN样品的悬浮液从433倍g和4摄氏度下离心5分钟。丢弃上一杯。用文本协议中概述的表面抗体染色细胞，并在冰上孵化管子40分钟。接下来，向每个管添加 200 微升的 FACS 缓冲液。在433倍g和4摄氏度下离心5分钟，然后丢弃上一代。重复此过程，添加缓冲区，离心，并丢弃上流液，一次。将细胞颗粒重新悬浮在500微升的渗透固定缓冲液中，以固定和渗透细胞。一夜之间将管子转移到四摄氏度的冰箱上。第二天，将管以433倍g和4摄氏度离心5分钟。丢弃上流剂，将细胞颗粒重新悬浮在500微升的渗透洗涤缓冲液中。将细胞再次以433倍g和4摄氏度离心5分钟，然后丢弃上一代。如文本协议中所述，用细胞内抗体染色细胞。在冰上孵化管子1小时。在此之后，在每个管中加入500微升的渗透洗涤缓冲液。在433倍g和4摄氏度的离心机5分钟。丢弃上流液，并在 500 微升渗透洗涤缓冲液中重新悬浮颗粒。在433倍g和4摄氏度下再次离心5分钟。丢弃上流液，在 300 微升 FACS 缓冲液中重新悬浮细胞颗粒。然后，分析流式细胞仪上的细胞，如文本协议中所述。在这项研究中，单细胞从正常血糖NOD小鼠的胸腺、PDLN和孢子分离，并染色与特雷格细胞标记、CD4、CD25、Foxp3、Helios和神经皮林-1进行流动细胞测量分析。结果被分析，并在这里显示为具有代表性的浇注策略。CD4阳性、CD8阴性、CD25阳性、Foxp3阳性Treg细胞中的太阳阳性细胞比例高于所有三个器官的Nrp1阳性细胞的比例。胸腺中超过80%的Treg细胞被看到表达太阳，高于PDLN和脾脏。在PDLN中，NrP1阳性细胞的比例高于胸腺或脾脏。大多数Nrp1阳性的Treg细胞也表达赫利奥斯，Nrp1阳性Treg细胞中赫利奥斯阳性细胞的比例在胸腺和脾脏中比在PDLN中高。总之，这些结果表明，Helios是检测T Treg细胞比Nrp1更好的标记。 淋巴结很小，但一些细胞内标记需要大量的细胞才能在流动细胞学中发出良好的信号。此过程后无法执行其他方法，因为单元格已染色和死亡。但是动物的四个细胞标记可以被替换，以研究其他类型的免疫细胞。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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Phagocytic cells such as alveolar macrophages and lung dendritic cells (LDCs) continuously sample antigens from the alveolar spaces in the 
lungs. LDCs, ...

科研

免疫与感染

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Ex vivo Imaging of T Cells in Murine Lymph Node Slices with Widefield and Confocal Microscopes

体外广角T细胞在小鼠淋巴结切片和共聚焦显微镜成像

Na&iuml;ve T cells continuously traffic to secondary lymphoid organs, including peripheral lymph nodes, to detect rare expressed antigens. The migration ...

Murine Superficial Lymph Node Surgery

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