Name: determination of regulatory t cell subsets in murine thymus, pancreatic draining lymph node and spleen using flow cytometry
Uploaded: 2019-02-27T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determination of Regulatory T Cell Subsets in Murine Thymus, Pancreatic Draining Lymph Node and Spleen Using Flow Cytometry at JoVE.com

현재 연구는 스웨덴 연구 위원회, EXODIAB, 스웨덴 당뇨병 재단, 스웨덴 어린이 당뇨병 펀드, 셉 Diabetesfonden 및 O.E. 그리고 Edla Johanssons vetenskapliga stiftelse에 의해 재정적으로 지원 되었다. 저자 또한 감사 당-올라요 Carlsson Stellan 샌들러 그들의 지원 및 토론에 대 한 같은 것 이다.

웁살라 대학에서 로컬 동물 윤리 위원회 동물 실험 승인.
1. 동물에서 장기 수확
<ol><li>자 궁 경부 전위에 의해 쥐를 희생.</li>
	<li>Thymic 샘 놓고 20 mL 섬광 튜브 또는 15 mL 원뿔 튜브 Hanks´의 5 mL로 가득 spleens 균형 소금물 (HBSS). 1.5 mL 마이크로 튜브 RPMI 1640의 1 mL로 가득에서 장소 PDLNs. 전체 thymus, 비장, 그리고 모든 PDLNs를 사용 합니다. 참고: 기관 절차에 걸쳐 얼음?...

<ol>
	<li>Fontenot, J. D., Gavin, M. A., Rudensky, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foxp3+programs+the+development+and+function+of+CD4+CD25++regulatory+T+cells.">Foxp3 programs the development and function of CD4+CD25+ regulatory T cells.</a> Nature Immunology. 4 (4), 330-336 (2003).</li><li>Khattri, R., Cox, T., Yasayko, S. A., Ramsdell, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+essential+role+for+Scurfin+in+CD4+CD25++T+regulatory+cells.">An essential role for Scurfin in CD4+CD25+ T regulatory cells.</a> Nature Immunology. 4 (4), 337-342 (2003).</li><li>Hori, S., Nomura, T., Sakaguchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+regulatory+T+cell+development+by+the+transcription+factor+Foxp3.">Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3.</a> Science. 299 (5609), 1057-1061 (2003).</li><li>Sakaguchi, S., Sakaguchi, N., Asano, M., Itoh, M., Toda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunologic+self-tolerance+maintained+by+activated+T+cells+expressing+IL-2+receptor+alpha-chains+(CD25).+Breakdown+of+a+single+mechanism+of+self-tolerance+causes+various+autoimmune+diseases.">Immunologic self-tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alpha-chains (CD25). Breakdown of a single mechanism of self-tolerance causes various autoimmune diseases.</a> The Journal of Immunology. 155 (3), 1151-1164 (1995).</li><li>Vignali, D. A., Collison, L. W., Workman, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+regulatory+T+cells+work.">How regulatory T cells work.</a> Nature Review Immunology. 8 (7), 523-532 (2008).</li><li>Thornton, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+Helios,+an+Ikaros+transcription+factor+family+member,+differentiates+thymic-derived+from+peripherally+induced+Foxp3++T+regulatory+cells.">Expression of Helios, an Ikaros transcription factor family member, differentiates thymic-derived from peripherally induced Foxp3+ T regulatory cells.</a> The Journal of Immunology. 184 (7), 3433-3441 (2010).</li><li>Weiss, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropilin+1+is+expressed+on+thymus-derived+natural+regulatory+T+cells,+but+not+mucosa-generated+induced+Foxp3++T+reg+cells.">Neuropilin 1 is expressed on thymus-derived natural regulatory T cells, but not mucosa-generated induced Foxp3+ T reg cells.</a> Journal of Experimental Medicine. 209 (10), 1723-1742 (2012).</li><li>Yadav, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropilin-1+distinguishes+natural+and+inducible+regulatory+T+cells+among+regulatory+T+cell+subsets+in+vivo.">Neuropilin-1 distinguishes natural and inducible regulatory T cells among regulatory T cell subsets in vivo.</a> Journal of Experimental Medicine. 209 (10), S1711-S1719 (2012).</li><li>Singh, K., Hjort, M., Thorvaldson, L., Sandler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concomitant+analysis+of+Helios+and+Neuropilin-1+as+a+marker+to+detect+thymic+derived+regulatory+T+cells+in+naive+mice.">Concomitant analysis of Helios and Neuropilin-1 as a marker to detect thymic derived regulatory T cells in naive mice.</a> Scientific Reports. 5, 7767 (2015).</li><li>Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+single-cell+suspensions+from+mouse+spleen+with+the+gentleMACS+Dissociator.">Preparation of single-cell suspensions from mouse spleen with the gentleMACS Dissociator.</a> Journal of Visualized Experiments. (22), (2008).</li><li>Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardized+preparation+of+single-cell+suspensions+from+mouse+lung+tissue+using+the+gentleMACS+Dissociator.">Standardized preparation of single-cell suspensions from mouse lung tissue using the gentleMACS Dissociator.</a> Journal of Visualized Experiments. (29), (2009).</li><li>Singh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-35+administration+counteracts+established+murine+type+1+diabetes--possible+involvement+of+regulatory+T+cells.">Interleukin-35 administration counteracts established murine type 1 diabetes--possible involvement of regulatory T cells.</a> Scientific Reports. 5, 12633 (2015).</li><li>Digre, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+heparanase+enhances+T+lymphocyte+activities+and+intensifies+the+inflammatory+response+in+a+model+of+murine+rheumatoid+arthritis.">Overexpression of heparanase enhances T lymphocyte activities and intensifies the inflammatory response in a model of murine rheumatoid arthritis.</a> Scientific Reports. 7, 46229 (2017).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pro-tumoral+immune+cell+alterations+in+wild+type+and+Shb-deficient+mice+in+response+to+4T1+breast+carcinomas.">Pro-tumoral immune cell alterations in wild type and Shb-deficient mice in response to 4T1 breast carcinomas.</a> Oncotarget. 9 (27), 18720-18733 (2018).</li></ol>

이 연구에서 우리는 thymic 동맥, PDLNs 및 끄 덕 임 쥐의 spleens에서 단일 셀을 절연 하 고 헬 리오스와 CD4에 Nrp1의 식을 조사+CD8-CD25+Foxp3+ Treg 세포 cytometry 사용 하 여. 현재 연구는 타입-1 당뇨병의 murine 모델은 끄 덕 임 쥐가 사용 되었다. 이전 연구에서 우리는 헬 리오스 또는 Nrp1 tTreg pTreg 세포에서 세포를 구별을 위한 더 나은 표식 인지를 조사 하는 야생 타입 마우스 C...

규정 (Treg) T 세포는 면역 시스템의 항상 성에 대 한 중요 합니다. Treg 세포 표면 항 원 c d 4의 식와 CD25, 및 녹음 방송 요인 forkhead 상자 P3 (Foxp3)1,2,3에 의해 정의 됩니다. 사 카 구치 외. 먼저 CD25 constitutively 쥐4, 인간 Treg 세포의 식별에 대 한 선구적인 관찰을 제공 하는 T 억제기 세포에 표현 된 보여주었다. Treg 세포 apoptosis, cytokine 소비 및 세포 독성의 표현을 통해 억제를 유도 하는 granzymes의 분 비를 통해 cytolysis를 포함 하 여 메커니즘의 다양 한 통해 진압 능력을 발휘 하 여 면역 관용에 중심 역할을 담당 T-림프 구 항 45. 또한, 그들은 변형 성장 인자 베타 (TGF-β), 인터 루 킨-10 (IL-10) 및 IL-355등 억제 cytokines를 분 비 수 있습니다. Treg 세포 자연스럽 게 파생 될 수 있다, thymus에서 thymic 파생된 Treg (tTreg) 셀, 지정 되어 어떤 경우에 또는 케이스 주변 유도 Treg (pTreg) 셀 이라고 그 주변 기관에서 유도 될 수 있다.
헬 리오스, Ikaros 녹음 방송 요인 가족의 일원이 tTreg 세포 사이 구별을 위한 마커 이기 위하여 보고 되었다 그리고 pTreg 세포6. 나중에, 다른 두 그룹 Neuropilin 1 (Nrp1), semaphorin III 수용 체 특정 조건7,8에서 tTreg 세포에 대 한 표면 표식으로 될 수 있는 보고. 그럼에도 불구 하 고, 싱 외. 헬 리오스는 순진한 마우스9에서 이런이 맥락에서 더 나은 표식으로 나타났습니다.
Treg 세포의 하위 집합 및 면역 및 감염에 대 한 보호 면역 체계의 항상성 유지에 중추적인 역할. 따라서, 그것은 숫자와 림프 및 비 림프 조직에 이러한 인구의 비율을 결정 하는 것이 중요입니다. 이를 위해, 하나의 단일 셀이이 기관에서 정지를 준비 하고있다. 여러 프로토콜 설명 또는 이전 연구에서 사용 된 있다. 주로, 자동 dissociators 이전 게시 된 보고서10,11에 사용 되었습니다. 자동 dissociators를 사용 하는 편리 하 고 시간 절약, 하지만 그것은 비싼 절차. 따라서, normoglycemic 비 뚱뚱한 당뇨병 (끄 덕) 쥐, 및이 기관에서 격리 된 단일 셀에서 murine thymic 땀 샘, 췌 장 배출 림프 노드 (PDLNs) 및 spleens 단일 셀 정지를 준비 하는 수동 방법을 사용 했습니다. 이 방법은 우리의 이전 연구에서 사용 되었습니다 그리고 우리는 단일 세포 현 탁 액을 준비 하기 위한 수동 방법 자동 dissociator 방법9,12,,1314만큼 효율적 이다 발견. 또한, 우리는 CD4의 비율을 확인 하려면 cytometry 사용+CD8-CD25+Foxp3+ Treg 세포와 Treg 하위 집합 tTreg 및 pTreg 세포 세포. TTreg 및 pTreg 세포 tTreg 세포에 대 한 표식으로 헬 리오스와 Nrp1를 사용 하 여 구분 했다. 따라서, 우리의 결과 단일 셀을 준비 하기 위한 수동 방법 효율적으로 작동 하 고 준비 된 단일 셀 정지 추가 연구 cytometry 사용 하 여 사용 될 수 있습니다 나타냅니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>NOD mice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>In-house breading</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Statens veterin&#228;rmedicinska anstalt</td>
			<td>991750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R0883-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4Cl</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>1011450500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>00-5523-00</td>
			<td>Contains Fixation/Permeabilization Concentrate , Fixation/Permeabilization Diluent and Permeabilization Buffer (10X)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eBioscience Flow Cytometry Staining Buffer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>00-4222-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4 Monoclonal Antibody (RM4-5), FITC, eBioscience</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11-0042-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD25 Monoclonal Antibody (PC61.5), PE, eBioscience</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12-0251-83</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Pharmingen&#160;APC-H7 Rat anti-Mouse CD8a</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Neuropilin-1 APC-conjugated Antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>FAB5994A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FOXP3 Monoclonal Antibody (FJK-16s), PE-Cyanine7, eBioscience</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>25-5773-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pacific Blue anti-mouse/human Helios Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>137220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>352235</td>
			<td>A 35 &#181;m nylon mesh is incorporated into the dual-position snap cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube 15ml, 120x17mm, PP</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro tube 1.5ml</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.690.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>disposable scintillation vials</td>
			<td>WHEATON</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometry</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometry analysis software</td>
			<td>Inivai Technologies</td>
			<td>Flowlogic</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determination of regulatory t cell subsets in murine thymus, pancreatic draining lymph node and spleen using flow cytometry

규제 T 세포 (Treg) 세포 등 면역 세포의 다양 한 숫자와 우리의 면역 체계에 의하여 이루어져 있다. Treg 세포는 두 개의 하위 집합, thymic 파생된 Treg (tTreg) 세포와 주변 유도 Treg (pTreg) 셀으로 나눌 수 있습니다. 그들은 우리의 신체의 다른 장기에 존재 하 고 헬 리오스 Neuropilin 1 등 특정 마커에 의해 구별 될 수 있다. TTreg 세포는 pTreg 셀 보다 기능적으로 더 진압으로 보고 되었습니다. 따라서, 그것은 다른 유형의 세포 인구를 조사할 때 tTreg와 pTreg 세포의 비율을 결정 하는 것이 중요입니다. 여기, 우리 수집 thymic 땀 샘, 췌 장 배출 림프절과 spleens cytometry를 사용 하 여 pTreg 세포에서 tTreg 셀을 구별 normoglycemic 비 뚱뚱한 당뇨병 쥐에서. 우리는 수동으로 단일 셀 정지가이 기관에서 준비. 형광 색소 활용 된 표면 CD4, CD8, CD25, 그리고 Neuropilin 1 항 체는 세포 얼룩 사용 되었다. 그들은 하룻밤 냉장고에 보관 했다. 다음 날, 세포 형광 색소 활용 된 세포내 Foxp3와 헬 리오스 항 체와 얼룩이 있었다. 이러한 마커는 Treg 세포의 두 하위 집합 하 사용 되었다. 이 프로토콜에서는 murine thymus, 림프절, 비장을 배출 췌 장에서 단일 셀을 준비 하 고 이후의 흐름 cytometric 분석을 위해 그들을 사용 하는 간단 하지만 실용적인 방법을 보여 줍니다.

Nrp1 및 tTreg 및 pTreg 세포에 헬 리오스의 식을 조사, 우리 thymic 동맥, PDLNs 및 normoglycemic 끄 덕 임 쥐의 spleens에서에서 단일 셀을 준비 하 고 흐름 cytometric 위한 Treg 세포 마커 CD4, CD25, Foxp3, 헬 리오스와 Nrp1으로 그들을 물 분석입니다. 결과 전략 (그림 1) 게이팅 담당자와 같이 분석 되었다. 우리는 CD4 중 헬 리오스+ 세포의 비율을 발견+CD8<su...

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Determination of Regulatory T Cell Subsets in Murine Thymus, Pancreatic Draining Lymph Node and Spleen Using Flow Cytometry

Murine Thymus, 림프절, 비장 Cytometry 사용 하 여 배출 췌 장 하위 집합 규제 T 세포의 결정

여기, 선물이 murine thymus, 림프절, 비장 추가 연구를 cytometry를 사용 하 여 이러한 셀을 배출 췌 장에서 단일 셀을 준비 하는 프로토콜. 또한,이 프로토콜 cytometry 사용 규제 T 세포의 하위 집합을 결정 하는 데 사용 되었다.

Our immune system consists of a number and variety of immune cells including regulatory T cells (Treg) cells. Treg cells can be divided into two subsets, ...

이 프로토콜은 건강과 병리학에서 특정 기관에서 면역 세포의 역할을 조사하는 데 도움이됩니다. 이 기술의 주요 장점은 수동 기술이기 때문에 비용 효율적인 기술이라는 것입니다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 박사 과정 학생 인 정강 루오 (Zhengkang Luo)가 될 것입니다.우선, 이전에 안락사된 마우스의 흉선과 비장을 20ml 의 신자극 성 자경단 또는 15ml 원추형 튜브에 넣고 행크의 균형 잡힌 소금 용액 5ml로 채워집니다. 췌장 배수 림프절을 RPMI-1640 1 ml로 채워진 1.5 ml 마이크로 튜브에 넣습니다. 전체 흉선과 비장, 그리고 모든 PDLN을 사용해야합니다.전체 절차 전반에 걸쳐 얼음에 장기를 유지합니다. 한 쌍의 가위를 사용하여 흉선과 비장을 철저히 짜서 면역 세포를 방출하십시오. 남은 흉부와 비장 캡슐을 버리십시오.셀 서스펜션을 15ml 원물 튜브로 옮기. 원심분리기는 433배, 섭씨 4도에서 5분간, 상수부를 폐기합니다. 적혈구를 분해하기 위해, 0.2 몰라 암모늄 염화의 5 ml에서 세포 현탁액을 다시 중단하고 10 분 동안 실온에서 배양하십시오.2분마다 튜브를 부드럽게 반전시면 됩니다. 인큐베이션이 끝나면 HBSS 5 ml를 추가하여 리시스를 중지합니다. 원심 분리는 433 배 g와 섭씨 4도에서 5 분 동안 튜브를 원심 분리합니다.상체를 버리고 약 5 ml의 HBSS에서 세포를 다시 중단하십시오. 그런 다음 튜브를 HBSS로 채웁니다. 샘플을 원심분리하는 것에서부터 튜브를 HBSS로 채우는 것까지, 한 번 반복하십시오.원심 분리튜브는 다시 한 번 433g, 섭씨 4도에서 5분간 튜브를 분리합니다. 상체를 버리고 HBSS에서 펠릿을 다시 중단합니다. 셀 스트레이너 캡으로 5ml 의 라운드 하단 튜브를 가져옵니다.세포 스트레이너 캡에 현탁액을 적용하여 비장 세포 현탁액의 1 ml와 비장 세포 현탁액 500 마이크로리터를 튜브로 옮기다. 먼저 15ml의 원상 관을 랙에 넣습니다. 멸균 250 마이크로미터 금속 메쉬를 튜브 위에 놓습니다.RPMI 1 ml로 메시를 헹도 헹도 됩니다. 그런 다음 림프절을 금속 메시로 옮기고 핀셋 쌍을 사용하여 메시를 통해 갈아. 메쉬에 RPMI 1 ml를 적용하여 세포를 튜브로 플러시합니다.각 샘플에 대해 림프절을 세 번 옮기고 연삭하는 과정을 반복한 다음 메시를 제거합니다. 원심 분리는 433 배 g와 섭씨 4도에서 5 분 동안 튜브를 원심 분리합니다. 상체를 버리고 약 5 ml의 RPMI에서 세포를 다시 중단하십시오.그런 다음, RPMI로 튜브를 채웁니다. 샘플을 원심분리하는 것에서부터 튜브를 RPMI로 채우는 것까지, 한 번 반복하십시오. 원심 분리는 튜브를 다시 433 배 g에서 5 분 동안 섭씨 4도에서 다시 분리합니다.상체를 버리고 RPMI 2 ml의 세포 펠릿을 다시 중단하십시오. 셀 서스펜션 2ml를 셀 스트레이너 캡으로 5ml 의 라운드 하단 튜브로 옮기습니다. 첫째, 흉선, 비장 및 PDLN 샘플에서 세포 현탁액을 433배, 섭씨 4도에서 5분간 원심분리합니다.상부체를 폐기합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 표면 항체로 세포를 염색하고, 40 분 동안 얼음에 관을 배양합니다. 다음으로 각 튜브에 200마이크로리터의 FACS 버퍼를 추가합니다.원심분리기는 433배, 섭씨 4도에서 5분간 폐기하고, 상부체를 폐기한다. 이 프로세스를 반복하여 버퍼를 추가하고 원심분리하고 상퍼를 한 번 폐기합니다. 세포를 고치고 침투하기 위해 투과화 고정 버퍼의 500 마이크로 리터에서 세포 펠릿을 다시 일시 중단합니다.하룻밤 사이에 4도의 냉장고에 튜브를 옮기. 다음 날, 원심 분리튜브는 433g, 섭씨 4도에서 5분간 튜브를 분리합니다. 상체를 버리고, 충혈 세척 버퍼의 500 마이크로 리터에서 세포 펠릿을 다시 중단합니다.세포를 다시 433배, 섭씨 4도에서 5분간 원심분리하고 상퍼를 폐기합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 세포 내 항체를 가진 세포를 얼룩지게 합니다. 1 시간 동안 얼음에 튜브를 배양.그 후 각 튜브에 500마이크로리터의 충류 세척 버퍼를 추가합니다. 원심분리기는 433배, 섭씨 4도에서 5분간. 상체를 버리고, 침투 세척 버퍼의 500 마이크로 리터에서 펠릿을 다시 중단합니다.원심분리기는 다시 한 번 433배, 섭씨 4도에서 5분간. 상체를 버리고 FACS 버퍼의 300 마이크로 리터에서 세포 펠릿을 다시 중단하십시오. 그런 다음 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 흐름 사이토미터에서 셀을 분석합니다.이 연구에서, 단일 세포는 정상 혈당 NOD 마우스의 흉선, PDLNs 및 비장으로부터 분리되고, 흐름 세포 측정 분석을 위해 Treg 세포 마커, CD4, CD25, Foxp3, 헬리오스 및 신경 필린-1로 염색된다. 결과는 분석되며 여기에 대표적인 게이팅 전략으로 표시됩니다. CD4 양성, CD8-음수, CD25 양성, Foxp3 양성 Treg 세포 중 헬리오스 양성 세포의 비율은 세 가지 장기 모두에 있는 Nrp1 양성 세포의 세포보다 높은 것으로 보입니다.흉합에 있는 Treg 세포의 80% 이상은 PDLN및 비장보다는 더 높은 헬리오스를 표현하기 위하여 보입니다. 헬리오스 양성 Treg 세포 중 NrP1 양성 세포의 비율은 흉선 또는 비장의 세포보다 PDLN에서 더 높은 것으로 보입니다. Nrp1 양성 Treg 세포의 대다수는 또한 헬리오스를 표현하고, Nrp1 양성 Treg 세포 중 헬리오스 양성 세포의 비율은 PDLN에서 보다는 흉선 및 비장에서 더 높은 것으로 보입니다.함께, 이러한 결과는 헬리오스가 Nrp1보다 Treg 세포를 검출하는 더 나은 마커임을 나타냅니다. 림프절은 작지만 일부 세포 내 마커는 유동 세포 측정에 좋은 신호를 주기 위해 많은 수의 세포가 필요합니다. 세포가 이미 염색되고 죽었기 때문에 다른 방법은 이 절차 후에 수행될 수 없습니다.그러나 동물의 4개의 세포 마커는 면역 세포의 그밖 모형을 공부하기 위하여 대체될 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Non-surgical Intratracheal Instillation of Mice with Analysis of Lungs and Lung Draining Lymph Nodes by Flow Cytometry

유동세포계측법에 의해 폐, 폐 배수 림프절의 분석과 마우스의 비 수술 Intratracheal 떨어뜨림

Phagocytic cells such as alveolar macrophages and lung dendritic cells (LDCs) continuously sample antigens from the alveolar spaces in the 
lungs. LDCs, ...

연구

면역학 및 감염병학

Ex vivo Imaging of T Cells in Murine Lymph Node Slices with Widefield and Confocal Microscopes

Ex vivo Imaging of T Cells in Murine Lymph Node Slices with Widefield and Confocal Microscopes

위드 필드와 공촛점 현미경과 Murine 림프절의 조각에서 T 세포의 생체내 이미징 전

Na&iuml;ve T cells continuously traffic to secondary lymphoid organs, including peripheral lymph nodes, to detect rare expressed antigens. The migration ...

Murine Superficial Lymph Node Surgery

Murine 외면적인 림프절 외과

In the field of immunology, to understand the progression of an immune response against a vaccine, an infection or a tumour, the response is often ...

Intravital Imaging of the Mouse Popliteal Lymph Node

마우스 오금 림프절의 Intravital 이미징

Lymph nodes (LNs) are secondary lymphoid organs, which are strategically located throughout the body to allow for trapping and presentation of foreign ...

Generation of Lymph Node-fat Pad Chimeras for the Study of Lymph Node Stromal Cell Origin

The stroma is a key component of the lymph node structure and function. However, little is known about its origin, exact cellular composition and the ...

Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells

쥐과 림프절 기질 세포의 분리

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and ...

Intracellular Staining and Flow Cytometry to Identify Lymphocyte Subsets within Murine Aorta, Kidney and Lymph Nodes in a Model of Hypertension

세포 내 염색 및 유동 세포 계측법은 고혈압의 모델에 쥐 대동맥, 신장 및 림프절에서 림프구 하위 집합을 식별하는

It is now well known that T lymphocytes play a critical role in the development of several cardiovascular diseases1,2,3,4,5. For example, studies from our ...

Measurement of T Cell Alloreactivity Using Imaging Flow Cytometry

이미징 유동 세포 계측법을 사용하여 T 세포 Alloreactivity의 측정

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

고립과 Murine 인간과 치경 대 식 세포의 생체 외에서 문화

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Characterization of Thymus-dependent and Thymus-independent Immunoglobulin Isotype Responses in Mice Using Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Thymus 종속 및 독립 Thymus 면역 글로불린 Isotype 반응 효소 연결 된 Immunosorbent 분석 결과 사용 하 여 마우스의 특성

Antibodies, also termed as immunoglobulins (Ig), secreted by differentiated B lymphocytes, plasmablasts/plasma cells, in humoral immunity provide a ...