Sondering nicotinsyre acetylcholin Receptor funktion i mus hjernen skiver via Laser Flash fotolyse Photoactivatable nikotin

Denne teknik udnytter multi-foton laser-scanning mikroskopi i forbindelse med laser-flash fotolyse af en fotoaktivatable nikotin molekyle. Tillader præcis aktivering af nicotinic kolinerge receptorer. Denne teknik giver mulighed for fine spatiotemporal kontrol over nikotin receptor agonist ansøgning, giver et kraftfuldt værktøj til undersøgelse af receptor funktionelle udtryksmønstre og kolinerge synaptiske eller volumen transmission.

Før du begynder proceduren, skal du bruge en programmerbar pipette puller til at trække et glas mikropipette med en 20-til 40-mikrometer åbning diameter. Der stammes ca. en milliliter optagelsesopløsning gennem et 0,22 mikron filter. Og resuspend nok frysetørret fotoaktive nikotin i den filtrerede optagelse løsning til at give en to-millimolar endelig koncentration.

Opfyld den trak lokale ansøgning mikropipette med 50 mikroliter af det fotoaktiverede stof, og fastgør pipetten i en pipetteholder monteret på en mikromanipulator. Rørholderen tilsluttes via en passende slangelængde med et trykudslyngningssystem, der kan anvendes vedvarende lavt tryk. Og brug mikromanipulatoren til at manøvrere den lokale applikationspipette ind i den ekstracellulære optagelsesløsning.

Placer pipettespidsen lidt over en musehjernevævsprøve, ca. 50 mikrometer fra den celle, der er af interesse. Og kort anvende en til to pounds per kvadrattomme af tryk på pipetten. Der bør være minimal til ingen forskydning af cellen af interesse.

Efter at have opnået en stabil helcellestatchklemme, tændes den lave påføringsanordning på trykudslyngningsanordningen, og vævet omkring cellen mættes med fotoaktive nikotin i et til to minutter. Lokal anvendelse introducerer eksperimentet yderligere kompleksitet. Men det skåner sammensatte og tillader højere koncentrationer af PA-Nic, der skal udnyttes.

For bad anvendelse af fotoaktive nikotin, først opløse nok af det frysetørrede stof i et volumen af optagelse løsning egnet til kontinuerlig recirkulation til en 100-mikromolar endelige koncentration. Og indlæse den resulterende blanding i en perfusion system. Derefter begynde recirkulation af den fotoaktiverede nikotin opløsning på en 1,5-til 2-millimeter-per-minut sats, ved hjælp af slanger med en minimal indre diameter og samlet længde for at minimere den krævede recirkulation volumen.

Under recirkulation, løbende boble opløsningen med carbogen, og opretholde badet temperatur ved 32 grader Celsius under svagt lys. Bad ansøgning nyder godt af enkelhed og ensartethed PA-Nic permeation af vævet. Men det nødvendigvis udnytter lavere mikromolar PA-Nic koncentrationer, og bruger højere samlede mængder af sammensatte.

Til live visualisering af en mediale habenula neuron, skal du bruge transmitteret lys eller infrarød differentialinterferens kontrastoptik og et videokamera til at etablere en stabil, helcellesrettet klemmeoptagelse. Når du har etableret den celleopsluttede konfiguration med høj modstand, men før indbruddet, skal du skifte opsætningen og softwaren til laserscanningstilstand. Efter indbrud, bruge laserscanning for at kontrollere, at billeddannelse farvestof af interesse passivt fylder neuron ved diffusion.

Lad farvestoffet fylde cellerummene i mindst 20 til 30 minutter, før du bruger den levende scanningsfunktion til at visualisere det neuron- og subcellulære rum af interesse. Vælg billeddannelsesparametre, der giver mulighed for en nøjagtig direkte visualisering af de neuronale funktioner, der manipulerer de relevante indstillinger for at påvirke eller ændre visningsvisualiseringen, opløsningen, signal-støj-forholdet og billedrammens anskaffelsestid efter behov. Hvis du vil forbedre signalkontrasten, skal du åbne opslagstabelvinduet og justere indstillingerne for opslagsbordsgulv og loft.

Hvis du vil finde et område af interesse i vævet, skal du vælge 1X optisk zoom og bruge panoreringsknapperne. Brug værktøjet Z-serien til at vælge en start- og stopposition, der indeholder den interessecelle. Angiv en trinstørrelse på et mikrometer, og vælg en billedstørrelse, der giver et billede med den højeste opløsning.

Ofte 1, 024 med 1, 024 pixels per linje. Så fortløbende billede neuron i hver Z-plan, der indeholder cellen. For at kalibrere laserstimuleringen skal du starte systemscanningen med en billedmaskede lasereffekt, der er større end minimum, og finjustere det objektive fokus på det tynde røde markørfluorescenslag.

Vælg et område i fluorescensfeltet uden snavs og jævnt belagt med markør, og åbn menuen værktøjer, kalibrering og justering for at vælge den uncaging galvokalibreringsfunktion. Følg brænde pletter tutorial for den rumlige kalibrering af den anden galvanometer spejl par, vælge 405-nanometer laser, en laser stimulation magt 400, og en stimulation varighed på 20 millisekunder. For at give en-til fem-mikrometer diameter huller i den røde markør.

Vælg opdatering for at stimulere og opdatere billedet, når centerpunktet brænder, og flyt den runde røde indikator til den faktiske placering af center-, højre-center- og lavere centerpletter for at få et gitter med ni pletter. For at teste kalibreringen skal du åbne vinduet med markeringspunkter og manuelt aktivere stimuleringsparametrene for de definerede pletter i et nyt område af prøven, idet der skal være den korrekte nyeste kalibreringsfil indlæst i vinduet med markeringspunkter. Anvend derefter en testpuls for at kontrollere den korrekte kalibrering.

Hvis du vil kort afbilde og finde det undercellulære område af interesse, skal du vælge live scanning og bruge øge den optiske zoom til at visualisere eventuelle små strukturer efter behov. Anbring markpunktets enkeltpunktskorshår umiddelbart ved siden af cellemembranen, og indstil parametrene for fototimering til en varighed på et til 50 millisekund, en laserkraft på en til fire milliwatt og mindst ét forsøg. Vælg derefter kørselsmærkepunkter for at starte markpoint-protokollen, og overhold indsamlingen af elektrofysiologidata i realtid.

Fotoaktive nikotin 2PE fluorescens af en millimolar PA-Nic er let detekteres under trykudslyngning fra en lokal applikationpipette som påvist. Der henviser til, at leveringen af de vigtigste fotokemiske produkter af den fotoaktive nikotin fotolyse reaktion generere noget fluorescerende signal på samme koncentration og excitation magt og bølgelængde. Demonstration af specificiteten af de fotoaktiverede nikotinresultater.

Billeddannelse af fotoaktive nikotin anvendes på hjernevæv som påvist afslører tilstedeværelsen af lægemidlet inden for 100 til 200 mikrometer af den lokale ansøgning pipette. Bekræfter, at fotoaktive nikotin effektivt kan leveres til hjernevævet via lokal anvendelse. Her, billeder af høj kvalitet, hvor neuronal morfologi synes at være komplet, støjen er minimeret, og snavs ikke forstyrrer fortolkningen af den cellulære morfologi, er vist.

Disse billeder er dog af lavere kvalitet. På grund af et lavere signal-til-baggrund-forhold og betydelig snavs. Parring to-foton laser scanning mikroskopi af mediale habenula neuroner i hjernen skiver med laser flash fotolyse af PA-Nic som påvist, giver mulighed for forsoning af elektrofysiologiske reaktioner med cellulære morfologi.

Enkelt-spot fotolyse udført med 10-sekunders intervaller giver en tilstrækkelig restitutionstid for baseline holdestrøm. Mens et kortere interval på et sekund fører til en gradvis stigning i bedriften strøm som protokollen skrider frem. Tyder på, at nikotin ikke har tid nok til at sprede væk fra systemet med de kortere intervaller.

Ved udformningen af eksperimenter, der udnytter fotoaktiverede molekyler, er det vigtigt at huske at vælge fluorescerende indikatorer og rapportere fluorophores med kompatible excitation emission spectra. PA-Nic er kompatibel med de mest almindelige fluorophores på grund af sin korte bølgelængde fotolyse peak. Når du vælger den mest hensigtsmæssige PA-Nic ansøgning teknik, er det vigtigt nøje at overveje den funktionelle udtryk, fysiologiske aktivitet af nikotin receptorer i neuroner af interesse.

Kvalificeret udnyttelse af denne teknik giver mulighed for fine spatiotemporal kontrol af nikotin ansøgning, som giver spændende nye muligheder for at studere kinetik af indfødte nicotinic receptor engagement, subcellulær lokalisering, og graduering af neuronal aktivitet ved nikotin receptor aktivering.