Name: preparation of rhythmically-active in vitro neonatal rodent brainstem-spinal cord and thin slice
Uploaded: 2019-03-23T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Rhythmically-active In Vitro Neonatal Rodent Brainstem-spinal Cord and Thin Slice at JoVE.com

S.B.P er en modtager af en Loma Linda University sommer Undergraduate Research Fellowship.

Følgende protokol er blevet accepteret og godkendt af institutionelle Animal Care og brug udvalg (IACUC) i Loma Linda University. NIH retningslinjer for den etiske behandling af dyr, der er fulgt i alle dyreforsøg udføres i laboratoriet. Alle etiske standarder blev stadfæstet af personer udfører denne protokol.
1. løsninger
<ol><li>
Forberede kunstige cerebral-spinalvæske (aCSF).
	<ol>
<li>Forberede friske aCSF om aftenen før et eksperiment i 1 L partier ved hjælp a...

<ol>
	<li>Hilaire, G., Duron, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+of+the+Mammalian+Respiratory+System.">Maturation of the Mammalian Respiratory System.</a> Physiological Reviews. 79, 325-360 (1999).</li><li>Pinkerton, K. E., Joad, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mammalian+Respiratory+System+and+Critical+Windows+of+Exposure+for+Children's+Health.">The Mammalian Respiratory System and Critical Windows of Exposure for Children's Health.</a> Environmental Health Perspectives. 108, 6 (2000).</li><li>Smith, J. C., Ellenberger, H. H., Ballanyi, K., Richter, D. W., Feldman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-B&#246;tzinger+complex:+a+brainstem+region+that+may+generate+respiratory+rhythm+in+mammals.">Pre-B&#246;tzinger complex: a brainstem region that may generate respiratory rhythm in mammals.</a> Science. 254, 726-729 (1991).</li><li>Smith, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+rhythm+generation+in+neonatal+and+adult+mammals:+the+hybrid+pacemaker-network+model.">Respiratory rhythm generation in neonatal and adult mammals: the hybrid pacemaker-network model.</a> Respiration Physiology. 122, 131-147 (2000).</li><li>Ramirez, J. M., Schwarzacher, S. W., Pierrefiche, O., Olivera, B. M., Richter, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+lesioning+of+the+cat+pre-B&#246;tzinger+complex+in+vivo+eliminates+breathing+but+not+gasping.">Selective lesioning of the cat pre-B&#246;tzinger complex in vivo eliminates breathing but not gasping.</a> The Journal of Physiology. 507, 895-907 (2004).</li><li>Butera, R. J., Rinzel, J., Smith, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+of+Respiratory+Rhythm+Generation+in+the+pre-B&#246;tzinger+Complex:+II.+Populations+of+Coupled+Pacemaker+Neurons.">Models of Respiratory Rhythm Generation in the pre-B&#246;tzinger Complex: II. Populations of Coupled Pacemaker Neurons.</a> Journal of Neurophysiology. 82, 398-415 (1999).</li><li>Suzue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+rhythm+generation+in+the+in+vitro+brain+stem-spinal+cord+preparation+of+the+neonatal+rat.">Respiratory rhythm generation in the in vitro brain stem-spinal cord preparation of the neonatal rat.</a> Journal of Physiology (London). 354, 173-183 (1984).</li><li>Feldman, J. L., Del Negro, C. A., Gray, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+rhythm+of+breathing:+so+near,+yet+so+far.">Understanding the rhythm of breathing: so near, yet so far.</a> Annual Review of Physiology. 75, 423-452 (2013).</li><li>Rekling, J. C., Shao, X. M., Feldman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+Coupling+and+Excitatory+Synaptic+Transmission+between+Rhythmogenic+Respiratory+Neurons+in+the+PreB&#246;tzinger+Complex.">Electrical Coupling and Excitatory Synaptic Transmission between Rhythmogenic Respiratory Neurons in the PreB&#246;tzinger Complex.</a> Journal of Neuroscience. 20, 113 (2000).</li><li>Rousseau, J. -. P., Caravagna, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiology+on+Isolated+Brainstem-spinal+Cord+Preparations+from+Newborn+Rodents+Allows+Neural+Respiratory+Network+Output+Recording.">Electrophysiology on Isolated Brainstem-spinal Cord Preparations from Newborn Rodents Allows Neural Respiratory Network Output Recording.</a> Journal of Visualized Experiments. , e53071 (2015).</li><li>Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-cell+Patch-clamp+Recordings+in+Brain+Slices.">Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices.</a> Journal of Visualized Experiments. (112), e54024 (2016).</li><li>Koizumi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Imaging,+Spatial+Reconstruction,+and+Biophysical+Analysis+of+a+Respiratory+Motor+Circuit+Isolated+In+Vitro.">Functional Imaging, Spatial Reconstruction, and Biophysical Analysis of a Respiratory Motor Circuit Isolated In Vitro.</a> Journal of Neuroscience. 28, 2353-2365 (2008).</li><li>Danneman, P., Mandrell, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+five+agents/methods+for+anesthesia+of+neonatal+rats.">Evaluation of five agents/methods for anesthesia of neonatal rats.</a> Laboratory Animal Science. 47, 386-395 (1997).</li><li>Umezawa, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orexin-B+antagonized+respiratory+depression+induced+by+sevoflurane,+propofol,+and+remifentanil+in+isolated+brainstem-spinal+cords+of+neonatal+rats.">Orexin-B antagonized respiratory depression induced by sevoflurane, propofol, and remifentanil in isolated brainstem-spinal cords of neonatal rats.</a> Respiratory Physiology &amp; Neurobiology. 205, 61-65 (2015).</li><li>Bierman, A. M., Tankersley, C. G., Wilson, C. G., Chavez-Valdez, R., Gauda, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perinatal+hyperoxic+exposure+reconfigures+the+central+respiratory+network+contributing+to+intolerance+to+anoxia+in+newborn+rat+pups.">Perinatal hyperoxic exposure reconfigures the central respiratory network contributing to intolerance to anoxia in newborn rat pups.</a> Journal of Applied Physiology. 116, 47-53 (2014).</li><li>Formenti, A., Zocchi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Error+signals+as+powerful+stimuli+for+the+operant+conditioning-like+process+of+the+fictive+respiratory+output+in+a+brainstem-spinal+cord+preparation+from+rats.">Error signals as powerful stimuli for the operant conditioning-like process of the fictive respiratory output in a brainstem-spinal cord preparation from rats.</a> Behavioural Brain Research. 272, 8-15 (2014).</li><li>Negro, C. A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sodium+and+Calcium+Current-Mediated+Pacemaker+Neurons+and+Respiratory+Rhythm+Generation.">Sodium and Calcium Current-Mediated Pacemaker Neurons and Respiratory Rhythm Generation.</a> Journal of Neuroscience. 25, 446-453 (2005).</li><li>Johnson, S. M., Koshiya, N., Smith, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+the+Kernel+for+Respiratory+Rhythm+Generation+in+a+Novel+Preparation:+The+Pre-B&#246;tzinger+Complex+"Island".">Isolation of the Kernel for Respiratory Rhythm Generation in a Novel Preparation: The Pre-B&#246;tzinger Complex "Island".</a> Journal of Neurophysiology. 85, 1772-1776 (2001).</li><li>Funk, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+respiratory+rhythm+generating+networks+in+neonatal+mice+lacking+NMDAR1+gene.">Functional respiratory rhythm generating networks in neonatal mice lacking NMDAR1 gene.</a> Journal of Neurophysiology. 78, 1414-1420 (1997).</li><li>Campos, M., Bravo, E., Eugen&#237;n, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+dysfunctions+induced+by+prenatal+nicotine+exposure.">Respiratory dysfunctions induced by prenatal nicotine exposure.</a> Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 36, 1205-1217 (2009).</li><li>Ballanyi, K., Volker, A., Richter, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anoxia+induced+functional+inactivation+of+neonatal+respiratory+neurones+in+vitro.">Anoxia induced functional inactivation of neonatal respiratory neurones in vitro.</a> NeuroReport. 6, 165-168 (1994).</li><li>Ruangkittisakul, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+Sensitivity+to+Neuromodulator-Activated+Signaling+Pathways+at+Physiological+[K+]+of+Confocally+Imaged+Respiratory+Center+Neurons+in+On-Line-Calibrated+Newborn+Rat+Brainstem+Slices.">High Sensitivity to Neuromodulator-Activated Signaling Pathways at Physiological [K+] of Confocally Imaged Respiratory Center Neurons in On-Line-Calibrated Newborn Rat Brainstem Slices.</a> Journal of Neuroscience. 26, 11870-11880 (2006).</li><li>Rybak, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+the+ponto-medullary+respiratory+network.">Modeling the ponto-medullary respiratory network.</a> Respiratory Physiology &amp; Neurobiology. 143, 307-319 (2004).</li><li>Ruangkittisakul, A., Kottick, A., Picardo, M. C. D., Ballanyi, K., Del Negro, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+pre-B&#246;tzinger+complex+inspiratory+center+in+calibrated+'sandwich'+slices+from+newborn+mice+with+fluorescent+Dbx1+interneurons.">Identification of the pre-B&#246;tzinger complex inspiratory center in calibrated 'sandwich' slices from newborn mice with fluorescent Dbx1 interneurons.</a> Physiological Reports. 2, (2014).</li><li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , (1997).</li><li>Franklin, K. B. J., Paxinos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2008).</li></ol>

Tilpasning af protokollen præsenteres her i en en bloc eller skive arbejdsgang er fordelagtige for laboratorier og undersøgelser, der gerne vil udnytte enten blokoverførslen hjernestammen-rygmarven og/eller tynd skive forberedelserne til Elektrofysiologi optagelser. Metoden dissektion og skive præsenteret, kombineret med metoder tidligere rapporteret af andre17,18,19, vil tillade reproducerbare forberedelse af robust og hold...

Den respiratoriske neurale netværk af hjernestammen giver en frugtbar domæne for at forstå de generelle Karakteristik af rytmiske neurale netværk. Især er af interesse i udviklingen af neonatal gnaver vejrtrækning og forstå, hvordan vejrtrækning rytme udvikler. Dette kan være sker ved hjælp af en multi-niveau fremgangsmåde, herunder blokoverførslen nerve optagelser, vivo hele dyr plethysmography, in vitro- og in vitro-skive optagelser, der indeholder vejrtrækning rytme generator. Reduktionistiske i vitro en bloc og skive optagelser er en fordelagtig metode at bruge når spørgekriterierne mekanismerne bag respiratoriske rhythmogenesis og neurale kredsløb i hjernestammen-rygmarven regionen udvikle gnavere. Udvikle åndedrætssystemet indeholder ca 40 celletyper, karakteriseret ved at affyre mønster, herunder de centrale luftveje1,2. De centrale luftveje netværk omfatter en gruppe af rytmisk aktive neuroner beliggende i rostralt ventrolaterale medulla1,3. Pattedyr respiratorisk rhythmogenesis er genereret fra en autorhythmic interneuron netværk døbt preBötzinger complex (pBC), som er blevet lokaliseret eksperimentelt via både skive og en bloc præparater af neonatal pattedyr hjernestammen-spinal snore3,4,5,6,7,8. Denne region serverer en lignende funktion til noden sinoatrialt (SA) i hjertet og genererer en inspiratory timing system at drive respiration. Fra pBC udføres den inspiratory rytme til andre regioner i hjernestammen (herunder hypoglossal motoren kernen) og spinal motor pools (såsom de phrenic motoriske neuroner, der drive mellemgulvet)9.
Rytmisk aktivitet kan opnås ved hjælp af hjernestammen rygmarven en bloc præparater eller skiver fra en række forskellige cellepopulationer, herunder C3-C5 nerve finrødder, XII nerve finrødder, hypoglossal motoriske kerne (XII MN), hypoglossal premotor neuroner (XII pMN), og pBC3,10,11,12. Mens disse metoder til dataindsamling har haft succes på tværs af en håndfuld af laboratorier, er mange af protokollerne ikke præsenteret på en måde, der er fuldt reproducerbare for nye forskere ind i feltet. At få levedygtigt og rytmisk aktive en blok og skive præparater kræver en akut opmærksomhed for detaljer gennem alle trin i dissektion og skive skæring protokol. Tidligere protokoller udførligt beskrive de forskellige optagelse procedurer og Elektrofysiologi, men mangler detaljer i den mest kritiske del for at opnå en levedygtig væv forberedelse: udfører hjernestammen rygmarven dissektion og skive procedure.
Effektivt at opnå en rytmisk-aktiv og levedygtig en blok eller skive forberedelse hjernestammen rygmarven Elektrofysiologi optagelser kræver, at alle trin udføres korrekt, omhyggeligt og hurtigt (typisk, hele proceduren relateret her kan være udført i ca 30 min). Kritiske punkter i hjernestammen-rygmarven Elektrofysiologi protokol der ikke har været tidligere godt beskrevet omfatter dissektion af nerve finrødder og udskæring proceduren på vibratome. Denne protokol er først til trinvis visuelt kommunikere hjernestammen rygmarven dissektion for både nye forskere og eksperter på området. Denne protokol forklarer også grundigt kirurgiske teknikker, landemærker og andre procedurer at hjælpe fremtidige forskere med at standardisere skiver og blokoverførslen forberedelser til at indeholde den nøjagtige kredsløb ønskes i hvert forsøg. De procedurer, der er præsenteret her kan bruges i både rotten og musen neonatal unger.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1159px;" width="1158">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">NaCl</td>
			<td style="width:288px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:320px;">S271-500</td>
			<td style="width:192px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P5405-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaHCO3</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP328-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaH2PO4 &#8226;H2O</td>
			<td>Sigma Aldrch</td>
			<td>S9638-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CaCl2&#8226;2H2O</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C7902-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MgSO4&#8226;7H2O</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M7774-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D-Glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G8270-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cold-Light source Halogen lamp 150W</td>
			<td>AmScope</td>
			<td>H2L50-AY</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dissection Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vibratome 1000 Plus</td>
			<td>Vibratome</td>
			<td>W3 69-0353</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnetic Base</td>
			<td>Kanetic</td>
			<td>MB-B-DG6C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isoflurane, USP</td>
			<td>Patterson Veterinary</td>
			<td>NDC 14043-704-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sword Classic Double Edge Blades</td>
			<td>Wilkinson</td>
			<td>97573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Histoclear</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H2779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dumont #5 Fine Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dumont #5/45 Forcep</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Scalpel Blades #10</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10010-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Scalpel Handel #3</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10003-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Spring Scissors Straight&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15024-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Narrow Pattern Forcep Serrated/straight</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11002-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Castroviejo Micro Dissecting Spring Scissors; Straight</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vannas Scissors 3&#34; Curved</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Insect pins, 0</td>
			<td>Fine Science Tools/8840604</td>
			<td>26000-35&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Insect pins, 0, SS</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26001-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Insect pins, 00</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26000-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Insect pins, 00, SS</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26001-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Insect pins, 000</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26000-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Insect pins, 000, SS</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26001-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Minutien pins, 0.10 mm</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26002-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Minutien pins, 0.15 mm</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26002-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Minutien pins, 0.2 mm</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26002-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fisher Tissue prep Parafin&#160;</td>
			<td>fisher</td>
			<td>T56-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Graphite&#160;</td>
			<td>fisher&#160;</td>
			<td>G67-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Delrin Plastic&#160;</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>3HMT2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">18 Gauge Hypodermic Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305195</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of rhythmically-active in vitro neonatal rodent brainstem-spinal cord and thin slice

Pattedyr inspiratory rytme er genereret fra en neuronal netværk i et område af medulla kaldt preBötzinger komplekse (pBC), som producerer et signal kørsel den rytmiske sammentrækning af inspiratory muskler. Rytmisk neurale aktivitet genereret i pBC og transporteres til andre neuronal puljer til drev muskulatur af vejrtrækning kan studeres ved hjælp af forskellige metoder, herunder blokoverførslen nerve optagelser og tværgående skive optagelser. Imidlertid har tidligere udgivne metoder ikke udførligt beskrevet hjernestammen rygmarven dissektion proces i en gennemsigtig og reproducerbar måde for fremtidige undersøgelser. Her præsenterer vi et samlet overblik over en metode til reproducerbar skåret rytmisk-aktive hjernestammen skiver indeholdende de nødvendige og tilstrækkelige neuronal kredsløb til at skabe og overføre inspiratory drev. Dette arbejde bygger på tidligere hjernestammen rygmarven Elektrofysiologi protokoller til at øge sandsynligheden for at pålideligt opnå rentable og rytmisk-aktive skiver til optagelse af neuronal output fra pBC, hypoglossal premotor neuroner (XII pMN), og hypoglossal motor neuroner (XII MN). Arbejde præsenteret udvider på tidligere offentliggjorte metoder ved at give detaljerede, trin for trin illustrationer af dissektion, fra hele rotte pup, at in vitro-skive indeholdende XII finrødder.

Metoden præsenteres her tillader en forsker interesseret i at opnå rytmisk aktive skiver af hjernestammen til reproducerbar og pålideligt skære en levedygtig, robust skive, der giver mulighed for optagelse af fiktive motor output i mange timer. Alle de minimalt nødvendige neurale kredsløbselementer til at skabe og videregive inspiratory rytme kan blive fanget i en tynd skive ved hjælp af denne metode. Disse elementer omfatter: preBötzinger kompleks, premotor neuroner projektering ...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Rhythmically-active In Vitro Neonatal Rodent Brainstem-spinal Cord and Thin Slice at JoVE.com

Preparation of Rhythmically-active In Vitro Neonatal Rodent Brainstem-spinal Cord and Thin Slice

Denne protokol både visuelt kommunikerer hjernestammen rygmarven forberedelse og præciserer forberedelse af hjernestammen tværgående skiver på en omfattende måde, trin for trin. Det var designet til at øge reproducerbarhed og øge sandsynligheden for at få levedygtigt, langtidsholdbare, rytmisk-aktive skiver til optagelse af neurale output fra regionerne respiratorisk af hjernestammen.

Forberedelse af rytmisk-aktiv i Vitro Neonatal gnaver hjernestammen-rygmarven og tynd skive

Mammalian inspiratory rhythm is generated from a neuronal network in a region of the medulla called the preB&#246;tzinger complex (pBC), which produces a ...

Denne metode letter reproducerbar dissektion og udskæring af gnaver hjernestammer til den tilfangetagne analyse af Mirian Medullry Respiratory Network. Denne teknik giver stor eksperimentel fleksibilitet, hvilket gør det muligt at forberede enten en in vitro unblock eller en skive forberedelse til optagelse. Denne metode kan anvendes til elektrofysiologi eksperimenter til at udforske neurale kontrol kredsløb, der genererer vejrtrækning rytmer og til at forstå patologi og disregulering af vejrtrækning i genetisk modificerede gnavere.Efter dissektion af neuraxis, hurtigt overføre den isolerede stammen af dyret til en tilstænnet dissektion kammer under en dissektion mikroskop og placere væv dorsal-side op, med rostral ende vender forsiden af kammeret. Pin vævet på skuldrene og den mest caudal ende af rygmarven og gøre en midsagittal snit gennem kraniet efter parietal sutur for at undgå at beskadige cortex og hjernestammen underliggende kraniet. Begyndende ved sagittal sutur og arbejder sidelæns, klip occipital suturer af kraniet for at skabe flapper af ben, der kan reflekteres og fastgjort til at forankre og stabilisere rostral del af kraniet.Efter at have reflekteret begge kranieklapper, punktafgifter resten af hjernebarken, forlader caudal del af lillehjernen relativt intakt til at udføre en dorsal laminectomy. Brug mikro foråret saks og kraftforkængelige at fjerne muskulatur omkring kraniet og rygsøjlen. Fjern vævet langs rygsiden af brystkassen, forlader ribbenene intakt og omhyggeligt klip væk de laterale processer af vertebrale lamina.Efter at skære væk væv overliggende pons og medulla, vermis, cerebellum, pons og begyndelsen af rygmarven, vil være klart synlige. For at udføre en ventral laminectomy, placere væv dorsal-side ned og pin på brystkassen og den mest caudal ende af rygsøjlen. Brug kraniet flapper til at pin ned rostral-side af vævet og fjerne ventrale halvdel af brystbenet, herunder brystbenet og alle de abdominale organer.Disseker væk det bløde væv knyttet til brystkassen til at udsætte ribben og rygmarv og fjerne tungen, spiserøret, luftrøret, strubehoved og alle de andre bløde væv og muskulatur overliggende bunden af kraniet og rygsøjlen. For at identificere den hårde palle, dissekere vævet overliggende denne rektangulære plade af knogle i bunden af kraniet, der omfatter en v-form indrykning. Derefter skæres langs pallens midterlinje, løft forsigtigt vævet opad og udfør et tværgående snit for at fjerne det.For at begynde en ventral laminectomy, fjerne lamina, udsætter den ventrale overflade af hjernestammen og rygmarven fra den første halshvirvel til ca brysthvirvel syv og klip fem til 10 millimeter langs begge sider af rygsøjlen på lamina. Når rygmarven er blevet udsat, klip rootlets ca 20 til 25 millimeter bilateralt, langs rygsøjlen til ca T7 og forsigtigt løfte rostralkanten af C1, C2 og C3 med hooked eller bøjet snævler til at tillade klipning under knoglen til fjernelse af de tre ryghvirvler. Når den ønskede længde af rygmarven er blevet isoleret fra rygsøjlen, lave en tværgående snit til at fjerne rygmarvsvæv.Efter fjernelse af dura, placere hjernestammen i midten af paraffin platform på plast skære blok og bruge fine insekt stifter, trimmet til ikke mere end en centimeter i længden for at pin den hale ende af hjernestammen gennem den distale rygmarv. Juster derefter paraffindækket skæreblok med den fastgjorte hjernestamme i Vibratone blokholderen, så klingen skærer vinkelret på hjernestammens rostrale ansigt. Dernæst foretages en indledende skive for at fjerne 200 til 300 mikrometer ujævnt uvedkommende væv på den rostrale ende af vævet, hvilket gør små justeringer efter behov for at sikre PARP linearitet og små snit for at fjerne ujævnt væv.Den ordliste rodfræser vil blive synlige på den laterale kant af hjernestammen, skære en 300 til 500 mikrometer skive hjernestamme fra disse rostral neuroanatomiske markører til at fange pre-Botzinger kompleks og den tilhørende transmission kredsløb. Alle udskæring procedure trin er afgørende for at skabe en reproducerbar, levedygtig skive, med alle de nødvendige neuronal kredsløb i den korrekte orientering til at producere robust rytme. Alle de minimalt nødvendige neurale kredsløb elementer til at generere og overføre inspiratoriske rytme kan fanges i en tynd skive ved hjælp af denne metode.Herunder præ-Botzinger kompleks, præ-motoriske neuroner projicere til hypoglossale motor neuroner og hypoglossal nerve rootlets. Præ-Botzinger-komplekset, hypoglossal eller 12. Det centrale aspekt af denne procedure er omhyggelig isolering af rodletterne og bekræftelse af, at hjernestammen ikke er beskadiget, før du skærer den sidste skive.Efter denne procedure kan elektrofysiologi optagelser foretages ved hjælp af patch klemme metoder, ekstra cellulære optagelser eller suge elektroder til at registrere den elektriske aktivitet produceret af netværket. Tidligere offentliggjorte protokoller har givet lidt trin-for-trin detaljer, hvilket gør det vanskeligt for nye forskere at bruge denne metode uden at rejse til et andet laboratorium og tilbringe tid sammen med en erfaren investigator.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Whole Cell Recording from an Organotypic Slice Preparation of Neocortex

We have been studying the expression and functional roles of voltage-gated potassium channels in pyramidal neurons from rat neocortex.  Because of the ...

Imaging Pheromone Sensing in a Mouse Vomeronasal Acute Tissue Slice Preparation

Imaging Pheromone Sensing i en mus Vomeronasal Akut Tissue Slice Forberedelse

Peter Karlson and Martin L&uuml;scher used the term pheromone for the first time in 19591 to describe chemicals used for intra-species communication. ...

Chicken Embryo Spinal Cord Slice Culture Protocol

Chicken Embryo Spinal Cord Slice Culture protokol

Slice cultures can facilitate the manipulation of  embryo development both pharmacologically and through gene manipulations. In  this reduced system, ...

Nucleofection of Rodent Neuroblasts to Study Neuroblast Migration In vitro

Nucleofection of Rodent Neuroblasts to Study Neuroblast Migration In vitro

Nucleofection gnaver neuroblasts til Studieinformationen neuroblast Migration<em&gt; In vitro</em

The subventricular zone (SVZ) located in the lateral wall of the lateral ventricles plays a fundamental role in adult neurogenesis. In this restricted ...

Electrophysiology on Isolated Brainstem-spinal Cord Preparations from Newborn Rodents Allows Neural Respiratory Network Output Recording

Elektrofysiologi på isolerede hjernestamme-rygmarv Forberedelser fra Newborn Gnavere Tillader Neural Respiratory Network Output Optagelse

While it is well known that the central respiratory drive is located in the brainstem, several aspects of its basic function, development, and response to ...

Spinal Cord Neurons Isolation and Culture from Neonatal Mice

Spinal Cord Neurons Isolation og Culture fra Neonatal Mus

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on ...

Preparation and Immunostaining of Myelinating Organotypic Cerebellar Slice Cultures

Forberedelse og immunfarvning af Myelinating Organotypic cerebellare skive kulturer

In the nervous system, myelin is a complex membrane structure generated by myelinating glial cells, which ensheathes axons and facilitates fast electrical ...

In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity

In Vitro Wedge Slice Forberedelse til efterligne In Vivo Neuronal Circuit Connectivity

In vitro slice electrophysiology techniques measure single-cell activity with precise electrical and temporal resolution. Brain slices must be relatively ...

Uptake of Fluorescent Labeled Small Extracellular Vesicles In Vitro and in Spinal Cord

Uptake of Fluorescent Labeled Small Extracellular Vesicles In Vitro and in Spinal Cord

Optagelse af fluorescerende mærket små ekstracellulære vesikler In Vitro og i rygmarven

Small extracellular vesicles (sEVs) are 50-150 nm vesicles secreted by all cells and present in bodily fluids. sEVs transfer biomolecules such as RNA, ...

Whole Neonatal Cochlear Explants as an In vitro Model

Whole Neonatal Cochlear Explants as an In vitro Model

Hele nyfødte cochlear eksplanter som en in vitro model

Untreated hearing loss imposes significant costs on the global healthcare system and impairs individuals' quality of life. Sensorineural hearing loss is ...