Name: probing nicotinic acetylcholine receptor function in mouse brain slices via laser flash photolysis of photoactivatable nicotine
Uploaded: 2019-01-25T13:00:00
Duration: 10 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Probing Nicotinic Acetylcholine Receptor Function in Mouse Brain Slices via Laser Flash Photolysis of Photoactivatable Nicotine at JoVE.com

Forfatterne takke laboratorium medlemmer af de følgende nordvestlige delforsøgsledere: Ryan Drenan, D. James Surmeier, Yevgenia Kozorovitskiy og Anis entreprenør. Dette arbejde blev støttet af os National Institutes of Health (NIH) (tilskud DA035942 og DA040626 til R.M.D.), PhRMA Foundation (fellowship til M.C.A.) og HHMI.

<ol>
	<li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholinergic+tone+in+ventral+tegmental+area:+Functional+organization+and+behavioral+implications.">Cholinergic tone in ventral tegmental area: Functional organization and behavioral implications.</a> Neurochemistry International. 114, 127-133 (2018).</li><li>Sarter, M., Parikh, V., Howe, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phasic+acetylcholine+release+and+the+volume+transmission+hypothesis:+time+to+move+on.">Phasic acetylcholine release and the volume transmission hypothesis: time to move on.</a> Nature Reviews Neuroscience. 10 (5), 383-390 (2009).</li><li>Coyle, J. T., Price, D. L., DeLong, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's+disease:+a+disorder+of+cortical+cholinergic+innervation.">Alzheimer's disease: a disorder of cortical cholinergic innervation.</a> Science. 219 (4589), 1184-1190 (1983).</li><li>Katz, B., Thesleff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+study+of+the+desensitization+produced+by+acetylcholine+at+the+motor+end-plate.">A study of the desensitization produced by acetylcholine at the motor end-plate.</a> Journal of Physiology. 138 (1), 63-80 (1957).</li><li>Banala, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoactivatable+drugs+for+nicotinic+optopharmacology.">Photoactivatable drugs for nicotinic optopharmacology.</a> Nature Methods. 15 (5), 347-350 (2018).</li><li>Yan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotinic+Cholinergic+Receptors+in+VTA+Glutamate+Neurons+Modulate+Excitatory+Transmission.">Nicotinic Cholinergic Receptors in VTA Glutamate Neurons Modulate Excitatory Transmission.</a> Cell Reports. 23 (8), 2236-2244 (2018).</li><li>Engle, S. E., Shih, P. Y., McIntosh, J. M., Drenan, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#945;4&#945;6&#946;2*+nicotinic+acetylcholine+receptor+activation+on+ventral+tegmental+area+dopamine+neurons+is+sufficient+to+stimulate+a+depolarizing+conductance+and+enhance+surface+AMPA+receptor+function.">&#945;4&#945;6&#946;2* nicotinic acetylcholine receptor activation on ventral tegmental area dopamine neurons is sufficient to stimulate a depolarizing conductance and enhance surface AMPA receptor function.</a> Molecular Pharmacology. 84 (3), 393-406 (2013).</li><li>Engle, S. E., Broderick, H. J., Drenan, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+application+of+drugs+to+study+nicotinic+acetylcholine+receptor+function+in+mouse+brain+slices.">Local application of drugs to study nicotinic acetylcholine receptor function in mouse brain slices.</a> Journal of Visualized Experiments. (68), (2012).</li><li>Ren, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Habenula+&amp;#34;cholinergic&amp;#34;+neurons+co-release+glutamate+and+acetylcholine+and+activate+postsynaptic+neurons+via+distinct+transmission+modes.">Habenula &amp;#34;cholinergic&amp;#34; neurons co-release glutamate and acetylcholine and activate postsynaptic neurons via distinct transmission modes.</a> Neuron. 69 (3), 445-452 (2011).</li><li>Koppensteiner, P., Melani, R., Ninan, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Cooperative+Mechanism+Involving+Ca(2+)-Permeable+AMPA+Receptors+and+Retrograde+Activation+of+GABAB+Receptors+in+Interpeduncular+Nucleus+Plasticity.">A Cooperative Mechanism Involving Ca(2+)-Permeable AMPA Receptors and Retrograde Activation of GABAB Receptors in Interpeduncular Nucleus Plasticity.</a> Cell Reports. 20 (5), 1111-1122 (2017).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+Excitation+via+GABAB+Receptors+in+Habenula+Cholinergic+Neurons+Regulates+Fear+Memory+Expression.">Presynaptic Excitation via GABAB Receptors in Habenula Cholinergic Neurons Regulates Fear Memory Expression.</a> Cell. 166 (3), 716-728 (2016).</li><li>Chen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+Baseline+and+Nicotine-Mediated+Behavioral+and+Cholinergic+Profiles+in+ChAT-Cre+Mouse+Lines.">Altered Baseline and Nicotine-Mediated Behavioral and Cholinergic Profiles in ChAT-Cre Mouse Lines.</a> The Journal of Neuroscience. 38 (9), 2177-2188 (2018).</li><li>Nagy, P. M., Aubert, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+the+vesicular+acetylcholine+transporter+increased+acetylcholine+release+in+the+hippocampus.">Overexpression of the vesicular acetylcholine transporter increased acetylcholine release in the hippocampus.</a> Neuroscience. 218, 1-11 (2012).</li><li>Ting, J. T., Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombineering+strategies+for+developing+next+generation+BAC+transgenic+tools+for+optogenetics+and+beyond.">Recombineering strategies for developing next generation BAC transgenic tools for optogenetics and beyond.</a> Frontiers in Behavioral Neuroscience. 8, 111 (2014).</li><li>Crittenden, J. R., Lacey, C. J., Lee, T., Bowden, H. A., Graybiel, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severe+drug-induced+repetitive+behaviors+and+striatal+overexpression+of+VAChT+in+ChAT-ChR2-EYFP+BAC+transgenic+mice.">Severe drug-induced repetitive behaviors and striatal overexpression of VAChT in ChAT-ChR2-EYFP BAC transgenic mice.</a> Frontiers in Neural Circuits. 8, 57 (2014).</li><li>Kolisnyk, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChAT-ChR2-EYFP+mice+have+enhanced+motor+endurance+but+show+deficits+in+attention+and+several+additional+cognitive+domains.">ChAT-ChR2-EYFP mice have enhanced motor endurance but show deficits in attention and several additional cognitive domains.</a> The Journal of Neuroscience. 33 (25), 10427-10438 (2013).</li><li>Nagy, P. M., Aubert, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+the+vesicular+acetylcholine+transporter+enhances+dendritic+complexity+of+adult-born+hippocampal+neurons+and+improves+acquisition+of+spatial+memory+during+aging.">Overexpression of the vesicular acetylcholine transporter enhances dendritic complexity of adult-born hippocampal neurons and improves acquisition of spatial memory during aging.</a> Neurobiology of Aging. 36 (5), 1881-1889 (2015).</li><li>Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+scanning+photochemical+microscopy:+mapping+ligand-gated+ion+channel+distributions.">Two-photon scanning photochemical microscopy: mapping ligand-gated ion channel distributions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (14), 6629-6633 (1994).</li><li>Khiroug, L., Giniatullin, R., Klein, R. C., Fayuk, D., Yakel, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+mapping+and+Ca2++regulation+of+nicotinic+acetylcholine+receptor+channels+in+rat+hippocampal+CA1+neurons.">Functional mapping and Ca2+ regulation of nicotinic acetylcholine receptor channels in rat hippocampal CA1 neurons.</a> The Journal of Neuroscience. 23 (27), 9024-9031 (2003).</li><li>Filevich, O., Salierno, M., Etchenique, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+caged+nicotine+with+nanosecond+range+kinetics+and+visible+light+sensitivity.">A caged nicotine with nanosecond range kinetics and visible light sensitivity.</a> Journal of Inorganic Biochemistry. 104 (12), 1248-1251 (2010).</li><li>Tochitsky, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optochemical+control+of+genetically+engineered+neuronal+nicotinic+acetylcholine+receptors.">Optochemical control of genetically engineered neuronal nicotinic acetylcholine receptors.</a> Nature Chemistry. 4 (2), 105-111 (2012).</li><li>Wokosin, D. L., Squirrell, J. M., Eliceiri, K. W., White, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+workstation+with+concurrent,+independent+multiphoton+imaging+and+experimental+laser+microbeam+capabilities.">Optical workstation with concurrent, independent multiphoton imaging and experimental laser microbeam capabilities.</a> Review of Scientific Instruments. 74 (1), 193-201 (2003).</li><li>Plotkin, J. L., Day, M., Surmeier, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptically+driven+state+transitions+in+distal+dendrites+of+striatal+spiny+neurons.">Synaptically driven state transitions in distal dendrites of striatal spiny neurons.</a> Nature Neuroscience. 14 (7), 881-888 (2011).</li><li>Galtieri, D. J., Estep, C. M., Wokosin, D. L., Traynelis, S., Surmeier, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pedunculopontine+glutamatergic+neurons+control+spike+patterning+in+substantia+nigra+dopaminergic+neurons.">Pedunculopontine glutamatergic neurons control spike patterning in substantia nigra dopaminergic neurons.</a> Elife. 6, (2017).</li><li>Yasuda, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+calcium+concentration+dynamics+in+small+neuronal+compartments.">Imaging calcium concentration dynamics in small neuronal compartments.</a> Science STKE. (219), pl5 (2004).</li><li>Inoue, S., Spring, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Video microscopy: The fundamentals. , 163-186 (1997).</li><li>Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonlinear+magic:+multiphoton+microscopy+in+the+biosciences.">Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences.</a> Nature Biotechnology. 21 (11), 1369-1377 (2003).</li><li>Maravall, M., Mainen, Z. F., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimating+intracellular+calcium+concentrations+and+buffering+without+wavelength+ratioing.">Estimating intracellular calcium concentrations and buffering without wavelength ratioing.</a> Biophysical Journal. 78 (5), 2655-2667 (2000).</li><li>Wathey, J. C., Nass, M. M., Lester, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Numerical+reconstruction+of+the+quantal+event+at+nicotinic+synapses.">Numerical reconstruction of the quantal event at nicotinic synapses.</a> Biophysical Journal. 27 (1), 145-164 (1979).</li><li>Shih, P. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+and+function+of+nicotinic+acetylcholine+receptors+in+subdivisions+of+medial+habenula.">Differential expression and function of nicotinic acetylcholine receptors in subdivisions of medial habenula.</a> The Journal of Neuroscience. 34 (29), 9789-9802 (2014).</li><li>Verhoog, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Layer-specific+cholinergic+control+of+human+and+mouse+cortical+synaptic+plasticity.">Layer-specific cholinergic control of human and mouse cortical synaptic plasticity.</a> Nature Communications. 7, 12826 (2016).</li><li>Koukouli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotine+reverses+hypofrontality+in+animal+models+of+addiction+and+schizophrenia.">Nicotine reverses hypofrontality in animal models of addiction and schizophrenia.</a> Nature Medicine. 23 (3), 347-354 (2017).</li><li>Xiao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+nicotine+selectively+enhances+&#945;4&#946;2*+nicotinic+acetylcholine+receptors+in+the+nigrostriatal+dopamine+pathway.">Chronic nicotine selectively enhances &#945;4&#946;2* nicotinic acetylcholine receptors in the nigrostriatal dopamine pathway.</a> The Journal of Neuroscience. 29 (40), 12428-12439 (2009).</li><li>Peng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Editing+Vectors+for+Studying+Nicotinic+Acetylcholine+Receptors+in+Cholinergic+Transmission.">Gene Editing Vectors for Studying Nicotinic Acetylcholine Receptors in Cholinergic Transmission.</a> European Journal of Neuroscience. , (2018).</li></ol>

D.L.W. fungerer som en betalt konsulent for Bruker Nano Fluorescens mikroskopi.

Valget af PA-Nic anvendelse/levering metode er den mest afgørende skridt i denne teknik, lokaliserede foto-stimulation. De to metoder, bad ansøgning og lokale perfusion, tilbyder hver forskellige fordele og begrænsninger. Valget er i vid udstrækning påvirket af niveauet nAChR funktionelle udtryk i celletype af interesse. Det er ofte at foretrække at bruge bad program når funktionelle udtryk niveauer er høje, som bad ansøgningen giver mulighed for en ensartet sonde koncentration omkring de indspillede celle, lette data fortolkning. Bad ansøgning også eliminerer behovet for en anden perfusion pipette i vævet, hvilket gør hele processen lettere. Dog forbindelser bad anvendelse af dyre koster mere pr. eksperiment.
Almindeligt, indebærer fejlfinding forsøger at forstå, hvorfor ikke nAChR aktivisering er set følgende flash fotolyse. Når du arbejder med en celletype, der ikke er tidligere blevet undersøgt med PA-Nic, investigator skal udføre lokale puff-anvendelse af ACh eller nikotin til at afgøre, om tilstrækkelig receptorer er funktionelt udtrykt5. For at validere, at systemet er i stand til at opdage fotolyse svar, foretages kontrol eksperimenter i mediale habenula neuroner, der udtrykker store mængder af receptor30. I denne hjerne område er PA-Nic bad ansøgning mulige, hvilket er at foretrække for validering eksperimenter. Kun efter at have udført disse validering eksperimenter bør man gå videre til en unstudied celletype. Hvis den eksperimentelle system er blevet valideret og svar er fortsat meget små eller ikke målbart, det kan være berettiget til at øge koncentrationen af PA-Nic, øge flash intensitet eller impulslængde, tilføje en nAChR positive allosteriske modulator til at forbedre nAChR aktivitet6, eller en kombination af disse.
Lejlighedsvis, uncaging svar er for stor, med betydelige nAChR aktivering resulterer i indirekte spænding gated Na+ kanal aktivering og unclamped indad strømninger på grund af dårlig plads klemme. Disse artefakter, som helt obskure nAChR indad strømninger og umuliggør data fortolkning, kan elimineres ved optagelse af QX-314 (2 mM) i optagelse pipette. De kan også fjernes ved at reducere koncentrationen af PA-Nic eller ved at reducere flash intensitet eller impulslængde. I alle synlige lys foto-stimulation eksperimenter, skal der udvises forsigtighed til når du vælger stimulation websteder for at undgå utilsigtede stimulation/fotolyse over eller under den ønskede fokalplan. Derudover og da gældende, laser power skal altid titreres til at reproducere fysiologiske reaktioner. Det er især vigtigt at være opmærksom på z-aksen photostimulation, når du arbejder med bur ligander, som ligander, der aktiveres over/under den fokale sted kan stadig diffus og interagere med det biologiske system (dvs., receptorer) under undersøgelsen.
PA-Nic laser flash fotolyse kan ikke være egnet til alle efterforskere, som flere begrænsninger findes. Først er den relativt høje pris på et passende set-up. Når du arbejder med intakt hjernen skiver, uncaging nær lille diameter strukturer som dendritter kræver et avanceret visualisering system som en 2-foton mikroskop. Bortset fra den høje pris på en Ti:sapphire, afstemmelige IR pulserende laser til højtydende 2-foton mikroskopi, øger en dual-Drejespoleinstrument system i stand til uafhængigt positionering to laserstråler yderligere system omkostninger. Samlede system omkostninger kan reduceres ved hjælp af et hjem-bygget system hvis investigator har tilstrækkelig ekspertise og tid til at konstruere, fejlfinding og vedligeholde et sådant system. En anden begrænsning ofte indebærer lav nAChR funktionelle udtryk, som kan være delvis mindsket ved at træffe foranstaltninger som ovenfor nævnt, men dette kan ikke garantere succes. Typisk, hvis man ikke kan måle ligand-aktiveret strømme efter puff-anvendelse af agonister, kan PA-Nic flash fotolyse under spænding klemme ikke give acceptable resultater. En tredje begrænsning indebærer den iboende fluorescens af PA-Nic. PA-Nic absorberer ~ 405 nm lys og udsender i et lignende udvalg som grøn fluorescerende proteiner (NGL) eller Alexa 4885. Når PA-Nic koncentrationerne overstiger ~ 1 mM, kan denne fluorescens egenskab gøre det udfordrende at samtidig visualisere neuronal strukturer. For at afbøde dette, er det kritisk at kunne nemt styre strømmen af PA-Nic fra perfusion pipette. Med jævne mellemrum, blev PA-Nic flow stoppet for at tillade fluorescerende molekyler til diffuse væk. Dette er tilladt re-tænkelig af neuron til at kontrollere den spot placering af uncaging bjælken. En fjerde potentielle begrænsning at nævne indebærer brug af 405 nm lys for fotolyse. Kortere bølgelængder som 405 nm er mere tilbøjelige til spredning i komplekse væv som en hjerne skive. Således, på en given flash intensitet og varighed, uncaging svar amplituder og decay kinetik kan varierende påvirkes af dybden af uncaging fokus i Skive. Konklusioner om biologiske aspekter af nAChRs bør tage denne vigtige forbehold i betragtning.
Denne lokaliserede laser flash fotolyse teknik er for nylig blevet brugt til at afdække nye detaljer om nAChR neurobiologi. For eksempel, forbedrer kronisk nikotin eksponering perisomatic og dendritiske nAChR funktion i mediale habenula neuroner5. Det blev også brugt til at hjælpe vise, for første gang, at ventrale tegmentale område glutamat neuroner express funktionelle nAChRs i deres perisomatic og dendritiske cellulære rum6. Der er mange potentielle fremtidige anvendelser af denne teknik, og tilgangen kunne anvendes på andre centrale neuron typer, der er kendt for at udtrykke nAChRs, såsom kortikale pyramideformet neuroner31 eller interneurons i hjernebarken32, striatum33 , og hippocampus19. Denne teknik kan også kombineres med farmakologi og/eller nAChR-gen redigering34 for at lokalisere specifikke receptor undertyper til forskellige neuronal rum. Metoden kan være let tilpasses til andre cumarin fra burhøns forbindelser, herunder, men ikke begrænset til, dem udviklet parallelt med PA-Nic5. Endelig, PA-Nic flash fotolyse måske en dag bruges i dyrets vågen/opfører sig til at studere Nikotins indsats i romanen adfærdsmæssige farmakologi paradigmer.

Kolinerge signalering modulerer talrige hjernen processer, herunder attentional kontrol, viljesmæssige bevægelse og belønning1,2. Lægemidler, der forbedrer acetylkolin (ACh) transmission bruges til at behandle kognitiv svækkelse forbundet med Alzheimers sygdom, hvilket indebærer en vigtig rolle for kolinerge systemer i kognition3. En bedre forståelse af kolinerge receptorer og kredsløb i raske og syge stater kan føre til bedre terapeutiske tilgange til flere neurologiske sygdomme/lidelser.
Nicotinsyre ACh receptorer (nAChRs) er en familie af ligand-gated Ionkanaler, der flux kationer reaktion på endogene ACh eller eksogen nikotin fra tobaksvarer. I betragtning af at de var blandt de allerførste neurotransmitter receptorer er beskrevet4, er nAChR farmakologi og placering i muskelfibre velforståede for muskel-type receptorer. Derimod er relativt lidt kendt om farmakologi og subcellulært distribution af indfødte nAChRs i hjernen. Denne forskel i viden var for nylig rettet ved at udvikle en roman kemiske sonde, der giver mulighed for rumligt begrænset og hurtig aktivering af nAChRs i hjernevæv under cellulære imaging og elektrofysiologiske optagelse5. Her, er de vigtige metodologiske trin i denne fremgangsmåde beskrevet, med det overordnede mål om at forbedre evnen til at forbinde nAChR funktion med neuronal struktur.
Photoactivatable nikotin (PA-Nic, kemisk navn: 1-[7-[bis(carboxymethyl)-amino] cumarin-4-yl] methyl-nikotin) kan være photolyzed med ~ 405 nm laser blinker effektivt frigive nikotin5,6. Før uncaging, PA-Nic er stabil i løsning og udviser ingen uheldige farmakologiske eller fotokemisk funktioner5. Efter fotolyse, frigivne nikotin forudsigeligt aktiverer nAChRs og den uncaging biprodukter er farmakologisk inaktive5. En kontinuerte laser bruges som fotolyse lyskilde med en udgangseffekt > 1 mW målt på prøven. Når lokaliseret, målrettede foto-stimulation er kombineret med evnen til at finde cellemembranerne med 2-foton laser scanning mikroskopi (2PLSM), og de to vigtigste fordele ved denne tilgang er fuldt realiseret: fotolyse hastighed og rumlige præcision.
I de fleste henseender er fotolyse af PA-Nic overlegen i forhold til andre metoder til at levere nAChR ligander til receptorer i hjernen skiver. Sådanne strategier omfatter bad ansøgning7 og lokale stof levering via en kuglefisk pipette8. Der henviser til, at den tidligere strategi har tendens til at over understrege de langsigtede virkninger af det anvendte stof, kan den sidstnævnte tilgang lider af variation i respons kinetik mellem forsøg og på tværs af celler. Ingen af disse alternative tilgange kan tilstrækkeligt skelne receptor aktiviteter i forskellige cellulære steder fra den samme neuron. Optogenetically-aktiveret frigivelse af ACh har været brugt i undersøgelsen af indfødte nAChRs9,10,11, men det har ikke vist sig nyttigt for kortlægning subcellulært nAChR placeringer. Endvidere, de fleste undersøgelser udnytter denne tilgang har påberåbt sig en ChR2-udtrykker bakteriel kunstige kromosom Transgene mus med unormale kolinerge transmission12,13,14, 15 , 16 , 17.
PA-Nic fotolyse er ikke kun optisk tilgang til at studere kolinerge receptorer. En bur carbachol blev brugt til funktionelt kort ACh receptor aktiviteter i kulturperler celler18 og hjernen skiver19, men var ikke kommercielt tilgængelige for sammenlignende undersøgelser under udviklingen af PA-Nic. En ruthenium bis (bipyridine)-nikotin komplekse (RuBi-nikotin) blev rapporteret til at gøre det muligt for nikotin uncaging20, men kommercielle præparater af RuBi-nikotin viste sig ringere end PA-Nic i et head-to-head sammenligning studere5. Det kan være nyttigt at gentage sådanne sammenlignende forsøg med ikke-kommercielle, meget renset RuBi-nikotin, som dens synlige absorption kunne komplimentere PA-NICs funktioner til kolinerge undersøgelser. Endelig har nAChRs også været optisk manipuleres ved hjælp af en kombination af foto-omstillelig ligander og genetisk modificerede receptorer21. Denne tilgang er et supplement til PA-Nic fotolyse i hjernevæv med evnen/kravet om genetiske målretning af den ændrede nAChR opfattes som både en fordel og en ulempe.
Flere vigtige krav af denne fremgangsmåde skal bemærkes. Først, en passende Visualisering metode er nødvendigt til præcist lokalisere neuronal membranen. Billedbehandling med konventionelle epi-Fluorescens mikroskopi kan være tilstrækkelig, når man studerer kulturperler celler, men for optagelse fra neuroner i hjernen skiver eller andre præparater, tykt væv, 2PLSM eller Konfokal mikroskopi er et krav. For det andet en egnet metode er nødvendig for at placere fotolyse laserstråle. Denne metode udnytter en dual-Drejespoleinstrument scan hoved med to uafhængige x-y spejle til raster scanning af imaging stråle og punkt photoactivation ved hjælp af den uncaging laser stråle22,23,24. Andre, mere begrænset løsninger er mulige, som (1) en enkelt-Drejespoleinstrument scan hoved at alternativt raster scanner imaging strålen og uncaging bom, eller (2) blot lede uncaging bjælken til midten af synsfeltet, således, at cellen er bragt til denne holdning til flash fotolyse. For det tredje, et system er nødvendig for samtidige elektrofysiologiske optagelse, hvis man ønsker at indsamle fysiologiske signaler under eksperimenter. Ovenstående krav kan opfyldes med en egnet all-optiske billeddannelse teknik, som for nylig beskrevet5. Nedenfor, en detaljeret protokol er inkluderet, der beskriver de vigtigste trin i denne fremgangsmåde.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Instruments, Consumables, and Miscellaneous Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiclamp 700B</td>
			<td>Molecular Devices Corp.</td>
			<td></td>
			<td>Patch clamp amplifier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pneumatic Picopump</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>PV820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instrument Co</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature Controller</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>TC-324C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibrating blade microtome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>VT1200S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrafree-MC Centrifugal Filter</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>UFC30GV0S</td>
			<td>internal solution filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass Capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B150F-4</td>
			<td>patch and local application pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(-)-Nicotine hydrogen tartrate salt</td>
			<td>Glentham</td>
			<td>GL9693</td>
			<td>nicotine salt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7-carboxymethylamino-4-methyl coumarin</td>
			<td>Janelia Research Campus</td>
			<td></td>
			<td>PA-Nic by-product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-[7-[bis(carboxymethyl)- amino]coumarin-4-yl]methyl-nicotine</td>
			<td>Janelia Research Campus</td>
			<td></td>
			<td>PA-Nic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Euthasol (Pentobarbital Sodium and Phenytoin Sodium)</td>
			<td>Virbac</td>
			<td>ANADA #200-071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa FluorTM 488 Hydrazide</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A10436</td>
			<td>green fill dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa FluorTM 568 Hydrazide</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A10437</td>
			<td>red fill dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-carboxy-AF594 (Alexa Fluor 594)</td>
			<td>Janelia Research Campus</td>
			<td></td>
			<td>red fill dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX 314 chloride</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2313</td>
			<td>voltage-gated sodium channel blocker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power Meter&#160;</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>S120C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals for Solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Methyl-D-glucamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic monohydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(+)-Sodium L-ascorbate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiourea</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>230391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>223506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&#8242;,N&#8242;-tetraacetic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8242;-triphosphate magnesium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanosine 5&#8242;-triphosphate sodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Components of 2-Photon Microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Ultima Laser Scanner for Olympus BX51 Microscope</td>
			<td>Bruker Nano, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>imaging software and galvos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160; Imaging X-Y galvanometers</td>
			<td>Cambridge Technology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Mai Tai HP1040</td>
			<td>Spectra-Physics</td>
			<td></td>
			<td>Tuneable IR laser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; &#160;&#160;&#160;&#160;&#160;Pockels cell M350-80-02-BK with M302RM Driver</td>
			<td>Conoptics, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>for IR laser attenuation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Integrating Sphere Photodiode Power Sensor</td>
			<td>Thorlabs, Inc</td>
			<td></td>
			<td>laser power pick-off photodiode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160; Uncaging X-Y galvanometers</td>
			<td>Cambridge Technology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Helios 2-Line Laser Launch</td>
			<td>Bruker Nano, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>uncaging laser components</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; OBIS LX/LS 405 nm (100 mW)</td>
			<td>Coherent, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; OBIS LX/LS 473 nm (75 mW)</td>
			<td>Coherent, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; &#160;Point-Photoactivation / Fiber Input Module for Limo Sidecar - Uncaging</td>
			<td>Bruker Nano, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upright Microscope</td>
			<td>&#160;Olympus</td>
			<td>BX51WIF</td>
			<td>Upright microscope chasis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160; Objective: Olympus M Plan FL 10x; NA 0.3 WD 11 mm</td>
			<td>&#160;Olympus</td>
			<td></td>
			<td>10x objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160; Objective: Olympus M Plan Fluorite 60x/1.0 WD=2mm NIR</td>
			<td>&#160;Olympus</td>
			<td></td>
			<td>60x water-dipping objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160; X-Cite 110, four-LED LLG coupled epi-fluorescence light source</td>
			<td>Excelitas Technologies</td>
			<td></td>
			<td>LED Light Source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Epi-Fluorescence Filter: ET-GFP (FITC/CY2) for Epi-Turret</td>
			<td>Chroma Technologies</td>
			<td></td>
			<td>LED Filter for blue light excitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Epi-Fluorescence Filter: ET-DsRed (TRITC/CY3) for Epi-Turret</td>
			<td>Chroma Technologies</td>
			<td></td>
			<td>LED Filter for green light excitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160; B&#38;W CCD camera; Watec, 0.5in B/W CCD</td>
			<td>Watec Co., LTD.</td>
			<td></td>
			<td>CCD camera for patch clamp recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>External Detectors - Dual Reflected Emission - Olympus Upright (Multi-Alkali, GaAsP)</td>
			<td>Bruker Nano, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160; Multi-alkali side-on PMT</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>R3896</td>
			<td>red channel PMT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 595/50m</td>
			<td>Chroma Technologies</td>
			<td></td>
			<td>red channel emission filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 565lpxr</td>
			<td>Chroma Technologies</td>
			<td></td>
			<td>dichroic beam splitter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160; GaAsP end-on PMT</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>7422PA-40</td>
			<td>green channel PMT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 525/70m</td>
			<td>Chroma Technologies</td>
			<td></td>
			<td>green channel emission filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; High-Speed Shutter for Hamamatsu H7422 PMT</td>
			<td>Vincent Associates / Bruker</td>
			<td>517329</td>
			<td>PMT shutter mount</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dodt Gradient Contrast Transmission Detection Module</td>
			<td>Bruker Nano, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160; Multi-alkali side-on PMT</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>R3896</td>
			<td>Dodt PMT</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

probing nicotinic acetylcholine receptor function in mouse brain slices via laser flash photolysis of photoactivatable nicotine

Acetylkolin (ACh) fungerer via receptorer til at graduere en bred vifte af neuronal processer, men det har udfordrende for at sammenkæde ACh receptor funktion med subcellulært placering i celler hvor denne funktion er udført. For at studere subcellulært placeringen af nicotinsyre ACh receptorer (nAChRs) i native hjernevæv, blev en optisk metode udviklet til præcise frigivelse af nikotin diskrete steder nær neuronal membraner under elektrofysiologiske optagelser. Patch-fastspændt neuroner i hjernen skiver er fyldt med farvestof til at visualisere deres morfologi i løbet af 2-foton laser scanning mikroskopi, og nikotin uncaging er udført med en lys flash ved at fokusere en 405 nm laserstråle i nærheden af en eller flere cellemembraner. Cellulære nuværende omlaegninger måles, og en høj opløsning tredimensional (3D) billede af indspillede neuron er lavet til at tillade afstemning af nAChR svar med cellulære morfologi. Denne metode giver mulighed for detaljeret analyse af nAChR funktionelle fordeling i komplekse væv præparater, lovede at øge forståelsen af kolinerge neurotransmission.

For fotolyse er stimulation, eksponering dosis (intensitet og tid), eksponering placering og beam geometri vigtige variabler. Det system, der er beskrevet i denne artikel er habil i to forskellige photostimulation bjælker, justerbar via flytte en linse i/ud af stien photostimulation lys før strålen træder Drejespoleinstrument system. Uden denne linse, photostimulation stråle fylder indgangspupillen af 60 x / 1,0 NA vand-dypning [60 x WD] mål, producerer en nær-diffraktion-begrænset, sub-µm spot på fokalplan inde i prøven. Dette er forbundet med photostimulation lys med en timeglas figur, strækker sig over og under den fokale spot symmetrisk med den optiske akse. Med linse indsat i stien, photostimulation laserlys er fokuseret ind indgangspupillen af formålet objektivet og derefter afslutter som en blyant-lignende stråle. Denne stråle, som forventes at blive ~ 10 µm i diameter for en 60 x mål, udvider ensartet/lodret under hele prøven. I denne tilstand bliver lysintensitet på enhver given placering inden for stimulation stedet ~ 1% af nær-diffraktion-begrænset lille spot intensitet. Således er højere laser beføjelser typisk kræves, når du bruger ~ 10 µm spot stimulation. For alle eksperimenter rapporteret i denne artikel, blev et timeglas-type photostimulation beam brugt.
Den leverede prøve magt kan plottes i indstillingen indgangsspænding efter måling af laser effekten på prøven ved hjælp af en energimåler. Disse undersøgelser bruger en 60 x WD mål med en arbejdende afstand af 2 mm, men det er ikke nedsænket i vand for at undgå potentielle skader på elementet detektor magt målinger. Når målene med opført NA > 0,95 måles i luften (uden nedsænkning væske), der kan være total interne reflection tab på linsen forsiden element på grund af den lavere indeks (luft). I dette tilfælde, for en mere præcis prøve effektmåling (at korrigere for total interne reflection tab), øge den målte effekt 1,0 Nielsen objektivt (1,0/0.95)2 målt i luften. Figur 1a viser en typisk input/output plot til 405 nm og 473 nm synlige lasere, der er indarbejdet i laser lanceringen systemet i denne undersøgelse. Disse laser-systemer er ideelle til foto-stimulation eksponeringskontrol dosis af følgende årsager: (1) de er pre kalibreret til at give direkte lineær power output i forhold til input-spændingen (0-5 V), (2) de giver en lydløs lukkeren drift (med ingen laser output), og (3) de har hurtig, sub-ms intensitet puls varighed kontrol (0,1 ms svar). Når du bruger spot photo-stimulation med en laser/galvo system, er rutinemæssig kalibrering af MarkPoints steder en væsentlig opgave. Figur 1b (venstre panel) viser et system, der er ude af kalibrering (ønskede punkt til foto-stimulere ikke resulterer i præcise stimulation af punkt, som angivet af brænde-hullers placering), med en tilbagevenden til nøjagtig positionsbestemmelse af stedet efter kalibrering ( Figur 1b, højre panel). 
PA-Nic er beskedent fluorescerende (emission peak på ~ 510 nm), udstiller effektiv excitation mellem 350-450 nm (1-foton excitation) eller 700-900 nm (2-foton excitation)5. For at visualisere PA-Nic under lokal applikation, PA-Nic (1 mM) blev anvendt i nærheden af hjernevæv efterfulgt af samtidige billeddannelse af (1) hjernen væv optisk sektioneret transmission forbindelse via Dodt kontrast og (2) udsendte fluorescens fra excitation (900 nm) af PA-Nic. PA-Nic 2PE fluorescens var let kan påvises under pres udslyngning fra en lokal applikation pipette (figur 2a). Nikotin og en monoalkylcoumarin, 7-carboxymethylamino-4-methyl cumarin, er de vigtigste fotokemisk produkter af PA-Nic fotolyse reaktion5. Ved hjælp af den samme imaging indstillinger/parametre, der er anvendt til PA-Nic imaging, var vævet afbildet under levering af enten nikotin (1 mM) eller 7-carboxymethylamino-4-methyl cumarin (1 mM). Ingen fluorescerende signal blev fundet (figur 2a, mellemste og nedre paneler), demonstrerer specificiteten af PA-Nic resultater. Endelig, PA-Nic blev anvendt i hjernevæv og PA-Nic fluorescens emission blev afbildet (figur 2b). Denne tilgang bekræfter, at PA-Nic er til stede i 100-200 µm i lokal applikation pipette. Sammen, bekræfter disse data, at PA-Nic effektivt leveres til hjernen væv via lokal applikation.
Elektrofysiologi optagelser med samtidige 2PLSM til visualisering af cellulære strukturer kræver investigator balance betragtninger for begge komponenter af eksperimentet, og ofte en smal gang vindue (~ 20 min) er tilgængelig for gyldig prøven dataopsamling fra en lappet celle. Uden at overveje cellulære visualisering, er det bedste praksis til at begynde at optage hurtigst muligt efter indbrud fordi optagelse stabilitet har tendens til at falde med tiden. Dog skal imaging er et krav, elektrofysiologiske overvejelser give tilstrækkelig tid til fluorescens koncentration stigninger i mindre og fjerne strukturer. Dette er eksemplificeret ved at undersøge et farvestof koncentration fylde kurven28, der er undertiden nyttigt at udlede når imaging en ny celletype. Figur 3 viser flere eksempel neuroner afbildet som Z-stakke via 2PLSM og kollapsede til en maksimal intensitet projektion til præsentation formål. Figur 3a viser billeder i høj kvalitet hvor neuronal morfologi synes at være komplet, støj er minimeret, og snavs ikke forstyrrer fortolkning af cellulære morfologi. Figur 3b viser billeder af lavere kvalitet, på grund af en lavere signal til baggrund forholdet og betydelige rester. Denne aflejringskegler optræder ofte som sfæriske lommer af intens fluorescens, som følge af udslyngning af imaging farvestof fra patch pipette mens nærmer cellen. Især inddragelsen af 100 µM PA-Nic i badet (når du udfører bad ansøgning) tendens til at reducere signal til baggrund forholdet og fører til optimale billedets kontrast. Alexa Fluor 568 eller 594 er ofte ganske nyttigt i lokal applikation eksperimenter, som en finder farvestof eller som en normalisere 2PE reference/normalisering signal. En effektiv bølgelængde for to-foton excitation af disse farvestoffer er ~ 780 nm27, som giver mulighed for samtidige visualisering af PA-Nic og identifikation af cellulære rum. Denne bølgelængde, dog undgå ikke helt to-foton fotolyse af PA-Nic5. Alexa Fluor 488 er fordelagtige i PA-Nic bad-ansøgning eksperimenter; Når ophidset med en egnet bølgelængde ≥900 nm, kan to-foton fotolyse af PA-Nic5 undgås samtidig bibeholde passende visualisering af cellulære rum.
Figur 4 viser eksempeldata for lokaliserede PA-Nic laser flash fotolyse på MHb neuroner i hjernen skiver. Figur 4a (øvre paneler) viser et eksempel på en "reference" image, som er et skærmbillede af den sidste 2PLSM billede taget før MarkPoints protokol blev kørt, belagt med foto-stimulation spot placering. Figur 4a (sænke billede paneler) viser en zoomet visning af foto-stimulation spot overlejret på de cellulære morfologi. Den tilsvarende tid-korreleret elektrofysiologiske svar på PA-Nic fotolyse er vist i figur 4alavere paneler. Tidligere arbejde viste, at disse strømme er følsomme over for nAChR antagonister5. Figur 4b viser repræsentative data fra forskellige celler hvor enkelt spot fotolyse blev udført med et interval på enten 1 s eller 10 s. en 10 s interval mulighed for tilstrækkelig opsving tid til grundlinjen holding aktuelle, et kortere interval på 1 s førte til en gradvis stigning i den aktuelle som protokollen bedrift fortsatte. Den stigende nuværende tyder på, at nikotin ikke havde tid nok til at diffuse væk fra systemet med 1 Hz intervallet29. Sådan tidsmæssig reaktion analyser skal udføres de novo på enhver ny celletype undersøges, som neuropharmacology af nAChRs kan variere mellem celletyper.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58873/58873fig1.jpg"> Figur 1: Photostimulation laser kalibrering. (en) foto-stimulation laser power output. Magt på prøve flyet (gennem en 60 x / 1,0 NA vand-dypning mål) blev målt til 405 nm og 473 nm foto-stimulation lasere på indstillingen angivne output. (b) foto-stimulation laser kalibrering. Raster fange billeder viser den rumlige forhold mellem tilsigtede foto-stimulation stedet og den tilsvarende placering hvor foto-stimulation opstod (burn-hul) før (venstre) og efter (højre) kører kalibrering i MarkPoints. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58873/58873fig1large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58873/58873fig2.jpg"> Figur 2: PA-Nic lokal applikation. (en) påvisning af PA-Nic fra en lokal applikation pipette. 1 mM PA-Nic, fotolyse biprodukt eller nikotin blev opløst i ACSF, indlæses i en lokal applikation pipette og udleveres på hjernevæv under 2PLSM (900 nm excitation) imaging ved hjælp af de samme indstillinger for hvert stof. Laser scanning Dodt kontrast transmission billede viser væv/pipette mens en GaAsP katode ydelse blev brugt til at fange fluorescens emission. (b) PA-Nic (1 mM) var perfunderet i hjernevæv og afbildet via 2PLSM som (en) til at vise den lateral spredning af PA-Nic ved hjælp af dens iboende fluorescens. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58873/58873fig2large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58873/58873fig3.jpg"> Figur 3: erhvervelse af 2-foton laser scanning mikroskopi billeder. (en) Optimal 2PLSM Z-stakke. To eksempler på 2PLSM Z-stakken maksimal intensitet fremskrivninger er vist for MHb neuroner med godt løst dendritter og lidt at ingen interfererende debris. (b) sub-optimale 2PLSM Z-stakke. To eksempler på 2PLSM Z-stakken maksimal intensitet fremskrivninger er vist for MHb neuroner omgivet af vragrester (farvestof bortvist fra pipetten under celle tilgang). Sådanne billeder er mere vanskeligt at fortolke end billeder som dem, der vises i (et). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58873/58873fig3large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58873/58873fig4.jpg"> Figur 4: Laser flash fotolyse af PA-Nic. (en) MarkPoints reference billeder og indadgående strøm fremkaldt af PA-Nic fotolyse. For en MHb neuron, er rå reference billeder vist for MarkPoints foto-stimulation forsøg på en enkelt (angivet) cellular placering. Bemærk, at for nogle foto-stimulation placeringer (det yderste højre billede i denne serie), dendritiske struktur er i fokus, men soma og proksimale dendrit er ikke. Under hver reference billede, er nikotin uncaging-fremkaldte indadgående strøm afbildet. (b) mellem stimulus intervaller for PA-Nic fotolyse. Exemplar optagelser er vist for MHb neuroner hvor nikotin blev gentagne gange uncaged på det samme perisomatic sted med Inter stimulus interval af 1 s eller 10 s. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58873/58873fig4large.jpg" target="_blank">venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Probing Nicotinic Acetylcholine Receptor Function in Mouse Brain Slices via Laser Flash Photolysis of Photoactivatable Nicotine at JoVE.com

Probing Nicotinic Acetylcholine Receptor Function in Mouse Brain Slices via Laser Flash Photolysis of Photoactivatable Nicotine

Denne artikel præsenterer en metode til at studere nicotinsyre acetylcholin receptorer (nAChRs) i mus hjernen skiver af nikotin uncaging. Når kombineret med samtidige patch klemme optagelse og 2-foton laser scanning mikroskopi, forbinder nikotin uncaging nicotinsyre receptoren funktion med cellulære morfologi, giver en dybere forståelse af kolinerge neurobiologi.

Sondering nicotinsyre acetylcholin Receptor funktion i mus hjernen skiver via Laser Flash fotolyse Photoactivatable nikotin

Acetylcholine (ACh) acts through receptors to modulate a variety of neuronal processes, but it has been challenging to link ACh receptor function with ...

Denne teknik udnytter multi-foton laser-scanning mikroskopi i forbindelse med laser-flash fotolyse af en fotoaktivatable nikotin molekyle. Tillader præcis aktivering af nicotinic kolinerge receptorer. Denne teknik giver mulighed for fine spatiotemporal kontrol over nikotin receptor agonist ansøgning, giver et kraftfuldt værktøj til undersøgelse af receptor funktionelle udtryksmønstre og kolinerge synaptiske eller volumen transmission.Før du begynder proceduren, skal du bruge en programmerbar pipette puller til at trække et glas mikropipette med en 20-til 40-mikrometer åbning diameter. Der stammes ca. en milliliter optagelsesopløsning gennem et 0,22 mikron filter. Og resuspend nok frysetørret fotoaktive nikotin i den filtrerede optagelse løsning til at give en to-millimolar endelig koncentration.Opfyld den trak lokale ansøgning mikropipette med 50 mikroliter af det fotoaktiverede stof, og fastgør pipetten i en pipetteholder monteret på en mikromanipulator. Rørholderen tilsluttes via en passende slangelængde med et trykudslyngningssystem, der kan anvendes vedvarende lavt tryk. Og brug mikromanipulatoren til at manøvrere den lokale applikationspipette ind i den ekstracellulære optagelsesløsning.Placer pipettespidsen lidt over en musehjernevævsprøve, ca. 50 mikrometer fra den celle, der er af interesse. Og kort anvende en til to pounds per kvadrattomme af tryk på pipetten. Der bør være minimal til ingen forskydning af cellen af interesse.Efter at have opnået en stabil helcellestatchklemme, tændes den lave påføringsanordning på trykudslyngningsanordningen, og vævet omkring cellen mættes med fotoaktive nikotin i et til to minutter. Lokal anvendelse introducerer eksperimentet yderligere kompleksitet. Men det skåner sammensatte og tillader højere koncentrationer af PA-Nic, der skal udnyttes.For bad anvendelse af fotoaktive nikotin, først opløse nok af det frysetørrede stof i et volumen af optagelse løsning egnet til kontinuerlig recirkulation til en 100-mikromolar endelige koncentration. Og indlæse den resulterende blanding i en perfusion system. Derefter begynde recirkulation af den fotoaktiverede nikotin opløsning på en 1,5-til 2-millimeter-per-minut sats, ved hjælp af slanger med en minimal indre diameter og samlet længde for at minimere den krævede recirkulation volumen.Under recirkulation, løbende boble opløsningen med carbogen, og opretholde badet temperatur ved 32 grader Celsius under svagt lys. Bad ansøgning nyder godt af enkelhed og ensartethed PA-Nic permeation af vævet. Men det nødvendigvis udnytter lavere mikromolar PA-Nic koncentrationer, og bruger højere samlede mængder af sammensatte.Til live visualisering af en mediale habenula neuron, skal du bruge transmitteret lys eller infrarød differentialinterferens kontrastoptik og et videokamera til at etablere en stabil, helcellesrettet klemmeoptagelse. Når du har etableret den celleopsluttede konfiguration med høj modstand, men før indbruddet, skal du skifte opsætningen og softwaren til laserscanningstilstand. Efter indbrud, bruge laserscanning for at kontrollere, at billeddannelse farvestof af interesse passivt fylder neuron ved diffusion.Lad farvestoffet fylde cellerummene i mindst 20 til 30 minutter, før du bruger den levende scanningsfunktion til at visualisere det neuron- og subcellulære rum af interesse. Vælg billeddannelsesparametre, der giver mulighed for en nøjagtig direkte visualisering af de neuronale funktioner, der manipulerer de relevante indstillinger for at påvirke eller ændre visningsvisualiseringen, opløsningen, signal-støj-forholdet og billedrammens anskaffelsestid efter behov. Hvis du vil forbedre signalkontrasten, skal du åbne opslagstabelvinduet og justere indstillingerne for opslagsbordsgulv og loft.Hvis du vil finde et område af interesse i vævet, skal du vælge 1X optisk zoom og bruge panoreringsknapperne. Brug værktøjet Z-serien til at vælge en start- og stopposition, der indeholder den interessecelle. Angiv en trinstørrelse på et mikrometer, og vælg en billedstørrelse, der giver et billede med den højeste opløsning.Ofte 1, 024 med 1, 024 pixels per linje. Så fortløbende billede neuron i hver Z-plan, der indeholder cellen. For at kalibrere laserstimuleringen skal du starte systemscanningen med en billedmaskede lasereffekt, der er større end minimum, og finjustere det objektive fokus på det tynde røde markørfluorescenslag.Vælg et område i fluorescensfeltet uden snavs og jævnt belagt med markør, og åbn menuen værktøjer, kalibrering og justering for at vælge den uncaging galvokalibreringsfunktion. Følg brænde pletter tutorial for den rumlige kalibrering af den anden galvanometer spejl par, vælge 405-nanometer laser, en laser stimulation magt 400, og en stimulation varighed på 20 millisekunder. For at give en-til fem-mikrometer diameter huller i den røde markør.Vælg opdatering for at stimulere og opdatere billedet, når centerpunktet brænder, og flyt den runde røde indikator til den faktiske placering af center-, højre-center- og lavere centerpletter for at få et gitter med ni pletter. For at teste kalibreringen skal du åbne vinduet med markeringspunkter og manuelt aktivere stimuleringsparametrene for de definerede pletter i et nyt område af prøven, idet der skal være den korrekte nyeste kalibreringsfil indlæst i vinduet med markeringspunkter. Anvend derefter en testpuls for at kontrollere den korrekte kalibrering.Hvis du vil kort afbilde og finde det undercellulære område af interesse, skal du vælge live scanning og bruge øge den optiske zoom til at visualisere eventuelle små strukturer efter behov. Anbring markpunktets enkeltpunktskorshår umiddelbart ved siden af cellemembranen, og indstil parametrene for fototimering til en varighed på et til 50 millisekund, en laserkraft på en til fire milliwatt og mindst ét forsøg. Vælg derefter kørselsmærkepunkter for at starte markpoint-protokollen, og overhold indsamlingen af elektrofysiologidata i realtid.Fotoaktive nikotin 2PE fluorescens af en millimolar PA-Nic er let detekteres under trykudslyngning fra en lokal applikationpipette som påvist. Der henviser til, at leveringen af de vigtigste fotokemiske produkter af den fotoaktive nikotin fotolyse reaktion generere noget fluorescerende signal på samme koncentration og excitation magt og bølgelængde. Demonstration af specificiteten af de fotoaktiverede nikotinresultater.Billeddannelse af fotoaktive nikotin anvendes på hjernevæv som påvist afslører tilstedeværelsen af lægemidlet inden for 100 til 200 mikrometer af den lokale ansøgning pipette. Bekræfter, at fotoaktive nikotin effektivt kan leveres til hjernevævet via lokal anvendelse. Her, billeder af høj kvalitet, hvor neuronal morfologi synes at være komplet, støjen er minimeret, og snavs ikke forstyrrer fortolkningen af den cellulære morfologi, er vist.Disse billeder er dog af lavere kvalitet. På grund af et lavere signal-til-baggrund-forhold og betydelig snavs. Parring to-foton laser scanning mikroskopi af mediale habenula neuroner i hjernen skiver med laser flash fotolyse af PA-Nic som påvist, giver mulighed for forsoning af elektrofysiologiske reaktioner med cellulære morfologi.Enkelt-spot fotolyse udført med 10-sekunders intervaller giver en tilstrækkelig restitutionstid for baseline holdestrøm. Mens et kortere interval på et sekund fører til en gradvis stigning i bedriften strøm som protokollen skrider frem. Tyder på, at nikotin ikke har tid nok til at sprede væk fra systemet med de kortere intervaller.Ved udformningen af eksperimenter, der udnytter fotoaktiverede molekyler, er det vigtigt at huske at vælge fluorescerende indikatorer og rapportere fluorophores med kompatible excitation emission spectra. PA-Nic er kompatibel med de mest almindelige fluorophores på grund af sin korte bølgelængde fotolyse peak. Når du vælger den mest hensigtsmæssige PA-Nic ansøgning teknik, er det vigtigt nøje at overveje den funktionelle udtryk, fysiologiske aktivitet af nikotin receptorer i neuroner af interesse.Kvalificeret udnyttelse af denne teknik giver mulighed for fine spatiotemporal kontrol af nikotin ansøgning, som giver spændende nye muligheder for at studere kinetik af indfødte nicotinic receptor engagement, subcellulær lokalisering, og graduering af neuronal aktivitet ved nikotin receptor aktivering.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Flash Photolysis of Caged Compounds in the Cilia of Olfactory Sensory  Neurons

Flash fotolyse af Caged forbindelser i Cilia af olfaktoriske sensoriske neuroner

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. ...

Spectral Confocal Imaging of Fluorescently tagged Nicotinic Receptors in Knock-in Mice with Chronic Nicotine Administration

Spektral konfokal afbildning af Fluorescerende mærkede nikotinreceptorer i Knock-i mus med kronisk Nikotin Administration

Ligand-gated ion channels in the central nervous system (CNS) are implicated in numerous conditions with serious medical and social consequences.  For ...

Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

Imaging Calcium respons i GFP-mærkede neuroner i hypothalamus musehjerne Slices

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the ...

Local Application of Drugs to Study Nicotinic Acetylcholine Receptor Function in Mouse Brain Slices

Tobacco use leads to numerous health problems, including cancer, heart disease, emphysema, and stroke. Addiction to cigarette smoking is a prevalent ...

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

In vivo Fødselsdepression Elektroporation og Time-lapse Imaging af neuroblast Migration i Mouse Akut hjerneskiver

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to ...

Laser-guided Neuronal Tracing In Brain Explants

Laserstyrede Neuronal Tracing i Brain Eksplantater

We present a technique which combines an in vitro tracer injection protocol, which uses a series of electrical and pressure pulses to increase dye uptake ...

Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique

Imaging Serotonerge Fibers i Mouse Spinal Cord Brug af CLARITY / CUBIC Teknik

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal ...

Studying Brain Function in Children Using Magnetoencephalography

At studere hjernefunktion i børn, der bruger Magnetoencephalography

Magnetoencephalography (MEG) is a non-invasive neuroimaging technique which directly measures magnetic fields produced by the electrical activity of the ...

Chronic Implantation of Whole-cortical Electrocorticographic Array in the Common Marmoset

Kronisk Implantation af hele-kortikale Electrocorticographic Array i den fælles silkeabe

Electrocorticography (ECoG) allows the monitoring of electrical field potentials from the cerebral cortex with high spatiotemporal resolution. Recent ...