Name: determination of regulatory t cell subsets in murine thymus, pancreatic draining lymph node and spleen using flow cytometry
Uploaded: 2019-02-27T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determination of Regulatory T Cell Subsets in Murine Thymus, Pancreatic Draining Lymph Node and Spleen Using Flow Cytometry at JoVE.com

Den foreliggende undersøgelse blev støttet økonomisk af det svenske Forskningsråd, EXODIAB, den svenske Diabetes Foundation, svenske barn Diabetes fond, SEB Diabetesfonden og O.E. och Edla Johanssons vetenskapliga stiftelse. Forfatterne vil gerne tak Per-Ola Carlsson og Stellan Sandler for deres støtte og diskussioner.

Den lokale Dyreetik ved Uppsala Universitet vedtaget af dyreforsøg.
1. høst organer fra dyr
<ol><li>Ofre mus af cervikal dislokation.</li>
	<li>Placer thymic kirtler og milt i 20 mL scintillationshætteglas eller 15 mL konisk rør fyldt med 5 mL af Hanks´ afbalanceret saltopløsning (HBSS). Sted PDLNs i 1.5 mL micro rør fyldt med 1 mL af RPMI 1640. Bruge hele thymus og milt, og alle PDLNs. Bemærk: Organer bør opbevares på is i hele proceduren, og investigator skal ...

<ol>
	<li>Fontenot, J. D., Gavin, M. A., Rudensky, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foxp3+programs+the+development+and+function+of+CD4+CD25++regulatory+T+cells.">Foxp3 programs the development and function of CD4+CD25+ regulatory T cells.</a> Nature Immunology. 4 (4), 330-336 (2003).</li><li>Khattri, R., Cox, T., Yasayko, S. A., Ramsdell, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+essential+role+for+Scurfin+in+CD4+CD25++T+regulatory+cells.">An essential role for Scurfin in CD4+CD25+ T regulatory cells.</a> Nature Immunology. 4 (4), 337-342 (2003).</li><li>Hori, S., Nomura, T., Sakaguchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+regulatory+T+cell+development+by+the+transcription+factor+Foxp3.">Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3.</a> Science. 299 (5609), 1057-1061 (2003).</li><li>Sakaguchi, S., Sakaguchi, N., Asano, M., Itoh, M., Toda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunologic+self-tolerance+maintained+by+activated+T+cells+expressing+IL-2+receptor+alpha-chains+(CD25).+Breakdown+of+a+single+mechanism+of+self-tolerance+causes+various+autoimmune+diseases.">Immunologic self-tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alpha-chains (CD25). Breakdown of a single mechanism of self-tolerance causes various autoimmune diseases.</a> The Journal of Immunology. 155 (3), 1151-1164 (1995).</li><li>Vignali, D. A., Collison, L. W., Workman, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+regulatory+T+cells+work.">How regulatory T cells work.</a> Nature Review Immunology. 8 (7), 523-532 (2008).</li><li>Thornton, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+Helios,+an+Ikaros+transcription+factor+family+member,+differentiates+thymic-derived+from+peripherally+induced+Foxp3++T+regulatory+cells.">Expression of Helios, an Ikaros transcription factor family member, differentiates thymic-derived from peripherally induced Foxp3+ T regulatory cells.</a> The Journal of Immunology. 184 (7), 3433-3441 (2010).</li><li>Weiss, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropilin+1+is+expressed+on+thymus-derived+natural+regulatory+T+cells,+but+not+mucosa-generated+induced+Foxp3++T+reg+cells.">Neuropilin 1 is expressed on thymus-derived natural regulatory T cells, but not mucosa-generated induced Foxp3+ T reg cells.</a> Journal of Experimental Medicine. 209 (10), 1723-1742 (2012).</li><li>Yadav, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropilin-1+distinguishes+natural+and+inducible+regulatory+T+cells+among+regulatory+T+cell+subsets+in+vivo.">Neuropilin-1 distinguishes natural and inducible regulatory T cells among regulatory T cell subsets in vivo.</a> Journal of Experimental Medicine. 209 (10), S1711-S1719 (2012).</li><li>Singh, K., Hjort, M., Thorvaldson, L., Sandler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concomitant+analysis+of+Helios+and+Neuropilin-1+as+a+marker+to+detect+thymic+derived+regulatory+T+cells+in+naive+mice.">Concomitant analysis of Helios and Neuropilin-1 as a marker to detect thymic derived regulatory T cells in naive mice.</a> Scientific Reports. 5, 7767 (2015).</li><li>Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+single-cell+suspensions+from+mouse+spleen+with+the+gentleMACS+Dissociator.">Preparation of single-cell suspensions from mouse spleen with the gentleMACS Dissociator.</a> Journal of Visualized Experiments. (22), (2008).</li><li>Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardized+preparation+of+single-cell+suspensions+from+mouse+lung+tissue+using+the+gentleMACS+Dissociator.">Standardized preparation of single-cell suspensions from mouse lung tissue using the gentleMACS Dissociator.</a> Journal of Visualized Experiments. (29), (2009).</li><li>Singh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-35+administration+counteracts+established+murine+type+1+diabetes--possible+involvement+of+regulatory+T+cells.">Interleukin-35 administration counteracts established murine type 1 diabetes--possible involvement of regulatory T cells.</a> Scientific Reports. 5, 12633 (2015).</li><li>Digre, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+heparanase+enhances+T+lymphocyte+activities+and+intensifies+the+inflammatory+response+in+a+model+of+murine+rheumatoid+arthritis.">Overexpression of heparanase enhances T lymphocyte activities and intensifies the inflammatory response in a model of murine rheumatoid arthritis.</a> Scientific Reports. 7, 46229 (2017).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pro-tumoral+immune+cell+alterations+in+wild+type+and+Shb-deficient+mice+in+response+to+4T1+breast+carcinomas.">Pro-tumoral immune cell alterations in wild type and Shb-deficient mice in response to 4T1 breast carcinomas.</a> Oncotarget. 9 (27), 18720-18733 (2018).</li></ol>

I denne undersøgelse, vi isoleret enkelt celler fra thymic kirtler, PDLNs og milt af NOD mus, og undersøgte udtryk af Helios og Nrp1 i CD4+CD8-CD25+Foxp3+ langsomme celler ved hjælp af flowcytometri. I den nuværende undersøgelse, blev der brugt NOD mus, som er en murine model af type 1 diabetes. I en tidligere undersøgelse, har vi brugt vildtype mus stammer CD-1 og C57BL/6 mus til at undersøge, om Helios eller Nrp1 er en bedre markør for at skelne tTreg celler fra pTreg...

Regulerende T (langsomme) celler er afgørende for homeostase af immunsystemet. Langsomme celler defineres af udtryk for overflade antigener CD4 og CD25 og transskription faktor forkhead boks P3 (Foxp3)1,2,3. Sakaguchi et al. først viste at CD25 udtrykkes constitutively på T suppressor cellerne i mus4, som gav en banebrydende observation til identifikation af langsomme menneskeceller. Langsomme celler spiller en central rolle i immuntolerance ved at udøve en suppressiv evne via en række mekanismer, herunder cytolysis gennem udskillelsen af granzymes til at inducere apoptose, cytokin forbrug og hæmning gennem udtryk for cytotoksisk T-lymfocytter antigen 45. Derudover kan de udskiller hæmmende cytokiner såsom omdanne vækst faktor beta (TGF-β), interleukin-10 (IL-10) og IL-355. Langsomme celler kan naturligvis være afledt af thymus, i hvilket tilfælde de er udpeget thymic afledte langsomme (tTreg) celler, eller de kan være fremkaldt i perifere organer i denne sag er kaldet perifert induceret langsomme (pTreg) celler.
Helios, et medlem af familien Ikaros transskription faktor var rapporteret til at være en markør for at skelne mellem tTreg celler og pTreg celler6. Senere, rapporterede to andre grupper, at Neuropilin 1 (Nrp1), en semaphorin III receptor, kunne tjene som en overflade markør for tTreg celler under visse betingelser7,8. Ikke desto mindre har Singh et al. vist, at Helios er et bedre markør i denne sammenhæng i naive mus9.
Delmængder af langsomme celler spiller en central rolle i opretholdelsen af homøostase i immunsystemet og beskyttelse mod autoimmunitet og infektion. Derfor er det vigtigt at bestemme de tal og proportioner af disse befolkningsgrupper i både lymfoide og ikke-lymfoide væv. For at opnå dette, skal man forberede enkelt celle suspensioner fra disse organer. Et antal protokoller er beskrevet eller anvendt i tidligere undersøgelser. Hovedsagelig, har automatiske dissociators været anvendt i tidligere offentliggjorte rapporter10,11. Ved hjælp af automatiske dissociators er praktisk og tidsbesparende, men det er en dyr procedure. Derfor har vi brugt en manuel metode for at forberede enkelt celle suspensioner fra murine thymic kirtler, milt og bugspytkirtlen afdrypning lymfeknuder (PDLNs) fra normoglycemic ikke-fede diabetisk (Nik) mus og isolerede enkelte celler fra disse organer. Denne metode har været brugt i vores tidligere undersøgelser og vi fandt, at den manuelle metode til forberedelse af enkelt cellesuspension er så effektiv som automatisk dissociator metode9,12,13,14. Desuden, vi brugt flowcytometri for at bestemme andelen af CD4+CD8-CD25+Foxp3+ langsomme celler og delmængder af langsomme celler tTreg og pTreg celler. TTreg og pTreg cellerne var kendetegnet ved hjælp af Helios og Nrp1 som markører for tTreg celle. Således, vores resultater viser, at den manuelle metode til forberedelse af de enkelte celler fungerer effektivt og forberedt enkelt celle suspensioner kan yderligere bruges til undersøgelser, flowcytometri.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>NOD mice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>In-house breading</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Statens veterin&#228;rmedicinska anstalt</td>
			<td>991750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R0883-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4Cl</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>1011450500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>00-5523-00</td>
			<td>Contains Fixation/Permeabilization Concentrate , Fixation/Permeabilization Diluent and Permeabilization Buffer (10X)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eBioscience Flow Cytometry Staining Buffer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>00-4222-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4 Monoclonal Antibody (RM4-5), FITC, eBioscience</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11-0042-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD25 Monoclonal Antibody (PC61.5), PE, eBioscience</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12-0251-83</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Pharmingen&#160;APC-H7 Rat anti-Mouse CD8a</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Neuropilin-1 APC-conjugated Antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>FAB5994A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FOXP3 Monoclonal Antibody (FJK-16s), PE-Cyanine7, eBioscience</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>25-5773-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pacific Blue anti-mouse/human Helios Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>137220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>352235</td>
			<td>A 35 &#181;m nylon mesh is incorporated into the dual-position snap cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube 15ml, 120x17mm, PP</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro tube 1.5ml</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.690.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>disposable scintillation vials</td>
			<td>WHEATON</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometry</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometry analysis software</td>
			<td>Inivai Technologies</td>
			<td>Flowlogic</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determination of regulatory t cell subsets in murine thymus, pancreatic draining lymph node and spleen using flow cytometry

Vores immunsystem består af et antal og en række af immunceller herunder regulerende T celler (langsomme) celler. Langsomme celler kan opdeles i to delmængder, thymic afledte langsomme (tTreg) celler og perifert induceret langsomme (pTreg) celler. De er til stede i forskellige organer i vores krop og kan være kendetegnet ved særlige markører, såsom Helios og Neuropilin 1. Det er blevet rapporteret, at tTreg celler er funktionelt mere undertrykkende end pTreg celler. Derfor er det vigtigt at bestemme andelen af både tTreg og pTreg celler, når undersøger heterogene cellepopulationer. Heri, indsamlet vi thymic kirtler, pancreas afdrypning lymfeknuder og milt fra normoglycemic ikke-fede diabetisk mus at skelne tTreg celler fra pTreg celler ved hjælp af flowcytometri. Vi forberedt manuelt enkelt celle suspensioner fra disse organer. Fluorokrom konjugeret overflade CD4, CD8, CD25, og Neuropilin 1 antistoffer blev brugt til at plette cellerne. De blev holdt i køleskabet natten over. Den næste dag, blev cellerne farves med fluorokrom konjugeret intracellulære Foxp3 og Helios antistoffer. Disse markører blev anvendt til at karakterisere de to delmængder af langsomme celler. Denne protokol viser en enkel men praktisk måde at forberede enkelt celler fra murine thymus, pancreas afdrypning lymfeknude og milt og bruge dem til efterfølgende flow cytometric analyse.

For at undersøge udtrykket af Nrp1 og Helios på tTreg og pTreg celler, vi forberedt enkelt celler fra thymic kirtler, PDLNs og milt af normoglycemic hilsen mus og farvede dem med langsomme celle markører CD4, CD25, Foxp3, Helios og Nrp1 for flow cytometric analyse. Resultaterne blev analyseret som vist i den repræsentative gating strategier (figur 1). Vi fandt, at andelen af Helios+ celler blandt CD4+CD8-CD25+Fo...

Watch this Scientific Journal Video about Determination of Regulatory T Cell Subsets in Murine Thymus, Pancreatic Draining Lymph Node and Spleen Using Flow Cytometry at JoVE.com

Determination of Regulatory T Cell Subsets in Murine Thymus, Pancreatic Draining Lymph Node and Spleen Using Flow Cytometry

Bestemmelse af regulerende T celle Subsets i Murine Thymus, pancreas afdrypning lymfeknude og milten ved hjælp af flowcytometri

Heri, præsenterer vi en protokol for at forberede enkelt celler fra murine thymus, bugspytkirtlen afløb lymfeknude og milt til yderligere undersøgelse disse celler ved hjælp af flowcytometri. Derudover blev denne protokol brugt til bestemmelse af delmængder af regulerende T-celler ved hjælp af flowcytometri.

Our immune system consists of a number and variety of immune cells including regulatory T cells (Treg) cells. Treg cells can be divided into two subsets, ...

Denne protokol hjælper med at undersøge immuncellernes rolle i bestemte organer i sundhed og patologi. Den største fordel ved denne teknik er, at dette er en omkostningseffektiv teknik, da det er en manuel teknik. Demonstration af proceduren vil være Zhengkang Luo, en ph.d.-studerende fra mit laboratorium.Til at begynde, placere thymic kirtler og milt fra tidligere aflivede mus i 20 ml scintillation phials, eller 15 ml koniske rør, fyldt med 5 ml af Hank's afbalanceret saltopløsning. Pancreas drænende lymfeknuder i 1,5 ml mikrorør fyldt med 1 ml RPMI-1640. Sørg for at bruge hele thymus og milt, og alle PDLNs.Hold organerne på is under hele proceduren. Ved hjælp af en saks, grundigt klemme thymus og milt til at frigive immunceller. Kassér de resterende thymiske og miltkapsler.Celleaffjedringen overføres til et 15 ml konisk rør. Centrifuge ved 433 gange g og ved 4 grader celsius i fem minutter, og kassér supernatanten. For at lyse de røde blodlegemer, re-suspension af celle suspension i 5 ml 0,2 Molar ammoniumchlorid, og inkubere ved stuetemperatur i ti minutter.Inverter rørene forsigtigt hvert andet minut. Ved inkubationens afslutning tilsættes 5 ml HBSS for at stoppe lysisen. Centrifuge rørene ved 433 gange g og ved 4 grader celsius i fem minutter.Kassér supernatanten, og ophæng cellerne igen i ca. 5 ml HBSS. Fyld derefter rørene med HBSS. Gentag denne proces, fra centrifugering af prøverne til påfyldning af røret med HBSS, én gang.Centrifuge rørene igen ved 433 gange g og ved fire grader celsius i fem minutter. Kassér supernatanten, og afspjræmp pelletet igen i HBSS. Der tilstå 5 ml rundbundede rør med cellestænsler.Suspensionen af thymiske celler og 500 mikroliter af miltcellesuspensionen overføres til rørene ved at påføre suspensionen på cellestimishætterne. Først skal du placere et 15 ml konisk rør i et stativ. Anbet et sterilt 250 mikrometermetalnet over røret.Masken skylles med 1 ml RPMI. Dernæst overføre lymfeknuder til metalnet og bruge et par pincet til at male dem gennem masken. Der påføres 1 ml RPMI på masken for at skylle cellerne ind i røret.Gentag denne proces med overførsel og slibning af lymfeknuder tre gange for hver prøve, og derefter fjerne masken. Centrifuge rørene ved 433 gange g og ved fire grader celsius i fem minutter. Supernatanten kasseres, og cellerne skal suspenderes igen i ca. 5 ml RPMI.Fyld derefter rørene med RPMI. Gentag denne proces, fra centrifugering af prøverne til påfyldning af røret med RPMI, én gang. Centrifuge rørene igen ved 433 gange g og ved fire grader celsius i fem minutter.Supernatanten kasseres, og cellepellet skal hænges igen i 2 ml RPMI. 2 ml af cellesuspensionen overføres til 5 ml rundbundede rør med cellestænsler. Først centrifuge celle suspension fra thymus, milt og PDLN prøver på 433 gange g og ved fire grader celsius i fem minutter.Kassér supernatanten. Plet cellerne med overflade antistoffer som skitseret i tekstprotokollen, og inkubere rørene på is i 40 minutter. Dernæst tilsættes 200 mikroliter FACS buffer til hvert rør.Centrifuge ved 433 gange g og ved fire grader celsius i fem minutter, og kassér supernatanten. Gentag denne proces, tilføje buffer, centrifugering, og kassere supernatant, én gang. Re-suspendere cellen pellet i 500 mikroliter af permeabilization fiksering buffer til at fastsætte og permeabilize cellerne.Overfør rørene til et køleskab ved fire grader celsius natten over. Den næste dag, centrifuge rørene på 433 gange g og ved fire grader celsius i fem minutter. Kassér supernatanten, og re-suspendere celle pellet i 500 mikroliter af permeabilization vask buffer.Centrifuge cellerne igen ved 433 gange g og ved fire grader celsius i fem minutter og kassér supernatanten. Pletcellerne med intracellulære antistoffer, som beskrevet i tekstprotokollen. Inkuber rørene på is i 1 time.Efter dette, tilsæt 500 mikroliter af permeabilization vask buffer til hvert rør. Centrifuge ved 433 gange g og ved fire grader celsius i fem minutter. Kassér supernatanten, og re-suspendere pellet i 500 mikroliter af permeabilization vask buffer.Centrifuge igen ved 433 gange g og ved fire grader celsius i fem minutter. Kassér supernatanten og re-suspendere celle pellet i 300 mikroliter af FACS buffer. Analyser derefter cellerne på et flowcytometer som beskrevet i tekstprotokollen.I denne undersøgelse, enkelt celler er isoleret fra thytomiske kirtler, PDLD'er og milt af normal glykæmisk NOD mus, og er plettet med Treg celle markører, CD4, CD25, Foxp3, Helios, og neuropilin-1 for flow cytometrisk analyse. Resultaterne analyseres og vises her som repræsentative gating strategier. Andelen af Helios-positive celler blandt cd4-positive, CD8-negative, CD25-positive, Foxp3-positive Treg-celler ses at være højere end for Nrp1-positive celler i alle tre organer.Mere end 80% af Treg celler i thymus ses at udtrykke Helios, som er højere end i PDLN, og milten. Andelen af NrP1-positive celler blandt Helios-positive Treg-celler ses at være højere i PDLN end i enten thymus eller milt. Størstedelen af Nrp1-positive Treg-celler udtrykker også Helios, og andelen af Helios-positive celler blandt Nrp1 positive Treg-celler ses at være højere i thymus og milt end i PDLN.Tilsammen indikerer disse resultater, at Helios er en bedre markør til at detektere T Treg-celler end Nrp1. Lymfeknuder er små, men nogle intracellulære markører kræver et stort antal celler for at give et godt signal i flowcytometri. Andre metoder kan ikke udføres efter denne procedure, fordi cellerne allerede er plettet og døde.Men dyrets fire cellemarkører kan erstattes for at studere andre typer immunceller.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Non-surgical Intratracheal Instillation of Mice with Analysis of Lungs and Lung Draining Lymph Nodes by Flow Cytometry

Phagocytic cells such as alveolar macrophages and lung dendritic cells (LDCs) continuously sample antigens from the alveolar spaces in the 
lungs. LDCs, ...

Ex vivo Imaging of T Cells in Murine Lymph Node Slices with Widefield and Confocal Microscopes

Ex vivo Imaging of T Cells in Murine Lymph Node Slices with Widefield and Confocal Microscopes

Na&iuml;ve T cells continuously traffic to secondary lymphoid organs, including peripheral lymph nodes, to detect rare expressed antigens. The migration ...

Murine Superficial Lymph Node Surgery

Murin Overfladisk lymfeknude Kirurgi

In the field of immunology, to understand the progression of an immune response against a vaccine, an infection or a tumour, the response is often ...

Intravital Imaging of the Mouse Popliteal Lymph Node

Intravital Billeddannelse af mus popliteale lymfeknude

Lymph nodes (LNs) are secondary lymphoid organs, which are strategically located throughout the body to allow for trapping and presentation of foreign ...

Generation of Lymph Node-fat Pad Chimeras for the Study of Lymph Node Stromal Cell Origin

Generering af lymfeknuder-fedt Pad kimærer for Studiet af lymfeknuder stromacelle Origin

The stroma is a key component of the lymph node structure and function. However, little is known about its origin, exact cellular composition and the ...

Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells

Isolering af murine lymfeknuder stromacellers

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and ...

Intracellular Staining and Flow Cytometry to Identify Lymphocyte Subsets within Murine Aorta, Kidney and Lymph Nodes in a Model of Hypertension

Intracellulær Farvning og flowcytometri at identificere lymfocytundergrupper inden Murine Aorta, Nyre og lymfeknuder i en model af hypertension

It is now well known that T lymphocytes play a critical role in the development of several cardiovascular diseases1,2,3,4,5. For example, studies from our ...

Measurement of T Cell Alloreactivity Using Imaging Flow Cytometry

Måling af T-celle alloreaktivitet Brug Imaging flowcytometri

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation og In Vitro kultur af Murine og menneskelige alveolær makrofager

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Characterization of Thymus-dependent and Thymus-independent Immunoglobulin Isotype Responses in Mice Using Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Karakterisering af Thymus-afhængige og Thymus-uafhængig Immunoglobulin Isotype svar i mus ved hjælp af enzym-forbundet Immunosorbent Assay

Antibodies, also termed as immunoglobulins (Ig), secreted by differentiated B lymphocytes, plasmablasts/plasma cells, in humoral immunity provide a ...