Name: preparation of rhythmically-active in vitro neonatal rodent brainstem-spinal cord and thin slice
Uploaded: 2019-03-23T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Rhythmically-active In Vitro Neonatal Rodent Brainstem-spinal Cord and Thin Slice at JoVE.com

S.B.P הוא אחד מנמעני לומה לינדה אוניברסיטת קיץ לתואר ראשון מחקר לאגודה.

להלן כללי התנהגות מקובלים ואושר על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) מאוניברסיטת לומה לינדה. הנחיות NIH יחס מוסרי לבעלי חיים הם בעקבותיו כל הניסויים שבוצעו במעבדה. כל סטנדרטים אתיים אושרו על ידי יחידים ביצוע פרוטוקול זה.
1. פתרונות
<ol><li>
להכין מלאכותית לנו...

<ol>
	<li>Hilaire, G., Duron, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+of+the+Mammalian+Respiratory+System.">Maturation of the Mammalian Respiratory System.</a> Physiological Reviews. 79, 325-360 (1999).</li><li>Pinkerton, K. E., Joad, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mammalian+Respiratory+System+and+Critical+Windows+of+Exposure+for+Children's+Health.">The Mammalian Respiratory System and Critical Windows of Exposure for Children's Health.</a> Environmental Health Perspectives. 108, 6 (2000).</li><li>Smith, J. C., Ellenberger, H. H., Ballanyi, K., Richter, D. W., Feldman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-B&#246;tzinger+complex:+a+brainstem+region+that+may+generate+respiratory+rhythm+in+mammals.">Pre-B&#246;tzinger complex: a brainstem region that may generate respiratory rhythm in mammals.</a> Science. 254, 726-729 (1991).</li><li>Smith, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+rhythm+generation+in+neonatal+and+adult+mammals:+the+hybrid+pacemaker-network+model.">Respiratory rhythm generation in neonatal and adult mammals: the hybrid pacemaker-network model.</a> Respiration Physiology. 122, 131-147 (2000).</li><li>Ramirez, J. M., Schwarzacher, S. W., Pierrefiche, O., Olivera, B. M., Richter, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+lesioning+of+the+cat+pre-B&#246;tzinger+complex+in+vivo+eliminates+breathing+but+not+gasping.">Selective lesioning of the cat pre-B&#246;tzinger complex in vivo eliminates breathing but not gasping.</a> The Journal of Physiology. 507, 895-907 (2004).</li><li>Butera, R. J., Rinzel, J., Smith, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+of+Respiratory+Rhythm+Generation+in+the+pre-B&#246;tzinger+Complex:+II.+Populations+of+Coupled+Pacemaker+Neurons.">Models of Respiratory Rhythm Generation in the pre-B&#246;tzinger Complex: II. Populations of Coupled Pacemaker Neurons.</a> Journal of Neurophysiology. 82, 398-415 (1999).</li><li>Suzue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+rhythm+generation+in+the+in+vitro+brain+stem-spinal+cord+preparation+of+the+neonatal+rat.">Respiratory rhythm generation in the in vitro brain stem-spinal cord preparation of the neonatal rat.</a> Journal of Physiology (London). 354, 173-183 (1984).</li><li>Feldman, J. L., Del Negro, C. A., Gray, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+rhythm+of+breathing:+so+near,+yet+so+far.">Understanding the rhythm of breathing: so near, yet so far.</a> Annual Review of Physiology. 75, 423-452 (2013).</li><li>Rekling, J. C., Shao, X. M., Feldman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+Coupling+and+Excitatory+Synaptic+Transmission+between+Rhythmogenic+Respiratory+Neurons+in+the+PreB&#246;tzinger+Complex.">Electrical Coupling and Excitatory Synaptic Transmission between Rhythmogenic Respiratory Neurons in the PreB&#246;tzinger Complex.</a> Journal of Neuroscience. 20, 113 (2000).</li><li>Rousseau, J. -. P., Caravagna, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiology+on+Isolated+Brainstem-spinal+Cord+Preparations+from+Newborn+Rodents+Allows+Neural+Respiratory+Network+Output+Recording.">Electrophysiology on Isolated Brainstem-spinal Cord Preparations from Newborn Rodents Allows Neural Respiratory Network Output Recording.</a> Journal of Visualized Experiments. , e53071 (2015).</li><li>Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-cell+Patch-clamp+Recordings+in+Brain+Slices.">Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices.</a> Journal of Visualized Experiments. (112), e54024 (2016).</li><li>Koizumi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Imaging,+Spatial+Reconstruction,+and+Biophysical+Analysis+of+a+Respiratory+Motor+Circuit+Isolated+In+Vitro.">Functional Imaging, Spatial Reconstruction, and Biophysical Analysis of a Respiratory Motor Circuit Isolated In Vitro.</a> Journal of Neuroscience. 28, 2353-2365 (2008).</li><li>Danneman, P., Mandrell, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+five+agents/methods+for+anesthesia+of+neonatal+rats.">Evaluation of five agents/methods for anesthesia of neonatal rats.</a> Laboratory Animal Science. 47, 386-395 (1997).</li><li>Umezawa, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orexin-B+antagonized+respiratory+depression+induced+by+sevoflurane,+propofol,+and+remifentanil+in+isolated+brainstem-spinal+cords+of+neonatal+rats.">Orexin-B antagonized respiratory depression induced by sevoflurane, propofol, and remifentanil in isolated brainstem-spinal cords of neonatal rats.</a> Respiratory Physiology &amp; Neurobiology. 205, 61-65 (2015).</li><li>Bierman, A. M., Tankersley, C. G., Wilson, C. G., Chavez-Valdez, R., Gauda, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perinatal+hyperoxic+exposure+reconfigures+the+central+respiratory+network+contributing+to+intolerance+to+anoxia+in+newborn+rat+pups.">Perinatal hyperoxic exposure reconfigures the central respiratory network contributing to intolerance to anoxia in newborn rat pups.</a> Journal of Applied Physiology. 116, 47-53 (2014).</li><li>Formenti, A., Zocchi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Error+signals+as+powerful+stimuli+for+the+operant+conditioning-like+process+of+the+fictive+respiratory+output+in+a+brainstem-spinal+cord+preparation+from+rats.">Error signals as powerful stimuli for the operant conditioning-like process of the fictive respiratory output in a brainstem-spinal cord preparation from rats.</a> Behavioural Brain Research. 272, 8-15 (2014).</li><li>Negro, C. A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sodium+and+Calcium+Current-Mediated+Pacemaker+Neurons+and+Respiratory+Rhythm+Generation.">Sodium and Calcium Current-Mediated Pacemaker Neurons and Respiratory Rhythm Generation.</a> Journal of Neuroscience. 25, 446-453 (2005).</li><li>Johnson, S. M., Koshiya, N., Smith, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+the+Kernel+for+Respiratory+Rhythm+Generation+in+a+Novel+Preparation:+The+Pre-B&#246;tzinger+Complex+"Island".">Isolation of the Kernel for Respiratory Rhythm Generation in a Novel Preparation: The Pre-B&#246;tzinger Complex "Island".</a> Journal of Neurophysiology. 85, 1772-1776 (2001).</li><li>Funk, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+respiratory+rhythm+generating+networks+in+neonatal+mice+lacking+NMDAR1+gene.">Functional respiratory rhythm generating networks in neonatal mice lacking NMDAR1 gene.</a> Journal of Neurophysiology. 78, 1414-1420 (1997).</li><li>Campos, M., Bravo, E., Eugen&#237;n, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+dysfunctions+induced+by+prenatal+nicotine+exposure.">Respiratory dysfunctions induced by prenatal nicotine exposure.</a> Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 36, 1205-1217 (2009).</li><li>Ballanyi, K., Volker, A., Richter, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anoxia+induced+functional+inactivation+of+neonatal+respiratory+neurones+in+vitro.">Anoxia induced functional inactivation of neonatal respiratory neurones in vitro.</a> NeuroReport. 6, 165-168 (1994).</li><li>Ruangkittisakul, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+Sensitivity+to+Neuromodulator-Activated+Signaling+Pathways+at+Physiological+[K+]+of+Confocally+Imaged+Respiratory+Center+Neurons+in+On-Line-Calibrated+Newborn+Rat+Brainstem+Slices.">High Sensitivity to Neuromodulator-Activated Signaling Pathways at Physiological [K+] of Confocally Imaged Respiratory Center Neurons in On-Line-Calibrated Newborn Rat Brainstem Slices.</a> Journal of Neuroscience. 26, 11870-11880 (2006).</li><li>Rybak, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+the+ponto-medullary+respiratory+network.">Modeling the ponto-medullary respiratory network.</a> Respiratory Physiology &amp; Neurobiology. 143, 307-319 (2004).</li><li>Ruangkittisakul, A., Kottick, A., Picardo, M. C. D., Ballanyi, K., Del Negro, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+pre-B&#246;tzinger+complex+inspiratory+center+in+calibrated+'sandwich'+slices+from+newborn+mice+with+fluorescent+Dbx1+interneurons.">Identification of the pre-B&#246;tzinger complex inspiratory center in calibrated 'sandwich' slices from newborn mice with fluorescent Dbx1 interneurons.</a> Physiological Reports. 2, (2014).</li><li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , (1997).</li><li>Franklin, K. B. J., Paxinos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2008).</li></ol>

התאמת הפרוטוקול המוצגים כאן לתוך הגוש en או פרוסה זרימת העבודה היא יתרון עבור מעבדות ולחתוך מחקרים כי הייתי רוצה לנצל גם en bloc גזע המוח-השדרה ו/או דק ההכנות להקלטות אלקטרופיזיולוגיה. שיטת חיתוך ופרוסות שהוצגו, בשילוב עם שיטות דיווח בעבר על-ידי אחרים17,18,<s...

הרשת העצבית בדרכי הנשימה של גזע המוח מספק תחום פורייה להבנת מאפייניה של קצבי רשתות עצביות. בפרט, העניין הוא בפיתוח של מכרסם neonatal נושם והבנה איך מתפתח בקצב הנשימה. זה עשוי להיות נעשה שימוש בגישה מרובת רמות, כולל ויוו plethysmography כל בעלי חיים, אין ויטרו en bloc עצב הקלטות, במבחנה לחתוך הקלטות מכילות את הגנרטור קצב הנשימה. רדיוקציוניסטי בהקלטות חוץ גופית en הגוש ופרוסות הן שיטה יתרון לשימוש בעת חקירת המנגנון מאחורי rhythmogenesis הנשימה ואת המעגלים העצביים באזור גזע המוח-עמוד השדרה של פיתוח מכרסמים. מערכת הנשימה פיתוח כולל כ 40 סוגי תאים, המאופיינת על ידי ירי דפוס, כולל אלה של מרכז הנשימה1,2. לרשת מרכזי הנשימה כוללת קבוצה של נוירונים פעילים בקצב ממוקם לשד ventrolateral rostral1,3. Rhythmogenesis הנשימה יונקים נוצר מן autorhythmic interneuron רשת כינו את preBötzinger מורכבים (ות ת), אשר היה מקומי השפעול דרך ההכנות הגוש פרוסה והן en של מידע יונקים neonatal גזע המוח-שדרתית חוטי3,4,5,6,7,8. אזור זה משמש פונקציה דומה סינוס-פרוזדור (SA) בלב ויוצרת מערכת תזמון inspiratory נסיעה נשימה. מ נכסים ובנין, הקצב inspiratory מתבצע באזורים אחרים של גזע המוח (כולל את הגרעין מנוע hypoglossal), בריכות מנוע בעמוד השדרה (כגון הנוירונים מנוע הסרעפת לנהוג הסרעפת)9.
פעילות אומנותית ניתן להשיג באמצעות גזע המוח חוט השדרה en הגוש ההכנות או פרוסות ממגוון רחב של אוכלוסיות תאים, כולל C3-C5 עצב rootlets, rootlets עצב XII, גרעין מנוע hypoglossal (XII MN), hypoglossal premotor נוירונים (נויטרופיל XII), ו נכסים ובנין3,10,11,12. בעוד אלה שיטות איסוף הנתונים היו הצלחה מעבר קומץ של מעבדות, רבים מן הפרוטוקולים לא מוצגים באופן שאינו לשחזור באופן מלא עבור חוקרים חדשים להזין את השדה. קבלת en קיימא ופעיל בקצב ההכנות הגוש ופרוסות דורש תשומת לב חדה לפרטים דרך כל השלבים של דיסקציה, פרוטוקול חיתוך פרוסה. הפרוטוקולים הקודמים בהרחבה לתאר את ההקלטה הליכים שונים, אלקטרופיזיולוגיה, עדיין מחסור פירוט בחלק הקריטי ביותר של קבלת הכנה מעשית רקמות: ביצוע ההליך חיתוך ופרוסות גזע המוח-השדרה.
קבלת ביעילות en בקצב אחיד-פעיל בר -קיימא הגוש או פרוסה הכנה גזע המוח-השדרה אלקטרופיזיולוגיה הקלטות דורש כי כל השלבים להתבצע כראוי, בזהירות ובמהירות (בדרך כלל, כל התהליך קשורים כאן יכול להיות הופיעה כ 30 דקות). נקודות קריטיות של פרוטוקול אלקטרופיזיולוגיה גזע המוח-השדרה לא קודם לכן טוב שתוארו כוללים את הקרע של עצב rootlets, את ההליך עם פרוסות על vibratome. פרוטוקול זה הוא הראשון stepwise באופן חזותי את הקרע גזע המוח-השדרה עבור חוקרים חדשים והן מומחים בתחום. פרוטוקול זה מסביר באופן יסודי גם טכניקות ניתוחיות, ציוני דרך, הליכים אחרים כדי לסייע לחוקרים עתידיים ביצירת אחידות פרוסות והכנות en bloc להכיל את המעגלים המדויק הרצוי ניסוי. הגורים neonatal עכבר ועכבר יכולים לשמש ההליכים המובאים כאן.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1159px;" width="1158">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">NaCl</td>
			<td style="width:288px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:320px;">S271-500</td>
			<td style="width:192px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P5405-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaHCO3</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP328-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaH2PO4 &#8226;H2O</td>
			<td>Sigma Aldrch</td>
			<td>S9638-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CaCl2&#8226;2H2O</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C7902-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MgSO4&#8226;7H2O</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M7774-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D-Glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G8270-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cold-Light source Halogen lamp 150W</td>
			<td>AmScope</td>
			<td>H2L50-AY</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dissection Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vibratome 1000 Plus</td>
			<td>Vibratome</td>
			<td>W3 69-0353</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnetic Base</td>
			<td>Kanetic</td>
			<td>MB-B-DG6C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isoflurane, USP</td>
			<td>Patterson Veterinary</td>
			<td>NDC 14043-704-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sword Classic Double Edge Blades</td>
			<td>Wilkinson</td>
			<td>97573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Histoclear</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H2779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dumont #5 Fine Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dumont #5/45 Forcep</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Scalpel Blades #10</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10010-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Scalpel Handel #3</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10003-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Spring Scissors Straight&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15024-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Narrow Pattern Forcep Serrated/straight</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11002-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Castroviejo Micro Dissecting Spring Scissors; Straight</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vannas Scissors 3&#34; Curved</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Insect pins, 0</td>
			<td>Fine Science Tools/8840604</td>
			<td>26000-35&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Insect pins, 0, SS</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26001-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Insect pins, 00</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26000-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Insect pins, 00, SS</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26001-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Insect pins, 000</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26000-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Insect pins, 000, SS</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26001-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Minutien pins, 0.10 mm</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26002-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Minutien pins, 0.15 mm</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26002-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Minutien pins, 0.2 mm</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26002-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fisher Tissue prep Parafin&#160;</td>
			<td>fisher</td>
			<td>T56-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Graphite&#160;</td>
			<td>fisher&#160;</td>
			<td>G67-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Delrin Plastic&#160;</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>3HMT2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">18 Gauge Hypodermic Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305195</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of rhythmically-active in vitro neonatal rodent brainstem-spinal cord and thin slice

בתרבית של קצב inspiratory מופק ברשת העצבית באזור של לשד בשם preBötzinger את מורכבות (ות ת), אשר מייצר אות נהיגה קצבית התכווצות של השרירים inspiratory. פעילות עצבית הקצבי שנוצר נכסים ובנין ונשאנו לבריכות עצביים אחרים לכונן שמערכת השרירים של הנשימה עשויים להילמד תוך שימוש בשיטות שונות, כולל en bloc עצב הקלטות, הקלטות פרוסה רוחבי. עם זאת, שיטות שפורסמו בעבר לא בהרחבה תיארו את תהליך ניתוח גזע המוח-השדרה באופן שקוף לשחזור עבור מחקרים עתידיים. כאן, אנו מציגים סקירה מקיפה של שיטה המשמשת reproducibly חותכים פרוסות גזע המוח בקצב אחיד-פעיל המכיל את המעגלים עצביים חיוני ומספיק עבור הפקת ושידור נסיעה inspiratory. עבודה זו מתבססת על פרוטוקולים אלקטרופיזיולוגיה גזע המוח-השדרה הקודם כדי להגביר את הסבירות של אמין קבלת פרוסות בקצב אחיד-פעיל ובר קיימא עבור הקלטה עצביים ופלט נכסים ובנין, הנוירונים premotor hypoglossal (נויטרופיל XII), ו hypoglossal מוטורי לגלוקוז (XII MN). העבודה הציגה ומרחיב על שיטות קודמות שפורסמו על-ידי מתן איורים מפורט, צעד אחר צעד של הקרע, מן החולדה כל גור, פרוסה במבחנה המכילה את rootlets XII.

השיטה המוצגת כאן מאפשר חוקר מעוניינת לקבל פרוסות פעיל בקצב של גזע המוח reproducibly ובאמינות חותך קיימא, חסון, שיאפשר הקלטה של פלט מנוע פיקטיבי במשך שעות רבות. כל הרכיבים מעגלים עצביים מינימלית הכרחי עבור הפקת ושידור קצב inspiratory ניתן ללכוד פרוסה דק בשיטה זו. רכיבים אלה כוללים: preB...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Rhythmically-active In Vitro Neonatal Rodent Brainstem-spinal Cord and Thin Slice at JoVE.com

Preparation of Rhythmically-active In Vitro Neonatal Rodent Brainstem-spinal Cord and Thin Slice

פרוטוקול זה מתקשר ההכנה גזע המוח-עמוד השדרה של מבהיר את הכנת פרוסות רוחבי גזע המוח באופן מקיף שלב אחר שלב. זה נועד להגדיל את הפארמצבטית ולשפר את הסבירות של קבלת פרוסות קיימא, לאורך זמן, בקצב אחיד-פעיל עבור הקלטה פלט עצבית מהאזורים הנשימה של גזע המוח.

הכנת בקצב אחיד-פעיל חוץ גופית Neonatal מכרסמים גזע המוח-השדרה, פרוסה דק

Mammalian inspiratory rhythm is generated from a neuronal network in a region of the medulla called the preB&#246;tzinger complex (pBC), which produces a ...

שיטה זו מקלה על ניתוח להתרבות ו חיתוך של מוחות מכרסמים לניתוח שנתפס של רשת הנשימה מדולרי Mirian. טכניקה זו מציעה גמישות ניסיונית רבה, מה שמאפשר להכין ביטול חסימה במבחנה או הכנת פרוסה להקלטה. שיטה זו עשויה לשמש לניסויים אלקטרופיזיולוגיים כדי לחקור את מעגל הבקרה העצבית המייצרת מקצבי נשימה ולהבין את הפתולוגיה ואת פירוק הנשימה במכרסמים מהונדסים גנטית.לאחר ניתוח של neuraxis, להעביר במהירות את תא המטען המבודד של החיה לתא ניתוח aerated תחת מיקרוסקופ ניתוח ולהנח את הרקמה הגב בצד למעלה, עם הקצה rostral מול החלק הקדמי של התא. הצמד את הרקמה בכתפיים ואת הקצה האידיוט ביותר של חוט השדרה ולעשות חתך midsagittal דרך הגולגולת בעקבות התפר הקודקודי, כדי למנוע פגיעה בקליפת המוח ואת גזע המוח מתחת לגולגולת. החל בתפר הסגיטלי ועובד באופן כללי, לחטוף את התפרים העורפיים של הגולגולת כדי ליצור מדפים של עצם שעשויים לבוא לידי ביטוי מוצמד לעגון ולייצב את החלק rostral של הגולגולת.לאחר המשקף את שני מדפים הגולגולת, בלו את שאר קליפת המוח, משאיר את החלק caudal של המוח הקטן יחסית שלם לבצע כריתת למין הגב. השתמש מספריים קפיץ מיקרו מדפים כדי להסיר את השרירים המקיפים את הגולגולת ואת עמוד החוליות. הסר את הרקמה לאורך הצד הגבי של בית החזה, משאיר את הצלעות שלמות בזהירות לחתוך את התהליכים הצדדיים של למינה החוליות.לאחר חיתוך כל רקמה overlying את הפונס medulla, vermis, המוח הקטן, פונס ותחילת חוט השדרה, יהיה גלוי בבירור. כדי לבצע כריתת גחון, מניחים את הרקמה בצד הגב למטה ומצמידים בבית החזה ואת הקצה האוקולי ביותר של עמוד השדרה. השתמש מדפים הגולגולת להצמיד את הצד rostral של הרקמה ולהסיר את החצי הגחוני של בית החזה, כולל עצם החזה ואת כל איברי הבטן.לנתח את הרקמה הרכה המחוברת לבית החזה כדי לחשוף את הצלעות וחוט השדרה ולהסיר את הלשון, הוושט, קנה הנשימה, הגרון וכל הרקמה הרכה האחרת ואת השרירים מעל בסיס הגולגולת ועמוד השדרה. על מנת לזהות את המשטח הקשה, לנתח את הרקמה overlying זה צלחת מלבנית של עצם בבסיס הגולגולת, הכולל חריץ בצורת v. ואז לחתוך לאורך קו האמצע של המשטח, בזהירות להרים את הרקמה כלפי מעלה ולבצע חתך רוחבי כדי להסיר אותו.כדי להתחיל כריתת למין גחונית, להסיר את למינה, חושף את פני השטח הגחוניים של גזע המוח ואת חוט השדרה מן החוליה הצווארית הראשונה לחוליה בית החזה בערך שבע ולתוך חמישה עד 10 מילימטרים לאורך שני צידי עמוד השדרה בלמינה. כאשר חוט השדרה נחשף, חותכים את השורשים כ-20 עד 25 מילימטרים דו-צדדיים, לאורך עמוד השדרה ל- T7 בקירוב ומרימים בזהירות את הקצה הרוזטרלי של C1, C2 ו- C3 עם מדפים מחוברים או מכופפים כדי לאפשר חיתוך מתחת לעצם להסרת שלוש החוליות. כאשר האורך הרצוי של חוט השדרה בודד מעמוד החוליות, בצע חתך רוחבי כדי להסיר את רקמת חוט השדרה.לאחר הסרת דורה, מניחים את גזע המוח במרכז פלטפורמת הפרפין על בלוק חיתוך הפלסטיק ולהשתמש סיכות חרקים עדין, גזוז לא יותר מסנטימטר אחד אורך להצמיד את הקצה caudal של גזע המוח דרך חוט השדרה דיסטלי. לאחר מכן ליישר את בלוק חיתוך מכוסה פרפין עם גזע המוח מוצמד במחזיק בלוק ויטון, כך הלהב יהיה לחתוך בניצב לפנים rostral של גזע המוח. לאחר מכן, בצע פרוסה ראשונית כדי להסיר 200 עד 300 מיקרומטר של רקמה לא אחידה מחוץ לעצם על הקצה ביותר של הרקמה, ביצוע התאמות קטנות לפי הצורך כדי להבטיח ליניאריות PARP וחתכים קטנים כדי להסיר כל רקמה אחידה.שורשי glossopharyngeal יהפכו גלויים בקצה השני של גזע המוח, לחתוך פרוסה 300 כדי 500 מיקרומטר של גזע המוח מן סמנים נוירואנטומיים rostral אלה כדי ללכוד את תסביך טרום Botzinger ואת מעגלי השידור הקשורים. כל שלבי הליך החותך הם קריטיים ליצירת פרוסה ניתנת לשחזור ובת קיימא, עם כל המעגלים העצביים הדרושים בכיוון הנכון כדי לייצר קצב חזק. כל האלמנטים המינימלי הדרושים במעגל העצבי ליצירת ומשדר קצב מעורר השראה ניתן ללכוד פרוסה דקה באמצעות שיטה זו.כולל תסביך טרום בוצינגר, נוירונים טרום מוטוריים מקרינים לנוירונים המוטוריים ההיפוגלוסלים ושורש העצבים ההיפוגלוסל. תסביך טרום בוצינגר, שורשי עצב הגולגולת ההיפוגלוסל או ה -12 ושורשי העצבים C4 יכולים לשמש להקלטה השראה. ההיבט העיקרי של הליך זה הוא בידוד זהיר של השורשים ואישור כי גזע המוח אינו פגום לפני חיתוך הפרוסה הסופית.בעקבות הליך זה, הקלטות electrophysiology יכול להתבצע באמצעות שיטות מהדק תיקון, הקלטות סלולריות נוספות או אלקטרודות יניקה כדי להקליט את הפעילות החשמלית המיוצרת על ידי הרשת. פרוטוקולים שפורסמו בעבר סיפקו פרט קטן צעד אחר צעד, מה שמקשה על חוקרים חדשים להשתמש בשיטה זו מבלי לנסוע למעבדה אחרת ולהבלות זמן עם חוקר מתובל.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Whole Cell Recording from an Organotypic Slice Preparation of Neocortex

הקלטה נייד שלמים מן ההכנה פורסים Organotypic של הניאוקורטקס

We have been studying the expression and functional roles of voltage-gated potassium channels in pyramidal neurons from rat neocortex.  Because of the ...

Imaging Pheromone Sensing in a Mouse Vomeronasal Acute Tissue Slice Preparation

הדמיה פרומון חישה ב תכשיר Vomeronasal עכבר רקמות חריפה Slice

Peter Karlson and Martin L&uuml;scher used the term pheromone for the first time in 19591 to describe chemicals used for intra-species communication. ...

Chicken Embryo Spinal Cord Slice Culture Protocol

פרוטוקול עוף עובר חוט שדרת Slice תרבות

Slice cultures can facilitate the manipulation of  embryo development both pharmacologically and through gene manipulations. In  this reduced system, ...

Nucleofection of Rodent Neuroblasts to Study Neuroblast Migration In vitro

Nucleofection of Rodent Neuroblasts to Study Neuroblast Migration In vitro

Nucleofection של neuroblasts מכרסמים לחקר הגירת neuroblast<em&gt; במבחנה</em

The subventricular zone (SVZ) located in the lateral wall of the lateral ventricles plays a fundamental role in adult neurogenesis. In this restricted ...

Electrophysiology on Isolated Brainstem-spinal Cord Preparations from Newborn Rodents Allows Neural Respiratory Network Output Recording

אלקטרופיזיולוגיה בהכנות כבל מבודדות גזע המוח-השדרה מיילוד מכרסמים מאפשרת הקלטת תפוקת רשת הנשימה עצבית

While it is well known that the central respiratory drive is located in the brainstem, several aspects of its basic function, development, and response to ...

Spinal Cord Neurons Isolation and Culture from Neonatal Mice

נוירונים חוט השדרה בידוד ותרבות מ עכברים ניאונטליים

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on ...

Preparation and Immunostaining of Myelinating Organotypic Cerebellar Slice Cultures

Immunostaining של Myelinating Organotypic פרוסה אסטרוציטומה תרבויות והכנה

In the nervous system, myelin is a complex membrane structure generated by myelinating glial cells, which ensheathes axons and facilitates fast electrical ...

In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity

במבחנה טריז פרוסה הכנה עבור חיקוי בקישוריות מעגל עצבי Vivo

In vitro slice electrophysiology techniques measure single-cell activity with precise electrical and temporal resolution. Brain slices must be relatively ...

Uptake of Fluorescent Labeled Small Extracellular Vesicles In Vitro and in Spinal Cord

Uptake of Fluorescent Labeled Small Extracellular Vesicles In Vitro and in Spinal Cord

ספיגת של שלל פלואורסצנטי שכותרתו שלשלות חוץ תאיות קטנות במבחנה ובחוט השדרה

Small extracellular vesicles (sEVs) are 50-150 nm vesicles secreted by all cells and present in bodily fluids. sEVs transfer biomolecules such as RNA, ...

Whole Neonatal Cochlear Explants as an In vitro Model

Whole Neonatal Cochlear Explants as an In vitro Model

צמחי שבלול שלמים של ילודים כמודל במבחנה

Untreated hearing loss imposes significant costs on the global healthcare system and impairs individuals' quality of life. Sensorineural hearing loss is ...