Name: determination of regulatory t cell subsets in murine thymus, pancreatic draining lymph node and spleen using flow cytometry
Uploaded: 2019-02-27T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determination of Regulatory T Cell Subsets in Murine Thymus, Pancreatic Draining Lymph Node and Spleen Using Flow Cytometry at JoVE.com

De huidige studie werd financieel ondersteund door de Zweedse Onderzoeksraad, EXODIAB, de Zweedse Diabetes Foundation, de Zweedse kind Diabetes Fonds, SEB Diabetesfonden en O.E. och Edla Johanssons vetenskapliga stiftelse. Auteurs wil ook bedankt Per-Ola Carlsson en Stellan Sandler voor hun ondersteunt en discussies.

Het Comité van de lokale dierlijke ethiek aan de Universiteit van Uppsala goedgekeurd de dierproeven.
1. het oogsten van organen van dieren
<ol><li>Offeren de muizen door cervicale dislocatie.</li>
	<li>Plaats serie klieren en milt in 20 mL Scintillatie flesjes of 15 mL conische buizen gevuld met 5 mL Hanks´ evenwichtig zoutoplossing (HBSS). Plaats PDLNs in 1,5 mL micro buizen gevuld met 1 mL RPMI 1640. Gebruik de hele zwezerik en milt, en alle van de PDLNs. Opmerking: ...

<ol>
	<li>Fontenot, J. D., Gavin, M. A., Rudensky, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foxp3+programs+the+development+and+function+of+CD4+CD25++regulatory+T+cells.">Foxp3 programs the development and function of CD4+CD25+ regulatory T cells.</a> Nature Immunology. 4 (4), 330-336 (2003).</li><li>Khattri, R., Cox, T., Yasayko, S. A., Ramsdell, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+essential+role+for+Scurfin+in+CD4+CD25++T+regulatory+cells.">An essential role for Scurfin in CD4+CD25+ T regulatory cells.</a> Nature Immunology. 4 (4), 337-342 (2003).</li><li>Hori, S., Nomura, T., Sakaguchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+regulatory+T+cell+development+by+the+transcription+factor+Foxp3.">Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3.</a> Science. 299 (5609), 1057-1061 (2003).</li><li>Sakaguchi, S., Sakaguchi, N., Asano, M., Itoh, M., Toda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunologic+self-tolerance+maintained+by+activated+T+cells+expressing+IL-2+receptor+alpha-chains+(CD25).+Breakdown+of+a+single+mechanism+of+self-tolerance+causes+various+autoimmune+diseases.">Immunologic self-tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alpha-chains (CD25). Breakdown of a single mechanism of self-tolerance causes various autoimmune diseases.</a> The Journal of Immunology. 155 (3), 1151-1164 (1995).</li><li>Vignali, D. A., Collison, L. W., Workman, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+regulatory+T+cells+work.">How regulatory T cells work.</a> Nature Review Immunology. 8 (7), 523-532 (2008).</li><li>Thornton, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+Helios,+an+Ikaros+transcription+factor+family+member,+differentiates+thymic-derived+from+peripherally+induced+Foxp3++T+regulatory+cells.">Expression of Helios, an Ikaros transcription factor family member, differentiates thymic-derived from peripherally induced Foxp3+ T regulatory cells.</a> The Journal of Immunology. 184 (7), 3433-3441 (2010).</li><li>Weiss, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropilin+1+is+expressed+on+thymus-derived+natural+regulatory+T+cells,+but+not+mucosa-generated+induced+Foxp3++T+reg+cells.">Neuropilin 1 is expressed on thymus-derived natural regulatory T cells, but not mucosa-generated induced Foxp3+ T reg cells.</a> Journal of Experimental Medicine. 209 (10), 1723-1742 (2012).</li><li>Yadav, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropilin-1+distinguishes+natural+and+inducible+regulatory+T+cells+among+regulatory+T+cell+subsets+in+vivo.">Neuropilin-1 distinguishes natural and inducible regulatory T cells among regulatory T cell subsets in vivo.</a> Journal of Experimental Medicine. 209 (10), S1711-S1719 (2012).</li><li>Singh, K., Hjort, M., Thorvaldson, L., Sandler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concomitant+analysis+of+Helios+and+Neuropilin-1+as+a+marker+to+detect+thymic+derived+regulatory+T+cells+in+naive+mice.">Concomitant analysis of Helios and Neuropilin-1 as a marker to detect thymic derived regulatory T cells in naive mice.</a> Scientific Reports. 5, 7767 (2015).</li><li>Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+single-cell+suspensions+from+mouse+spleen+with+the+gentleMACS+Dissociator.">Preparation of single-cell suspensions from mouse spleen with the gentleMACS Dissociator.</a> Journal of Visualized Experiments. (22), (2008).</li><li>Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardized+preparation+of+single-cell+suspensions+from+mouse+lung+tissue+using+the+gentleMACS+Dissociator.">Standardized preparation of single-cell suspensions from mouse lung tissue using the gentleMACS Dissociator.</a> Journal of Visualized Experiments. (29), (2009).</li><li>Singh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-35+administration+counteracts+established+murine+type+1+diabetes--possible+involvement+of+regulatory+T+cells.">Interleukin-35 administration counteracts established murine type 1 diabetes--possible involvement of regulatory T cells.</a> Scientific Reports. 5, 12633 (2015).</li><li>Digre, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+heparanase+enhances+T+lymphocyte+activities+and+intensifies+the+inflammatory+response+in+a+model+of+murine+rheumatoid+arthritis.">Overexpression of heparanase enhances T lymphocyte activities and intensifies the inflammatory response in a model of murine rheumatoid arthritis.</a> Scientific Reports. 7, 46229 (2017).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pro-tumoral+immune+cell+alterations+in+wild+type+and+Shb-deficient+mice+in+response+to+4T1+breast+carcinomas.">Pro-tumoral immune cell alterations in wild type and Shb-deficient mice in response to 4T1 breast carcinomas.</a> Oncotarget. 9 (27), 18720-18733 (2018).</li></ol>

In deze studie, we geïsoleerd van enkele cellen uit de serie klieren, de PDLNs en de milt van knik muizen, en onderzocht de expressie van Helios en Nrp1 in CD4+CD8-CD25+Foxp3+ Treg cellen met behulp van stroom cytometry. In de huidige studie, werden knik muizen gebruikt, die is een lymfkliertest model van type 1 diabetes. In een eerdere studie, hebben we de wild type muis stammen CD-1 en C57BL/6 muizen gebruikt om te onderzoeken of Helios of Nrp1 een betere marker is voor tTre...

Regulatoire T (Walter) cellen zijn kritisch voor de homeostase van het immuunsysteem. Treg cellen worden gedefinieerd door de uitdrukking van oppervlakte antigenen CD4 en CD25, en de transcriptie factor forkhead vak P3 (Foxp3)1,2,3. Sakaguchi et al. toonde eerst dat CD25 constitutively op T suppressor cellen in muizen4, die een baanbrekende constatering voor de identificatie van menselijke Treg cellen wordt uitgedrukt. Treg cellen spelen een centrale rol bij immuun tolerantie door uit te oefenen een onderdrukkende mogelijkheid via diverse mechanismen, met inbegrip van cytolysis via de secretie van granzymes voor het opwekken van apoptosis, cytokine consumptie en remming door middel van de expressie van cytotoxische T-lymfocyten antigeen 45. Bovendien kunnen ze remmende cytokines zoals transformeren groeifactor bèta (TGF-β), interleukine-10 (IL-10) en IL-355afscheiden. Treg cellen kunnen natuurlijk worden afgeleid uit de thymus, in welk geval zij serie afgeleide Treg (tTreg)-cellen zijn aangewezen, of ze kunnen in dat geval heten ook geïnduceerde Treg (pTreg) cellen in het perifere organen worden opgewekt.
Helios, een lid van de familie Ikaros transcriptie factor werd gemeld dat een marker voor onderscheid te maken tussen tTreg cellen en pTreg cellen6. Later, twee andere groepen gemeld dat Neuropilin 1 (Nrp1), een semaphorin III-receptor, als een oppervlak marker voor tTreg cellen onder bepaalde voorwaarden7,8 dienen kan. Toch, Singh et al. is gebleken dat Helios een betere marker in dit verband in naïef muizen9.
De deelverzamelingen van Treg cellen spelen een centrale rol in het behoud van de homeostase van het immuunsysteem en de bescherming tegen autoimmuniteit en infectie. Daarom is het belangrijk om de getallen en verhoudingen van deze populaties in zowel de lymfoïde en de niet-lymfoïde weefsels. Om dit te bereiken, moet een eencellige schorsingen van deze organen voor te bereiden. Een aantal protocollen zijn beschreven of gebruikt in eerdere studies. Automatische dissociators werden vooral gebruikt in eerder gepubliceerde rapporten10,11. Met behulp van de automatische dissociators is handig en tijdbesparend, maar het is een dure procedure. Daarom hebben we een handmatige methode gebruikt om te bereiden eencellige schorsingen van lymfkliertest serie klieren, de alvleesklier zuig lymfklieren (PDLNs) en de milt van normoglycemic nietzwaarlijvige diabetesmuizen (NOD) en geïsoleerde afzonderlijke cellen van deze organen. Deze methode is gebruikt in onze eerdere studies en we vonden dat de handmatige methode voor het opstellen van één celsuspensie zo efficiënt als automatische dissociator methode9,12,13,14 is. Bovendien, we stroom cytometry gebruikt om te bepalen van de verhoudingen van CD4+CD8-CD25+Foxp3+ Treg cellen en de subsets van Treg cellen tTreg en pTreg cellen. De tTreg en pTreg cellen werden onderscheiden met behulp van Helios en Nrp1 als markeringen voor tTreg cel. Zo blijkt uit onze resultaten dat de handmatige methode voor het voorbereiden van de afzonderlijke cellen efficiënt werkt en de schorsingen bereid eencellige verder kunnen worden gebruikt voor studies met stroom cytometry.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>NOD mice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>In-house breading</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Statens veterin&#228;rmedicinska anstalt</td>
			<td>991750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R0883-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4Cl</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>1011450500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>00-5523-00</td>
			<td>Contains Fixation/Permeabilization Concentrate , Fixation/Permeabilization Diluent and Permeabilization Buffer (10X)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eBioscience Flow Cytometry Staining Buffer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>00-4222-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4 Monoclonal Antibody (RM4-5), FITC, eBioscience</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11-0042-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD25 Monoclonal Antibody (PC61.5), PE, eBioscience</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12-0251-83</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Pharmingen&#160;APC-H7 Rat anti-Mouse CD8a</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Neuropilin-1 APC-conjugated Antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>FAB5994A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FOXP3 Monoclonal Antibody (FJK-16s), PE-Cyanine7, eBioscience</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>25-5773-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pacific Blue anti-mouse/human Helios Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>137220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>352235</td>
			<td>A 35 &#181;m nylon mesh is incorporated into the dual-position snap cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube 15ml, 120x17mm, PP</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro tube 1.5ml</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.690.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>disposable scintillation vials</td>
			<td>WHEATON</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometry</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometry analysis software</td>
			<td>Inivai Technologies</td>
			<td>Flowlogic</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determination of regulatory t cell subsets in murine thymus, pancreatic draining lymph node and spleen using flow cytometry

Ons immuunsysteem bestaat uit een aantal en de verscheidenheid van immune cellen, met inbegrip van regulatoire T-cellen (Walter) cellen. Treg cellen kunnen worden onderverdeeld in twee subgroepen, serie afgeleide Treg (tTreg)-cellen en ook geïnduceerde Treg (pTreg) cellen. Ze zijn in verschillende organen van ons lichaam aanwezig en kunnen worden onderscheiden door specifieke markers, zoals Helios en Neuropilin 1. Er werd gemeld dat de tTreg cellen functioneel meer onderdrukkende dan pTreg cellen zijn. Het is daarom belangrijk om te bepalen van het aandeel van zowel tTreg als pTreg cellen, bij het onderzoeken van heterogene cel populaties. Hierin, verzameld wij serie klieren, de alvleesklier zuig lymfklieren en de milt van normoglycemic nietzwaarlijvige diabetesmuizen te onderscheiden van de tTreg cellen van pTreg cellen met behulp van stroom cytometry. Wij kunnen handmatig eencellige schorsingen van deze organen. Fluorescerende geconjugeerd oppervlakte CD4, CD8, CD25 en Neuropilin 1 antilichamen werden gebruikt om de cellen vlek. Ze waren 's nachts in de koelkast bewaren. Op de volgende dag waren de cellen gekleurd met fluorescerende geconjugeerd intracellulaire Foxp3 en Helios antilichamen. Deze markeringen werden gebruikt voor het karakteriseren van de twee subsets van Treg cellen. Dit protocol toont een eenvoudige, maar praktische manier voor te bereiden enkele cellen uit lymfkliertest thymus, alvleesklier aftappen lymfeklier en milt en ze gebruiken voor latere flow cytometrische analyse.

Om te onderzoeken de uitdrukking van Nrp1 en Helios op tTreg en pTreg cellen, wij bereid enkele cellen uit de serie klieren, PDLNs en de milt van normoglycemic knik muizen en gekleurd hen met de Treg cel markeringen CD4, CD25, Foxp3, Helios en Nrp1 voor stroom cytometrische analyse. De resultaten werden geanalyseerd zoals aangegeven in de vertegenwoordiger gating strategieën (Figuur 1). We vonden dat het aandeel van Helios+ cellen onder CD4+<...

Watch this Scientific Journal Video about Determination of Regulatory T Cell Subsets in Murine Thymus, Pancreatic Draining Lymph Node and Spleen Using Flow Cytometry at JoVE.com

Determination of Regulatory T Cell Subsets in Murine Thymus, Pancreatic Draining Lymph Node and Spleen Using Flow Cytometry

Bepaling van regelgevende T cel Subsets in lymfkliertest Thymus, alvleesklier aftappen lymfeklier en milt met behulp van Stroom Cytometry

Hierin presenteren wij een protocol om te bereiden enkele cellen uit lymfkliertest thymus, alvleesklier aftappen lymfeklier en milt aan verdere studie deze cellen met behulp van stroom cytometry. Bovendien, werd dit protocol gebruikt voor het bepalen van de deelverzamelingen van regulatoire T-cellen met behulp van stroom cytometry.

Our immune system consists of a number and variety of immune cells including regulatory T cells (Treg) cells. Treg cells can be divided into two subsets, ...

Dit protocol helpt bij het onderzoeken van de rol van immuuncellen in bepaalde organen in gezondheid en pathologie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat dit een kosteneffectieve techniek is omdat het een handmatige techniek is. Het aantonen van de procedure zal Zhengkang Luo, een promovendus uit mijn laboratorium.Om te beginnen, plaats de thymische klieren en milt van eerder geëuthanaseerde muizen in 20 ml scintillatie phials, of 15 ml conische buizen, gevuld met 5 ml van hank's evenwichtige zoutoplossing. Plaats de alvleesklierafvoerende lymfeklieren in 1,5 ml microbuizen gevuld met 1 ml RPMI-1640. Zorg ervoor dat u de hele thymus en milt en alle PDLN's gebruikt.Houd de organen op ijs gedurende de hele procedure. Met behulp van een schaar, grondig knijp de thymus en milt om de immuuncellen vrij te geven. Gooi de resterende thymische en miltcapsules weg.Breng de celsuspensie over op een conische buis van 15 ml. Centrifuge op 433 keer g en bij 4 graden celsius gedurende vijf minuten, en gooi de supernatant. Om de rode bloedcellen te lyse, de celsuspensie opnieuw op te schorten in 5 ml 0,2 Molar ammoniumchloride en tien minuten bij kamertemperatuur in te broeden.Keer de buizen voorzichtig om om de twee minuten. Voeg aan het einde van de incubatie 5 ml HBSS toe om de lyse te stoppen. Centrifugeren de buizen op 433 keer g en bij 4 graden celsius gedurende vijf minuten.Gooi de supernatant weg en schort de cellen opnieuw op in ongeveer 5 ml HBSS. Vul vervolgens de buizen met HBSS. Herhaal dit proces, van het centrifugeren van de monsters tot het vullen van de buis met HBSS, een keer.Centrifuge de buizen nogmaals op 433 keer g en op vier graden celsius gedurende vijf minuten. Gooi de supernatant weg en hang de pellet opnieuw op in HBSS. Verkrijg 5 ml ronde bodembuizen met cel-zeefdoppen.Breng 1 ml van de thymische celsuspensie en 500 microliter van de splenic celsuspensie naar de buizen door de suspensie op de celsefdoppen aan te brengen. Plaats eerst een conische buis van 15 ml in een rek. Plaats een steriele 250 micrometer metalen gaas over de buis.Spoel het gaas af met 1 ml RPMI. Breng vervolgens de lymfeklieren over op het metalen gaas en gebruik een pincet om ze door het gaas te malen. Breng 1 ml RPMI aan op het gaas om de cellen in de buis te spoelen.Herhaal dit proces van het overbrengen en slijpen van de lymfeklieren drie keer voor elk monster, en verwijder vervolgens het gaas. Centrifugeren de buizen op 433 keer g en op vier graden Celsius gedurende vijf minuten. Gooi de supernatant weg en schort de cellen opnieuw op in ongeveer 5 ml RPMI.Vul vervolgens de buizen met RPMI. Herhaal dit proces, van het centrifugeren van de monsters tot het vullen van de buis met RPMI, een keer. Centrifuge de buizen weer op 433 keer g en op vier graden celsius gedurende vijf minuten.Gooi de supernatant weg en hang de celpellet opnieuw op in 2 ml RPMI. Breng 2 ml van de celsuspensie over in 5 ml ronde bodembuizen met celzeefdoppen. Vercentrifugeren eerst de celsuspensie van de thymus-, milt- en PDLN-monsters bij 433 keer g en vijf minuten bij vier graden Celsius.Gooi de supernatant weg. Bevlek de cellen met oppervlakteantilichamen zoals beschreven in het tekstprotocol en ontcubeer de buizen gedurende 40 minuten op ijs. Voeg vervolgens 200 microliters facs-buffer toe aan elke buis.Centrifuge op 433 keer g en op vier graden Celsius gedurende vijf minuten, en gooi de supernatant. Herhaal dit proces, het toevoegen van de buffer, centrifugeren, en het weggooien van de supernatant, een keer. Schort de celpellet opnieuw op in 500 microliter permeabilisatiefixatiebuffer om de cellen te fixeren en te doordrenabiliseren.Breng de buizen 's nachts op vier graden celsius naar een koelkast. De volgende dag, centrifuge de buizen op 433 keer g en op vier graden Celsius gedurende vijf minuten. Gooi de supernatant weg en hang de celpellet opnieuw op in 500 microliter permeabilisatiewasbuffer.Centrifugeren de cellen weer op 433 keer g en op vier graden Celsius gedurende vijf minuten en gooi de supernatant. Bevlek de cellen met intracellulaire antilichamen, zoals beschreven in het tekstprotocol. Broed de buizen 1 uur op ijs.Voeg hierna 500 microliter permeabilisatiewasbuffer toe aan elke buis. Centrifuge op 433 keer g en op vier graden celsius gedurende vijf minuten. Gooi de supernatant weg en hang de pellet opnieuw op in 500 microliter permeabilisatiewasbuffer.Centrifuge nogmaals op 433 keer g en op vier graden celsius gedurende vijf minuten. Gooi de supernatant weg en hang de celpellet opnieuw op in 300 microliter facs-buffer. Analyseer vervolgens de cellen op een stroomcytometer, zoals beschreven in het tekstprotocol.In deze studie worden enkele cellen geïsoleerd van thymische klieren, PDLN's en milt van normale glycemische NOD-muizen en zijn ze gekleurd met Treg-celmarkers, CD4, CD25, Foxp3, Helios en neuropilin-1 voor stromingscytometrische analyse. De resultaten worden geanalyseerd en worden hier weergegeven als representatieve gating strategieën. Het aandeel van Helios-positieve cellen onder de CD4-positieve, CD8-negatieve, CD25-positieve, Foxp3-positieve Treg cellen wordt gezien als hoger dan dat van Nrp1-positieve cellen in alle drie de organen.Meer dan 80% van de Treg-cellen in de thymus wordt gezien om Helios uit te drukken, wat hoger is dan in de PDLN, en de milt. Het aandeel van nrp1-positieve cellen onder Helios-positieve Treg cellen wordt gezien om hoger in PDLN te zijn dan die in of de thymus of milt. De meerderheid van de Nrp1-positieve Treg cellen ook uitdrukken Helios, en het aandeel van Helios-positieve cellen onder Nrp1 positieve Treg cellen wordt gezien als hoger in de thymus en milt dan in de PDLN.Samen geven deze resultaten aan dat Helios een betere marker is om T Treg-cellen te detecteren dan Nrp1. Lymfeklieren zijn klein, maar sommige intracellulaire markers vereisen een groot aantal cellen om een goed signaal in flow cytometrie te geven. Andere methoden kunnen niet worden uitgevoerd na deze procedure, omdat de cellen al zijn gekleurd en dood.Maar de vier celmarkers van het dier kunnen worden vervangen om andere soorten immuuncellen te bestuderen.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Non-surgical Intratracheal Instillation of Mice with Analysis of Lungs and Lung Draining Lymph Nodes by Flow Cytometry

Niet-chirurgische intratracheale Instillatie van Muizen met Analyse van de longen en Lung drainerende lymfeklieren door middel van flowcytometrie

Phagocytic cells such as alveolar macrophages and lung dendritic cells (LDCs) continuously sample antigens from the alveolar spaces in the 
lungs. LDCs, ...

Ex vivo Imaging of T Cells in Murine Lymph Node Slices with Widefield and Confocal Microscopes

Ex vivo Imaging of T Cells in Murine Lymph Node Slices with Widefield and Confocal Microscopes

Ex vivo beeldvorming van T-cellen in muizen lymfkliertest Plakjes met Widefield en confocale microscopen

Na&iuml;ve T cells continuously traffic to secondary lymphoid organs, including peripheral lymph nodes, to detect rare expressed antigens. The migration ...

Murine Superficial Lymph Node Surgery

Murine Oppervlakkige lymfkliertest Chirurgie

In the field of immunology, to understand the progression of an immune response against a vaccine, an infection or a tumour, the response is often ...

Intravital Imaging of the Mouse Popliteal Lymph Node

Intravitale Imaging van de muis knieholte lymfkliertest

Lymph nodes (LNs) are secondary lymphoid organs, which are strategically located throughout the body to allow for trapping and presentation of foreign ...

Generation of Lymph Node-fat Pad Chimeras for the Study of Lymph Node Stromal Cell Origin

The stroma is a key component of the lymph node structure and function. However, little is known about its origin, exact cellular composition and the ...

Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells

Isolatie van muizen lymfkliertest stromale cellen

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and ...

Intracellular Staining and Flow Cytometry to Identify Lymphocyte Subsets within Murine Aorta, Kidney and Lymph Nodes in a Model of Hypertension

Intracellulaire kleuring en flowcytometrie om lymfocyten in muizen Aorta, nieren en lymfeklieren te identificeren in een Model of Hypertension

It is now well known that T lymphocytes play a critical role in the development of several cardiovascular diseases1,2,3,4,5. For example, studies from our ...

Measurement of T Cell Alloreactivity Using Imaging Flow Cytometry

Meting van de T-cel alloreactiviteit Met behulp van Imaging flowcytometrie

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolatie en In Vitro cultuur van lymfkliertest en menselijke alveolaire macrofagen

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Characterization of Thymus-dependent and Thymus-independent Immunoglobulin Isotype Responses in Mice Using Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Karakterisering van zwezerik-afhankelijke en Thymus-onafhankelijke Immunoglobulin Isotype reacties in muizen met behulp van Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Antibodies, also termed as immunoglobulins (Ig), secreted by differentiated B lymphocytes, plasmablasts/plasma cells, in humoral immunity provide a ...