Name: probing nicotinic acetylcholine receptor function in mouse brain slices via laser flash photolysis of photoactivatable nicotine
Uploaded: 2019-01-25T13:00:00
Duration: 10 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Probing Nicotinic Acetylcholine Receptor Function in Mouse Brain Slices via Laser Flash Photolysis of Photoactivatable Nicotine at JoVE.com

De auteurs bedanken laboratorium leden van de volgende noordwesten belangrijkste onderzoekers: Ryan Drenan, D. James Surmeier, Yevgenia Kozorovitskiy en Anis aannemer. Dit werk werd ondersteund door de ons National Institutes of Health (NIH) (subsidies DA035942 en DA040626 naar R.M.D.), de PhRMA Foundation (Genootschap voor M.C.A.) en HHMI.

<ol>
	<li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholinergic+tone+in+ventral+tegmental+area:+Functional+organization+and+behavioral+implications.">Cholinergic tone in ventral tegmental area: Functional organization and behavioral implications.</a> Neurochemistry International. 114, 127-133 (2018).</li><li>Sarter, M., Parikh, V., Howe, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phasic+acetylcholine+release+and+the+volume+transmission+hypothesis:+time+to+move+on.">Phasic acetylcholine release and the volume transmission hypothesis: time to move on.</a> Nature Reviews Neuroscience. 10 (5), 383-390 (2009).</li><li>Coyle, J. T., Price, D. L., DeLong, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's+disease:+a+disorder+of+cortical+cholinergic+innervation.">Alzheimer's disease: a disorder of cortical cholinergic innervation.</a> Science. 219 (4589), 1184-1190 (1983).</li><li>Katz, B., Thesleff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+study+of+the+desensitization+produced+by+acetylcholine+at+the+motor+end-plate.">A study of the desensitization produced by acetylcholine at the motor end-plate.</a> Journal of Physiology. 138 (1), 63-80 (1957).</li><li>Banala, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoactivatable+drugs+for+nicotinic+optopharmacology.">Photoactivatable drugs for nicotinic optopharmacology.</a> Nature Methods. 15 (5), 347-350 (2018).</li><li>Yan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotinic+Cholinergic+Receptors+in+VTA+Glutamate+Neurons+Modulate+Excitatory+Transmission.">Nicotinic Cholinergic Receptors in VTA Glutamate Neurons Modulate Excitatory Transmission.</a> Cell Reports. 23 (8), 2236-2244 (2018).</li><li>Engle, S. E., Shih, P. Y., McIntosh, J. M., Drenan, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#945;4&#945;6&#946;2*+nicotinic+acetylcholine+receptor+activation+on+ventral+tegmental+area+dopamine+neurons+is+sufficient+to+stimulate+a+depolarizing+conductance+and+enhance+surface+AMPA+receptor+function.">&#945;4&#945;6&#946;2* nicotinic acetylcholine receptor activation on ventral tegmental area dopamine neurons is sufficient to stimulate a depolarizing conductance and enhance surface AMPA receptor function.</a> Molecular Pharmacology. 84 (3), 393-406 (2013).</li><li>Engle, S. E., Broderick, H. J., Drenan, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+application+of+drugs+to+study+nicotinic+acetylcholine+receptor+function+in+mouse+brain+slices.">Local application of drugs to study nicotinic acetylcholine receptor function in mouse brain slices.</a> Journal of Visualized Experiments. (68), (2012).</li><li>Ren, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Habenula+&amp;#34;cholinergic&amp;#34;+neurons+co-release+glutamate+and+acetylcholine+and+activate+postsynaptic+neurons+via+distinct+transmission+modes.">Habenula &amp;#34;cholinergic&amp;#34; neurons co-release glutamate and acetylcholine and activate postsynaptic neurons via distinct transmission modes.</a> Neuron. 69 (3), 445-452 (2011).</li><li>Koppensteiner, P., Melani, R., Ninan, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Cooperative+Mechanism+Involving+Ca(2+)-Permeable+AMPA+Receptors+and+Retrograde+Activation+of+GABAB+Receptors+in+Interpeduncular+Nucleus+Plasticity.">A Cooperative Mechanism Involving Ca(2+)-Permeable AMPA Receptors and Retrograde Activation of GABAB Receptors in Interpeduncular Nucleus Plasticity.</a> Cell Reports. 20 (5), 1111-1122 (2017).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+Excitation+via+GABAB+Receptors+in+Habenula+Cholinergic+Neurons+Regulates+Fear+Memory+Expression.">Presynaptic Excitation via GABAB Receptors in Habenula Cholinergic Neurons Regulates Fear Memory Expression.</a> Cell. 166 (3), 716-728 (2016).</li><li>Chen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+Baseline+and+Nicotine-Mediated+Behavioral+and+Cholinergic+Profiles+in+ChAT-Cre+Mouse+Lines.">Altered Baseline and Nicotine-Mediated Behavioral and Cholinergic Profiles in ChAT-Cre Mouse Lines.</a> The Journal of Neuroscience. 38 (9), 2177-2188 (2018).</li><li>Nagy, P. M., Aubert, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+the+vesicular+acetylcholine+transporter+increased+acetylcholine+release+in+the+hippocampus.">Overexpression of the vesicular acetylcholine transporter increased acetylcholine release in the hippocampus.</a> Neuroscience. 218, 1-11 (2012).</li><li>Ting, J. T., Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombineering+strategies+for+developing+next+generation+BAC+transgenic+tools+for+optogenetics+and+beyond.">Recombineering strategies for developing next generation BAC transgenic tools for optogenetics and beyond.</a> Frontiers in Behavioral Neuroscience. 8, 111 (2014).</li><li>Crittenden, J. R., Lacey, C. J., Lee, T., Bowden, H. A., Graybiel, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severe+drug-induced+repetitive+behaviors+and+striatal+overexpression+of+VAChT+in+ChAT-ChR2-EYFP+BAC+transgenic+mice.">Severe drug-induced repetitive behaviors and striatal overexpression of VAChT in ChAT-ChR2-EYFP BAC transgenic mice.</a> Frontiers in Neural Circuits. 8, 57 (2014).</li><li>Kolisnyk, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChAT-ChR2-EYFP+mice+have+enhanced+motor+endurance+but+show+deficits+in+attention+and+several+additional+cognitive+domains.">ChAT-ChR2-EYFP mice have enhanced motor endurance but show deficits in attention and several additional cognitive domains.</a> The Journal of Neuroscience. 33 (25), 10427-10438 (2013).</li><li>Nagy, P. M., Aubert, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+the+vesicular+acetylcholine+transporter+enhances+dendritic+complexity+of+adult-born+hippocampal+neurons+and+improves+acquisition+of+spatial+memory+during+aging.">Overexpression of the vesicular acetylcholine transporter enhances dendritic complexity of adult-born hippocampal neurons and improves acquisition of spatial memory during aging.</a> Neurobiology of Aging. 36 (5), 1881-1889 (2015).</li><li>Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+scanning+photochemical+microscopy:+mapping+ligand-gated+ion+channel+distributions.">Two-photon scanning photochemical microscopy: mapping ligand-gated ion channel distributions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (14), 6629-6633 (1994).</li><li>Khiroug, L., Giniatullin, R., Klein, R. C., Fayuk, D., Yakel, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+mapping+and+Ca2++regulation+of+nicotinic+acetylcholine+receptor+channels+in+rat+hippocampal+CA1+neurons.">Functional mapping and Ca2+ regulation of nicotinic acetylcholine receptor channels in rat hippocampal CA1 neurons.</a> The Journal of Neuroscience. 23 (27), 9024-9031 (2003).</li><li>Filevich, O., Salierno, M., Etchenique, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+caged+nicotine+with+nanosecond+range+kinetics+and+visible+light+sensitivity.">A caged nicotine with nanosecond range kinetics and visible light sensitivity.</a> Journal of Inorganic Biochemistry. 104 (12), 1248-1251 (2010).</li><li>Tochitsky, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optochemical+control+of+genetically+engineered+neuronal+nicotinic+acetylcholine+receptors.">Optochemical control of genetically engineered neuronal nicotinic acetylcholine receptors.</a> Nature Chemistry. 4 (2), 105-111 (2012).</li><li>Wokosin, D. L., Squirrell, J. M., Eliceiri, K. W., White, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+workstation+with+concurrent,+independent+multiphoton+imaging+and+experimental+laser+microbeam+capabilities.">Optical workstation with concurrent, independent multiphoton imaging and experimental laser microbeam capabilities.</a> Review of Scientific Instruments. 74 (1), 193-201 (2003).</li><li>Plotkin, J. L., Day, M., Surmeier, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptically+driven+state+transitions+in+distal+dendrites+of+striatal+spiny+neurons.">Synaptically driven state transitions in distal dendrites of striatal spiny neurons.</a> Nature Neuroscience. 14 (7), 881-888 (2011).</li><li>Galtieri, D. J., Estep, C. M., Wokosin, D. L., Traynelis, S., Surmeier, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pedunculopontine+glutamatergic+neurons+control+spike+patterning+in+substantia+nigra+dopaminergic+neurons.">Pedunculopontine glutamatergic neurons control spike patterning in substantia nigra dopaminergic neurons.</a> Elife. 6, (2017).</li><li>Yasuda, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+calcium+concentration+dynamics+in+small+neuronal+compartments.">Imaging calcium concentration dynamics in small neuronal compartments.</a> Science STKE. (219), pl5 (2004).</li><li>Inoue, S., Spring, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Video microscopy: The fundamentals. , 163-186 (1997).</li><li>Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonlinear+magic:+multiphoton+microscopy+in+the+biosciences.">Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences.</a> Nature Biotechnology. 21 (11), 1369-1377 (2003).</li><li>Maravall, M., Mainen, Z. F., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimating+intracellular+calcium+concentrations+and+buffering+without+wavelength+ratioing.">Estimating intracellular calcium concentrations and buffering without wavelength ratioing.</a> Biophysical Journal. 78 (5), 2655-2667 (2000).</li><li>Wathey, J. C., Nass, M. M., Lester, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Numerical+reconstruction+of+the+quantal+event+at+nicotinic+synapses.">Numerical reconstruction of the quantal event at nicotinic synapses.</a> Biophysical Journal. 27 (1), 145-164 (1979).</li><li>Shih, P. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+and+function+of+nicotinic+acetylcholine+receptors+in+subdivisions+of+medial+habenula.">Differential expression and function of nicotinic acetylcholine receptors in subdivisions of medial habenula.</a> The Journal of Neuroscience. 34 (29), 9789-9802 (2014).</li><li>Verhoog, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Layer-specific+cholinergic+control+of+human+and+mouse+cortical+synaptic+plasticity.">Layer-specific cholinergic control of human and mouse cortical synaptic plasticity.</a> Nature Communications. 7, 12826 (2016).</li><li>Koukouli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotine+reverses+hypofrontality+in+animal+models+of+addiction+and+schizophrenia.">Nicotine reverses hypofrontality in animal models of addiction and schizophrenia.</a> Nature Medicine. 23 (3), 347-354 (2017).</li><li>Xiao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+nicotine+selectively+enhances+&#945;4&#946;2*+nicotinic+acetylcholine+receptors+in+the+nigrostriatal+dopamine+pathway.">Chronic nicotine selectively enhances &#945;4&#946;2* nicotinic acetylcholine receptors in the nigrostriatal dopamine pathway.</a> The Journal of Neuroscience. 29 (40), 12428-12439 (2009).</li><li>Peng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Editing+Vectors+for+Studying+Nicotinic+Acetylcholine+Receptors+in+Cholinergic+Transmission.">Gene Editing Vectors for Studying Nicotinic Acetylcholine Receptors in Cholinergic Transmission.</a> European Journal of Neuroscience. , (2018).</li></ol>

D.L.W. dient als een betaalde consultant voor Bruker Nano fluorescentie microscopie.

De keuze van PA-Nic toepassing/leveringsmethode is de meest kritische stap in deze techniek gelokaliseerde foto-stimulatie. De twee methoden, de toepassing van het bad en de lokale perfusie, biedt elk verschillende voordelen en beperkingen. De keuze wordt grotendeels beïnvloed door de nAChR functionele expressie niveau in het celtype van belang. Het is handiger bad om toepassing te gebruiken als functionele expressie niveaus hoog, zijn omdat Bad toepassing voor een uniforme sonde concentratie rond de opgenomen cel zorgt, data interpretatie te vergemakkelijken. Bad toepassing elimineert ook de behoefte aan een tweede perfusie pipet in het weefsel, waardoor het hele proces makkelijker. Bad toepassing van dure verbindingen echter kosten meer per experiment.
Algemeen, gaat probleemoplossing proberen te begrijpen waarom geen nAChR activering gezien volgende flash fotolyse is. Wanneer u werkt met een celtype die niet eerder met PA-Nic onderzocht is, lokale bladerdeeg-toepassing van ACh moet worden uitgevoerd door de onderzoeker of nicotine vaststellen of voldoende receptoren functioneel zijn uitgedrukte5. Om te controleren dat het systeem geschikt is voor het opsporen van fotolyse reacties, moet controle experimenten in mediale habenula neuronen die uitdrukking geven aan grote hoeveelheden receptor30gebeuren. Op dit gebied van de hersenen is PA-Nic Bad toepassing mogelijk, dat is beter voor validatie experimenten. Alleen na het uitvoeren van deze experimenten validatie moet men overgaan tot een ongedwongen celtype. Als de experimenteel systeem is gevalideerd en reacties erg klein of niet detecteerbaar blijven, het gerechtvaardigd kan zijn om te verhogen de concentratie van PA-Nic, verhogen van de intensiteit van de flits of de impulstijd, het toevoegen van een positieve allosteric modulator nAChR ter verbetering van nAChR activiteit6, of een combinatie van deze.
Af en toe, uncaging reacties zijn te groot, met aanzienlijke nAChR activering resulterend in indirecte spanning gated nb+ channel activering en unclamped naar binnen stromen toe te schrijven aan slechte ruimte klem. Deze artefacten, die volledig duistere nAChR naar binnen stromen en data interpretatie onmogelijk maken, kunnen door opname van QX-314 (2 mM) in de pipet opname worden geëlimineerd. Ze kunnen ook worden geëlimineerd door vermindering van de concentratie van PA-Nic of door het verminderen van de intensiteit van de flits of de impulstijd. In alle zichtbaar licht foto-stimulatie experimenten, moet voorzichtigheid worden betracht bij de keuze van de stimulatie sites om te voorkomen dat onbedoelde stimulatie/fotolyse boven of onder het gewenste brandvlak. Daarnaast en wanneer van toepassing, de kracht van de laser moet altijd worden getitreerd om te reproduceren van fysiologische reacties. Het is vooral belangrijk om te beseffen van de z-as photostimulation bij het werken met gekooide liganden, zoals liganden die zijn geactiveerd boven/onder de focale plek kunnen nog diffuus en interactie met het biologische systeem (dwz, -receptoren) bestudeerd.
PA-Nic laser flash fotolyse wellicht niet geschikt voor alle onderzoekers, zoals verschillende beperkingen bestaan. De eerste is de relatief hoge kosten van een geschikt set-up. Bij het werken met intact hersenen segmenten, uncaging in de buurt van kleine diameter structuren zoals dendrites vereist een geavanceerde visualisatie systeem zoals een 2-foton microscoop. Afgezien van de hoge kosten van een Ti:sapphire, afstembare IR gepulste laser voor presterende 2-foton microscopie, verhoogt een dual-galvanometer systeem dat kan zelfstandig verder positionering twee laserstralen de kosten van het systeem. Totale systeemkosten kunnen worden verlaagd met behulp van een huis-gebouwde systeem als de onderzoeker beschikt over voldoende deskundigheid en tijd om te bouwen, oplossen en onderhouden van een dergelijk systeem. Een tweede beperking vaak gaat om lage nAChR functionele expressie, die kan gedeeltelijk worden opgevangen door maatregelen te nemen zoals hierboven vermeld, maar dit kan geen garantie voor succes. Meestal, als een ligand-geactiveerde stromingen na bladerdeeg-toepassing van agonisten niet kunt meten, PA-Nic flash fotolyse onder spanning klem kan geen aanvaardbare resultaten opleveren. Een derde beperking betreft de intrinsieke fluorescentie van PA-Nic. PA-Nic ~ 405 nm licht absorbeert en stoot in een vergelijkbaar bereik als de groen fluorescente proteïne (GFP) of Alexa 4885. Als PA-Nic concentraties ~ 1 mM overschrijden, kan deze eigenschap fluorescentie maken het uitdagend om te visualiseren gelijktijdig neuronale structuren. Om te verhelpen dit, is het van cruciaal belang om gemakkelijk de transportbesturing van PA-netwerkkaart uit de perfusie-pipet te kunnen. Van tijd tot tijd werd de PA-Nic stroom gestopt zodat fluorescerende moleculen te verspreiden weg. Dit toegestaan opnieuw beeldvorming van het neuron voor het controleren van de contante positie van de uncaging lichtbundel. Een vierde mogelijke beperking wil impliceert het gebruik van 405 nm licht voor fotolyse. Kortere golflengten zoals 405 nm zijn meer vatbaar voor verstrooiing in complexe weefsel zoals een segment van de hersenen. Dus, op een bepaalde flash intensiteit en duur, uncaging reactie amplitudes en verval kinetiek kunnen worden differentieel beïnvloed door de diepte van de focus van de uncaging binnen het segment. Conclusies over de biologische aspecten van nAChRs moeten rekening houden met dit belangrijke voorbehoud.
Deze gelokaliseerde laser flash fotolyse techniek is onlangs gebruikt om te ontdekken van nieuwe details over nAChR neurobiologie. Bijvoorbeeld verbetert chronische nicotine blootstelling perisomatic en dendritische nAChR functie in mediale habenula neuronen5. Het werd ook gebruikt om te helpen tonen, voor de eerste keer, dat ventrale tegmental gebied glutamaat neuronen express functionele nAChRs in hun perisomatic en dendritische cellulaire compartimenten6. Er zijn dat veel potentiële toekomstige gebruik van deze techniek, en de aanpak kan worden toegepast op andere belangrijke neuron typen waarvan bekend is dat uitdrukkelijke nAChRs, zoals corticale piramidale neuronen31 of interneuronen in de hersenschors32, striatum33 , en hippocampus19. Deze techniek kan ook worden gecombineerd met farmacologie en/of nAChR gen bewerken34 om te lokaliseren specifieke receptor subtypes aan verschillende neuronale compartimenten. De aanpak kan gemakkelijk aangepast worden aan andere cumarine-caged verbindingen, met inbegrip van maar niet beperkt tot, parallel met PA-Nic5ontwikkeld. Ten slotte, PA-Nic flash fotolyse kan een dag worden gebruikt in een dier wakker/gedragen om nicotine van actie in de roman gedrags farmacologie paradigma's te bestuderen.

Cholinerge signalering moduleert talrijke processen van de hersenen, waaronder attentional controle, bewuste beweging en beloning1,2. Geneesmiddelen die verbeteren van acetylcholine (ACh) transmissie worden gebruikt voor de behandeling van cognitieve stoornissen geassocieerd met de ziekte van Alzheimer, impliceert een belangrijke rol voor de cholinerge systemen in cognitie3. Een beter begrip van cholinerge receptoren en circuits in gezonde en zieke Staten kan leiden tot betere therapeutische benaderingen voor verschillende neurologische ziekten/aandoeningen.
Nicotinerge ACh-receptoren (nAChRs) zijn een familie van ligand-gated ionenkanalen die flux caties in reactie op ACh endogene of exogene nicotine van tabaksproducten. Gezien het feit dat ze behoorden tot de allereerste receptoren van de neurotransmitter beschreven4, is nAChR farmacologie en locatie in spiervezels goed begrepen voor spier-achtige receptoren. Daarentegen, is relatief weinig bekend over de farmacologie en subcellular distributie van inheemse nAChRs in de hersenen. Deze lacunes in de kennis werd onlangs behandeld door het ontwikkelen van een nieuwe chemische sonde die voorziet in ruimtelijk beperkte en snelle activering van nAChRs in hersenweefsel tijdens cellulaire beeldvorming en elektrofysiologische opname5. Hier worden de belangrijkste methodologische stappen betrokken bij deze aanpak beschreven, met het algemene doel van verbetering van de mogelijkheid om nAChR functie verbinding met neuronale structuur.
Photoactivatable nicotine (PA-Nic; chemische naam: 1-[7-[bis(carboxymethyl)-amino] cumarine-4-yl] methyl-nicotine) kunnen photolyzed met ~ 405 nm laser knippert om efficiënt release nicotine5,6. Voorafgaand aan uncaging, PA-Nic is stabiel in de oplossing en vertoont geen ongewenst farmacologische of fotochemische functies5. Na fotolyse, vrijgegeven nicotine voorspelbaar activeert nAChRs en de uncaging bijproducten zijn farmacologisch inert5. Een continuous-wave laser wordt gebruikt als de fotolyse lichtbron met een uitgangsvermogen > 1 mW gemeten bij het monster. Wanneer gelokaliseerd, gerichte foto-stimulatie wordt gecombineerd met de mogelijkheid om te zoeken van cellulaire membranen met 2-foton laser scanning microscopie (2PLSM), en de twee belangrijkste voordelen van deze benadering volledig worden gerealiseerd: fotolyse snelheid en ruimtelijke precisie.
In de meeste opzichten is fotolyse van PA-Nic superieur aan andere methoden van het leveren van nAChR liganden aan receptoren in de hersenen segmenten. Dergelijke benaderingen omvatten Bad toepassing7 en lokale drug levering via een puffer Pipetteer8. Overwegende dat de voormalige aanpak heeft de neiging om te benadrukken over de langetermijneffecten van de toegepaste drug, kan de laatste benadering last van variabiliteit in reactie-kinetiek tussen proeven en over cellen. Geen van deze alternatieve benaderingen kan adequaat receptor activiteiten in verschillende cellulaire locaties uit de dezelfde neuron onderscheiden. Optogenetically-geactiveerde versie van ACh is gebruikt voor onderzoek van inheemse nAChRs9,10,11, maar het is niet bewezen nuttig voor toewijzing subcellular nAChR locaties. Bovendien, de meeste studies met behulp van deze aanpak hebben vertrouwd op een ChR2-uiten bacteriële kunstmatig chromosoom transgene muis met abnormale cholinerge transmissie12,13,14, 15 , 16 , 17.
PA-Nic fotolyse is niet de alleen optische aanpak voor het bestuderen van cholinerge receptoren. Een gekooide carbachol werd gebruikt om functioneel kaart ACh receptor activiteiten in gekweekte cellen18 en hersenen segmenten19, maar was niet commercieel beschikbaar voor vergelijkende studies tijdens de ontwikkeling van PA-Nic. Een ruthenium-bis (bipyridine)-nicotine complexe (RuBi-nicotine) werd gemeld dat voor nicotine uncaging20, maar commerciële preparaten van RuBi-nicotine bewezen inferieur aan PA-Nic in een head-to-head vergelijking studeren5. Het wellicht nuttig om te herhalen van dergelijke vergelijkende experimenten met niet-commerciële, sterk gezuiverd RuBi-nicotine, zoals haar zichtbaar absorptie PA-Nic's functies voor cholinerge studies kan complimenteren. Tot slot, nAChRs zijn ook optisch gemanipuleerd met behulp van een combinatie van foto-schakelbare liganden en genetisch gemodificeerde receptoren21. Deze aanpak vormt een aanvulling op de PA-Nic fotolyse in hersenweefsel, met de mogelijkheid/eis van genetische doelgerichtheid van de gewijzigde nAChR gezien als zowel een voordeel als een nadeel.
Verschillende belangrijke vereisten van deze aanpak moeten worden opgemerkt. Eerst, is een passende visualisatie methode nodig om nauwkeurig het vinden van de neuronale membraan. Beeldbewerking met conventionele epi-fluorescentie microscopie kan het volstaan bij de studie van gekweekte cellen, maar voor het opnemen van neuronen in de hersenen segmenten of andere preparaten dik weefsel, 2PLSM of confocale microscopie is een vereiste. Ten tweede, een geschikte methode is nodig om de positie van de laserstraal fotolyse. Deze aanpak maakt gebruik van een dual-galvanometer scan hoofd met twee onafhankelijke x-y spiegels voor het scannen van het raster van de beeldvorming en punt photoactivation met behulp van de uncaging laser beam22,23,24. Andere, meer beperkte oplossingen zijn mogelijk, zoals (1) een honkslag-galvanometer scan hoofd dat als alternatief raster scant de imaging lichtbundel en de uncaging-straal of (2) gewoon regisseren de uncaging balk naar het midden van het gezichtsveld, zodanig dat de cel wordt gebracht Dit standpunt voor flash fotolyse. Ten derde, een systeem is vereist voor gelijktijdige elektrofysiologische opnemen als men wil verzamelen van fysiologische signalen tijdens experimenten. De bovengenoemde eisen kunnen worden voldaan met een geschikt geheel optische beeldvormende techniek, als recent beschreven5. Hieronder een gedetailleerd protocol is opgenomen dat beschrijft de belangrijkste stappen van deze aanpak.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Instruments, Consumables, and Miscellaneous Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiclamp 700B</td>
			<td>Molecular Devices Corp.</td>
			<td></td>
			<td>Patch clamp amplifier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pneumatic Picopump</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>PV820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instrument Co</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature Controller</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>TC-324C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibrating blade microtome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>VT1200S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrafree-MC Centrifugal Filter</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>UFC30GV0S</td>
			<td>internal solution filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass Capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B150F-4</td>
			<td>patch and local application pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(-)-Nicotine hydrogen tartrate salt</td>
			<td>Glentham</td>
			<td>GL9693</td>
			<td>nicotine salt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7-carboxymethylamino-4-methyl coumarin</td>
			<td>Janelia Research Campus</td>
			<td></td>
			<td>PA-Nic by-product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-[7-[bis(carboxymethyl)- amino]coumarin-4-yl]methyl-nicotine</td>
			<td>Janelia Research Campus</td>
			<td></td>
			<td>PA-Nic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Euthasol (Pentobarbital Sodium and Phenytoin Sodium)</td>
			<td>Virbac</td>
			<td>ANADA #200-071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa FluorTM 488 Hydrazide</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A10436</td>
			<td>green fill dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa FluorTM 568 Hydrazide</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A10437</td>
			<td>red fill dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-carboxy-AF594 (Alexa Fluor 594)</td>
			<td>Janelia Research Campus</td>
			<td></td>
			<td>red fill dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX 314 chloride</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2313</td>
			<td>voltage-gated sodium channel blocker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power Meter&#160;</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>S120C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals for Solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Methyl-D-glucamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic monohydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(+)-Sodium L-ascorbate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiourea</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>230391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>223506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&#8242;,N&#8242;-tetraacetic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8242;-triphosphate magnesium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanosine 5&#8242;-triphosphate sodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Components of 2-Photon Microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Ultima Laser Scanner for Olympus BX51 Microscope</td>
			<td>Bruker Nano, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>imaging software and galvos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160; Imaging X-Y galvanometers</td>
			<td>Cambridge Technology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Mai Tai HP1040</td>
			<td>Spectra-Physics</td>
			<td></td>
			<td>Tuneable IR laser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; &#160;&#160;&#160;&#160;&#160;Pockels cell M350-80-02-BK with M302RM Driver</td>
			<td>Conoptics, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>for IR laser attenuation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Integrating Sphere Photodiode Power Sensor</td>
			<td>Thorlabs, Inc</td>
			<td></td>
			<td>laser power pick-off photodiode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160; Uncaging X-Y galvanometers</td>
			<td>Cambridge Technology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Helios 2-Line Laser Launch</td>
			<td>Bruker Nano, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>uncaging laser components</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; OBIS LX/LS 405 nm (100 mW)</td>
			<td>Coherent, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; OBIS LX/LS 473 nm (75 mW)</td>
			<td>Coherent, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; &#160;Point-Photoactivation / Fiber Input Module for Limo Sidecar - Uncaging</td>
			<td>Bruker Nano, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upright Microscope</td>
			<td>&#160;Olympus</td>
			<td>BX51WIF</td>
			<td>Upright microscope chasis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160; Objective: Olympus M Plan FL 10x; NA 0.3 WD 11 mm</td>
			<td>&#160;Olympus</td>
			<td></td>
			<td>10x objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160; Objective: Olympus M Plan Fluorite 60x/1.0 WD=2mm NIR</td>
			<td>&#160;Olympus</td>
			<td></td>
			<td>60x water-dipping objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160; X-Cite 110, four-LED LLG coupled epi-fluorescence light source</td>
			<td>Excelitas Technologies</td>
			<td></td>
			<td>LED Light Source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Epi-Fluorescence Filter: ET-GFP (FITC/CY2) for Epi-Turret</td>
			<td>Chroma Technologies</td>
			<td></td>
			<td>LED Filter for blue light excitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Epi-Fluorescence Filter: ET-DsRed (TRITC/CY3) for Epi-Turret</td>
			<td>Chroma Technologies</td>
			<td></td>
			<td>LED Filter for green light excitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160; B&#38;W CCD camera; Watec, 0.5in B/W CCD</td>
			<td>Watec Co., LTD.</td>
			<td></td>
			<td>CCD camera for patch clamp recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>External Detectors - Dual Reflected Emission - Olympus Upright (Multi-Alkali, GaAsP)</td>
			<td>Bruker Nano, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160; Multi-alkali side-on PMT</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>R3896</td>
			<td>red channel PMT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 595/50m</td>
			<td>Chroma Technologies</td>
			<td></td>
			<td>red channel emission filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 565lpxr</td>
			<td>Chroma Technologies</td>
			<td></td>
			<td>dichroic beam splitter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160; GaAsP end-on PMT</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>7422PA-40</td>
			<td>green channel PMT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 525/70m</td>
			<td>Chroma Technologies</td>
			<td></td>
			<td>green channel emission filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; High-Speed Shutter for Hamamatsu H7422 PMT</td>
			<td>Vincent Associates / Bruker</td>
			<td>517329</td>
			<td>PMT shutter mount</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dodt Gradient Contrast Transmission Detection Module</td>
			<td>Bruker Nano, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160; Multi-alkali side-on PMT</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>R3896</td>
			<td>Dodt PMT</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

probing nicotinic acetylcholine receptor function in mouse brain slices via laser flash photolysis of photoactivatable nicotine

Acetylcholine (ACh) werkt via receptoren te moduleren van een verscheidenheid van neuronale processen, maar het heeft zijn uitdagend te koppelen ACh receptor functie met subcellular locatie in cellen waar deze functie wordt uitgevoerd. Studeren de subcellular locatie van nicotinerge ACh-receptoren (nAChRs) in native hersenweefsel, werd een optische methode ontwikkeld voor precieze release van nicotine op afzonderlijke locaties in de buurt van neuronale membranen tijdens elektrofysiologische opnames. Patch-geklemd neuronen in de hersenen segmenten zijn gevuld met kleurstof te visualiseren van hun morfologie tijdens 2-foton laser scanning microscopie, en nicotine uncaging wordt uitgevoerd met een lichte flits door zich te richten een 405 nm laserstraal in de buurt van een of meer van de cellulaire membranen. Cellulaire huidige verlegging worden gemeten, en een hoge resolutie driedimensionale (3D) beeld van de opgenomen neuron is getroffen op grond waarvan verzoening van nAChR reacties met cellulaire morfologie. Deze methode zorgt voor een gedetailleerde analyse van de functionele verdeling van de nAChR in complexe weefsel preparaten, belooft om het inzicht van cholinerge transmissie te vergroten.

Voor fotolyse zijn stimulatie, de blootstelling dosis (intensiteit en tijd), blootstelling locatie en straal geometrie belangrijke variabelen. Het systeem zoals beschreven in dit artikel is geschikt voor twee verschillende photostimulation balken, instelbaar via een lens in/out van het photostimulation licht pad verplaatsen voordat de lichtbundel de galvanometer-systeem. Zonder deze lens, de photostimulation-straal vult de ingang leerling van de 60 x / 1.0 nb water-dompelen [60 x WD] doelstelling, productie van een in de buurt van diffractie-beperkte, sub-µm plek op het brandvlak binnen het monster. Dit is gekoppeld aan photostimulation licht met een zandloper vorm, uitbreiding van boven en onder de focale plek symmetrische met de optische as. Met de lens ingevoegd in het pad, photostimulation laserlicht is gericht in de ingang leerling van het objectief en vervolgens wordt afgesloten als een potlood-achtige lichtbundel. Deze balk, die naar verwachting zijn ~ 10 µm in diameter voor een doelstelling van 60 x, breidt uniform/verticaal in het monster. In deze modus zullen de lichtintensiteit op een bepaalde locatie binnen de spot stimulatie ~ 1% van de in de buurt van diffractie-beperkte kleine plek intensiteit. Hogere machten van de laser zijn dus meestal vereist bij het gebruik van ~ 10 µm spot stimulatie. Voor alle experimenten gemeld in dit artikel, werd een zandloper-type photostimulation-balk gebruikt.
De geleverde monster macht kan worden afgeplot tegen de instelling van de ingangsspanning, na het meten van de kracht van de laser op het monster met behulp van een Energiemeter. Deze studies een 60 x WD doelstelling met een afstand van 2 mm gebruiken, maar het is niet ondergedompeld in water voor metingen van de macht om te voorkomen dat potentiële schade aan het element van de detector. Wanneer doelstellingen met genoemde nb > 0.95 worden gemeten in lucht (zonder immersie vloeistof), kan er verlies van de totale interne reflectie op het voorvlak lenselement toe te schrijven aan de lagere index (lucht). In dit geval voor een nauwkeuriger voorbeeld vermogensmeting (om te corrigeren voor de totale interne reflectie verliezen), de gemeten kracht te verhogen door de 1.0 nb objectieve (1.0/0.95)2 gemeten in lucht. Figuur 1a toont een typische plot van het input/output voor 405 nm en 473 nm zichtbare lasers die zijn opgenomen in de laser lanceren systeem in deze studie. Deze lasersystemen zijn ideaal voor foto-stimulatie dosis belichting om de volgende redenen: (1) ze zijn vooraf gekalibreerd om direct lineaire vermogen ten opzichte van de ingangsspanning (0-5 V), (2) ze voorzien van een stille sluiter-operatie (geen laser output), en (3) ze hebben snelle, sub-ms intensiteit hartslagsturing duur (0.1 ms responstijd). Als u ter plaatse foto-stimulatie met een laser/galvo systeem, is routine kalibratie van MarkPoints plekken een belangrijke taak. Figuur 1b (linker paneel) toont een systeem dat uit kalibratie (gewenste punt ter stimulering van de foto niet leidt tot een nauwkeurige stimulatie van dat punt, zoals aangegeven door het branden holes locatie), met een terugkeer naar de nauwkeurige positionering van de vlek na kalibratie ( Figuur 1b, rechter paneel). 
PA-Nic is bescheiden TL (uitstoot piek op ~ 510 nm), exposeren effectieve excitatie tussen 350-450 nm (1-foton excitatie) of 700-900 nm (2-foton excitatie)5. Om te visualiseren PA-Nic tijdens lokale toepassing, PA-Nic (1 mM) werd toegepast in de buurt van hersenweefsel gevolgd door gelijktijdige beeldvorming van de hersenen (1) weefsel optische verdeelde transmissie verband via Dodt contrast en (2) de uitgestoten fluorescentie van excitatie (900 nm) van PA-Nic. PA-Nic 2PE fluorescentie was gemakkelijk aantoonbaar tijdens druk uitwerpen uit een lokale toepassing Pipet (Figuur 2a). Nicotine en een monoalkylcoumarin, 7-carboxymethylamino-4-methyl cumarine, zijn de belangrijkste fotochemische producten van de PA-Nic fotolyse reactie5. Met behulp van hetzelfde imaging instellingen/parameters die werden gebruikt voor PA-Nic imaging, was het weefsel beeld tijdens levering van nicotine (1 mM) of 7-carboxymethylamino-4-methyl cumarine (1 mM). Geen fluorescerende signaal was gevonden (Figuur 2a, middelste en onderste panelen), aan de specificiteit van de PA-Nic resultaten te tonen. Ten slotte, PA-Nic werd toegepast binnen hersenweefsel en PA-Nic fluorescentie emissie was beeld (Figuur 2b). Deze aanpak bevestigt dat PA-Nic aanwezig in 100-200 µm voor de lokale toepassing Pipet is. Samen, bevestigen deze gegevens dat PA-Nic effectief aan hersenen weefsel via lokale applicatie wordt geleverd.
Elektrofysiologie opnames met gelijktijdige 2PLSM voor visualisatie van cellulaire structuren vereist de detective om evenwicht overwegingen voor beide onderdelen van het experiment, en vaak een smalle tijd venster (~ 20 min) is beschikbaar voor geldige de aanwinst van de gegevens van het monster uit een gepatchte cel. Zonder overwegen cellulaire visualisatie, is het raadzaam om te beginnen opnemen zo spoedig mogelijk na inbraak omdat opname van stabiliteit heeft de neiging te dalen met de tijd. Echter wanneer imaging een vereiste is, mogen elektrofysiologische overwegingen voldoende tijd voor verhoging van de concentratie van de fluorescentie in kleine/externe structuren. Dit wordt geïllustreerd door het onderzoek van een concentratie van de kleurstof vullen kromme28, wat soms handig afleiden als een nieuw celtype imaging is. Figuur 3 toont enkele voorbeeld neuronen beeld als Z-stacks via 2PLSM en stortte in een projectie van maximale intensiteit voor presentatiedoeleinden. Figuur 3a toont beelden van hoge kwaliteit waar neuronale morfologie lijkt te zijn voltooid, lawaai tot een minimum beperkt en puin interfereert niet met interpretatie van cellulaire morfologie. Figuur 3b toont beelden van lagere kwaliteit, vanwege een lagere verhouding van signaal-naar-achtergrond en aanzienlijke puin. Dit puin wordt vaak weergegeven als bolvormige zakken van intense fluorescentie, die voortvloeien uit ejectie van imaging kleurstof uit de patch pipet terwijl het naderen van de cel. Met name opname van 100 µM PA-Nic in het bad (bij het uitvoeren van Bad toepassing) heeft de neiging om de verhouding van signaal-naar-achtergrond en leidt tot suboptimale afbeeldingscontrast. Alexa Fluor 568 of 594 is vaak vrij nuttig in lokale toepassing experimenten als een finder kleurstof of als een normaliserend 2PE referentie/normalisatie signaal. Een effectieve golflengte voor twee-foton excitatie van deze kleurstoffen is ~ 780 nm27, waarmee gelijktijdig visualisatie van PA-Nic en identificatie van cellulaire compartimenten. Deze golflengte, echter, is niet volledig voorkomen dat twee-foton fotolyse van PA-Nic5. Alexa Fluor 488 is gunstig in PA-Nic Bad-toepassing experimenten; Als enthousiast met een passende golflengte ≥900 nm, worden twee-foton fotolyse van PA-Nic5 vermeden terwijl nog het handhaven van geschikte visualisatie van cellulaire compartimenten.
Figuur 4 ziet u voorbeeldgegevens voor gelokaliseerde PA-Nic laser flash fotolyse bij MHb neuronen in de hersenen segmenten. Figuur 4a (bovenste panelen) toont een voorbeeld van een "" referentiebeeld, die een screen-capture van het laatste beeld van de 2PLSM genomen is voordat het protocol van MarkPoints werd uitgevoerd, bedekt met de foto-stimulatie ter plaatse locatie. Figuur 4a (lager afbeelding panelen) toont een ingezoomde weergave van de foto-stimulatie ter plaatse overlay op de cellulaire morfologie. De bijbehorende tijd-gecorreleerde elektrofysiologische reactie op PA-Nic fotolyse wordt weergegeven in de onderste panelen van figuur 4a. Vorige werk aangetoond dat deze stromingen gevoelig voor nAChR antagonisten5 zijn. Figuur 4b vertegenwoordiger worden gegevens weergegeven uit verschillende cellen waar één plek fotolyse werd uitgevoerd met een tussenpoos van ofwel 1 s of 10 s. overwegende dat een 10 s interval toegestaan voldoende hersteltijd voor de basislijn met huidige, een korter interval voor 1 s geleid tot een geleidelijke verhoging van het huidige protocol van bedrijf overgegaan. De toenemende huidige suggereert dat nicotine niet genoeg tijd hadden om uit de buurt van het systeem met de 1 Hz interval29diffuus. Dergelijke tijdelijke reactie analyses moeten worden uitgevoerd DOVO op elk nieuwe celtype bestudeerd, zoals de neurofarmacologie van nAChRs tussen celtypes verschillen kan.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58873/58873fig1.jpg"> Figuur 1: Photostimulation laser calibratie. (een) foto-stimulatie laservermogen. Macht op het vlak van de steekproef (door middel van een 60 x / 1.0 nb water dompelen doelstelling) werd gemeten voor 405 nm en 473 nm foto-stimulatie lasers op de aangegeven uitgangsinstelling. (b) foto-stimulatie laser kalibratie. Scherm vastleggen beelden tonen de ruimtelijke relatie tussen de beoogde foto-stimulatie stip en de overeenkomende locatie waar foto-stimulatie zich heeft voorgedaan (burn-gat) voor (links) en na (rechts) lopende kalibratie in MarkPoints. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58873/58873fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58873/58873fig2.jpg"> Figuur 2: de lokale toepassing PA-Nic. (een) detectie van PA-Nic vanuit een lokale toepassing pipet. 1 mM PA-Nic, fotolyse bijproduct of nicotine waren opgelost in ACSF, in een lokale toepassing pipet geladen en afgeleverd op hersenweefsel tijdens 2PLSM (900 nm excitatie) imaging met dezelfde grafische instellingen voor elk medicijn. Laser scannen Dodt contrast transmissie afbeelding toont de weefsel/pipet overwegende dat een GaAsP kathode bet werd gebruikt voor het vastleggen van de fluorescentie emissie. (b) PA-Nic (1 mM) was geperfundeerd in hersenweefsel en beeld via 2PLSM zoals in (een) om te laten zien van de laterale verspreiding van PA-Nic met behulp van haar intrinsieke fluorescentie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58873/58873fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58873/58873fig3.jpg"> Figuur 3: verwerving van 2-foton laser scanning microscopie beelden. (een) optimale 2PLSM Z-stacks. Twee voorbeelden van 2PLSM Z-stack maximumlichtsterkte projecties zijn getoond MHb neuronen met goed opgelost dendrites en weinig tot geen storende puin. (b) sub-optimale 2PLSM Z-stacks. Twee voorbeelden van 2PLSM Z-stack maximumlichtsterkte prognoses worden voor MHb neuronen omringd door puin (kleurstof de pipet uitgezet tijdens cel aanpak) weergegeven. Dergelijke beelden zijn moeilijker te interpreteren dan beelden zoals die worden weergegeven in (een). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58873/58873fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58873/58873fig4.jpg"> Figuur 4: Laser flash fotolyse van PA-Nic. (een) MarkPoints referentie afbeeldingen en innerlijke stromingen opgeroepen door PA-Nic fotolyse. Een MHb neuron, ruwe referentie afbeeldingen staan voor MarkPoints foto-stimulatie proeven op een enkele (aangegeven) cellulaire plaats. Merk op dat voor sommige foto-stimulatie locaties (het meest rechtse beeld in deze serie), de dendritische structuur is in focus maar het soma en de proximale dendriet zijn niet. Onder de referentieafbeelding van elke, wordt de nicotine uncaging-opgeroepen inkomende stroom uitgezet. (b) tussen stimulus intervallen voor PA-Nic fotolyse. Exemplar opnames worden weergegeven voor MHb neuronen waar nicotine was herhaaldelijk uncaged op dezelfde perisomatic locatie met een onderlinge stimulans interval van 1 s of 10 s. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58873/58873fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Probing Nicotinic Acetylcholine Receptor Function in Mouse Brain Slices via Laser Flash Photolysis of Photoactivatable Nicotine at JoVE.com

Probing Nicotinic Acetylcholine Receptor Function in Mouse Brain Slices via Laser Flash Photolysis of Photoactivatable Nicotine

Dit artikel presenteert een methode voor het bestuderen van nicotinerge acetylcholine-receptoren (nAChRs) in muis hersenen plakjes door nicotine uncaging. Wanneer in combinatie met de gelijktijdige patch klem opname en 2-foton laser scanning microscopie, verbindt nicotine uncaging nicotinerge receptor functie met cellulaire morfologie, bieden een dieper begrip van cholinerge neurobiologie.

Indringende nicotinerge Acetylcholine Receptor functie in muis segmenten van de hersenen via Laser Flash fotolyse van Photoactivatable Nicotine

Acetylcholine (ACh) acts through receptors to modulate a variety of neuronal processes, but it has been challenging to link ACh receptor function with ...

Deze techniek maakt gebruik van multi-photon laser-scanning microscopie in combinatie met laser-flash fotolyse van een fotoactiviteit nicotine molecuul. Het toestaan van nauwkeurige activering van nicotinic cholinerge receptoren. Deze techniek zorgt voor fijne spatiotemporale controle over nicotinische receptor agonistische toepassing, het verstrekken van een krachtig instrument voor de studie van receptor functionele expressie patronen en cholinerge synaptische of volumetransmissie.Gebruik voor het begin van de procedure een programmeerbare pipettrekker om een glazen micropipet met een openingsdiameter van 20 tot 40 micrometer te trekken. Zeef ongeveer een milliliter opnameoplossing door middel van een 0,22-micron filter. En resuspend genoeg lyophilized fotoactivatable nicotine in de gefilterde opname-oplossing om een twee-millimolar uiteindelijke concentratie opleveren.Vul de getrokken lokale toepassingsmicropipet met 50 microliters van het fotoactivatable medicijn en bevestig de pipet in een pipethouder die op een micromanipulator is gemonteerd. Sluit de pipethouder via een geschikte lengte van de slang aan op een drukuitwerpsysteem dat een langdurige lagedruktoepassing kan dragen. En gebruik de micromanipulator om de lokale toepassing pipet manoeuvreren in de extracellulaire opname-oplossing.Plaats de pipet tip iets boven een muis hersenweefsel monster, ongeveer 50 micrometer van de cel van belang. En kort een tot twee pond per vierkante centimeter druk op de pipet. Er mag minimaal tot geen verplaatsing van de cel van belang zijn.Na het bereiken van een stabiele hele-cel patch klem, zet de lage toepassing op de druk uitwerping apparaat, en verzadigen het weefsel rond de cel met fotoactivatable nicotine voor een tot twee minuten. Lokale toepassing introduceert extra complexiteit van het experiment. Maar het spaart verbinding en maakt het mogelijk hogere concentraties van PA-Nic te worden gebruikt.Voor badtoepassing van de fotoactivatable nicotine, eerst oplossen genoeg van de lyophilized drug in een volume van de opname oplossing geschikt voor continue recirculatie naar een 100-micromolar uiteindelijke concentratie. En laad het resulterende mengsel in een perfusiesysteem. Begin dan met recirculatie van de fotoactivatable nicotineoplossing met een snelheid van 1,5 tot 2 millimeter per minuut, met behulp van buizen met een minimale binnendiameter en totale lengte om het vereiste recirculatievolume te minimaliseren.Tijdens recirculatie, continu bellen de oplossing met carbogen, en handhaven van de badtemperatuur op 32 graden Celsius onder omstandigheden met weinig licht. Badtoepassing profiteert van de eenvoud en uniformiteit van PA-Nic doordronving van het weefsel. Maar het noodzakelijkerwijs maakt gebruik van lagere micromolar PA-Nic concentraties, en besteedt hogere totale hoeveelheden verbinding.Voor live visualisatie van een mediale habenula neuron, gebruik uitgezonden licht of infrarood differentieel interferentie contrast optica en een videocamera om een stabiele, hele cel patch klem opname vast te stellen. Na het instellen van de celgevoegde configuratie met hoge weerstand, maar voordat u inbreekt, schakelt u de installatie en de software in de laserscanmodus. Na het inbreken, gebruik laser scanning om te controleren of de beeldvorming kleurstof van belang is passief vullen van het neuron door diffusie.Laat de kleurstof om de cellulaire compartimenten te vullen voor ten minste 20 tot 30 minuten voor het gebruik van de live scan functie om het neuron en subcellulaire compartiment van belang te visualiseren. Selecteer beeldparameters die een nauwkeurige live visualisatie van de neuronale functies mogelijk maken, waarbij de juiste instellingen worden gemanipuleerd om de weergavevisualisatie, resolutie, signaal-ruisverhouding en de aankooptijd van het beeldframe zo nodig te beïnvloeden of te wijzigen. Open het venster van de opzoektafel en past de instellingen van de opzoektafel en plafond aan om het signaalcontrast te verbeteren.Als u een interessegebied in het weefsel wilt vinden, selecteert u de optische zoom van 1x en gebruikt u de panning-besturingselementen. Gebruik het gereedschap Z-serie om een begin- en stoppositie te selecteren die de cel van belang bevat. Stel een stapgrootte in van één micrometer en selecteer een afbeeldingsgrootte die een afbeelding met de hoogste resolutie oplevert.Vaak 1, 024 bij 1, 024 pixels per regel. Dan achtereenvolgens beeld van het neuron in elk Z-vlak dat de cel bevat. Om de laserstimulatie te kalibreren, start u het scannen van het systeem met een laservermogen dat groter is dan minimaal en verfijnen u de objectieve focus op de dunne rode markerfluorescentielaag.Selecteer een gebied binnen het fluorescentieveld vrij van vuil en gelijkmatig bedekt met markering, en open het menu gereedschappen, kalibratie en uitlijning om de niet-kwaderende galvocalibratiefunctie te selecteren. Volg de brandplek tutorial voor de ruimtelijke kalibratie van de tweede galvanometer spiegel paar, het selecteren van de 405-nanometer laser, een laser stimulatie vermogen van 400, en een stimulatie duur van 20 milliseconden. Om gaten met een diameter van één tot vijf micrometer in de rode markering op te leveren.Selecteer bijwerken om de afbeelding te stimuleren en te vernieuwen nadat de middelste vlek is verbrand en verplaats de ronde rode indicator naar de werkelijke pleklocatie van het midden, rechtscentrum en lager middelpunt om een raster van negen plekken te verkrijgen. Als u de kalibratie wilt testen, opent u het venster markeringspunten en activeert u handmatig de stimulatieparameters van de gedefinieerde vlekken in een nieuw gebied van het monster, waarbij u ervoor wilt zorgen dat het juiste laatste kalibratiebestand in het venster markpunten wordt geladen. Breng vervolgens een testpuls toe om de juiste kalibratie te verifiëren.Als u het subcellulaire interessegebied kort wilt beelden en lokaliseren, selecteert u live scannen en gebruikt u de optische zoom vergroten om eventuele kleine structuren zo nodig te visualiseren. Plaats het markeringspunt crosshairs direct naast het celmembraan en stel de fototimulatieparameters in op een duur van één tot 50 milliseconden, een laservermogen van één tot vier milliwatt en ten minste één proef. Selecteer vervolgens markeringspunten om het markeringspuntenprotocol te starten en observeer de gegevensverwerving van elektrofysiologie in realtime.Fotoactivatable nicotine 2PE fluorescentie van een-millimolar PA-Nic is gemakkelijk gedetecteerd tijdens druk uitwerping van een lokale toepassing pipet zoals aangetoond. Terwijl de levering van de belangrijkste fotochemische producten van de fotoactiviteitbare nicotinefotolysereactie geen fluorescerend signaal bij dezelfde concentratie en opwindingskracht en golflengte genereert. Het aantonen van de specificiteit van de fotoactivatable nicotineresultaten.Beeldvorming van de fotoactiviteitbare nicotine toegepast op het hersenweefsel zoals aangetoond onthult de aanwezigheid van het geneesmiddel binnen 100 tot 200 micrometer van de lokale toepassing pipet. Bevestigen dat fotoactiviteitbare nicotine effectief kan worden geleverd aan het hersenweefsel via lokale toepassing. Hier worden beelden van hoge kwaliteit getoond waarbinnen de neuronale morfologie compleet lijkt te zijn, het geluid wordt geminimaliseerd en het puin de interpretatie van de cellulaire morfologie niet verstoort.Deze beelden zijn echter van een lagere kwaliteit. Als gevolg van een lagere signaal-achtergrond verhouding en aanzienlijke puin. Het koppelen van twee-foton laser scanning microscopie van mediale habenula neuronen in de hersenen plakjes met laser flash fotolyse van PA-Nic zoals aangetoond, zorgt voor de verzoening van elektrofysiologische reacties met cellulaire morfologie.Single-spot fotolyse uitgevoerd met intervallen van 10 seconden zorgt voor een voldoende hersteltijd voor de basislijn holding stroom. Terwijl een kortere interval van één seconde leidt tot een geleidelijke toename van de holdingstroom naarmate het protocol vordert. Wat suggereert dat de nicotine niet genoeg tijd heeft om zich met de kortere intervallen van het systeem af te schunken.Bij het ontwerpen van experimenten die gebruik maken van fotoactivatable moleculen, is het belangrijk om te onthouden om fluorescerende indicatoren te selecteren en fluoroforen te rapporteren met compatibele excitatie emissiespectra. PA-Nic is compatibel met de meest voorkomende fluoroforen vanwege de korte golflengte fotolyse piek. Bij het kiezen van de meest geschikte PA-Nic toepassingstechniek is het belangrijk om zorgvuldig na te denken over de functionele expressie, fysiologische activiteit van de nicotinische receptoren in de neuronen van belang.Ervaren gebruik van deze techniek zorgt voor fijne spatiotemporale controle van nicotine toepassing, die spannende nieuwe mogelijkheden voor het bestuderen van de kinetiek van inheemse nicotinische receptor betrokkenheid, subcellulaire lokalisatie, en modulatie van neuronale activiteit door nicotinische receptor activering mogelijk maakt.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Flash Photolysis of Caged Compounds in the Cilia of Olfactory Sensory  Neurons

Flash fotolyse van Gekooide verbindingen in de Cilia van olfactorische sensorische neuronen

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. ...

Spectral Confocal Imaging of Fluorescently tagged Nicotinic Receptors in Knock-in Mice with Chronic Nicotine Administration

Spectrale confocale beelden van de fluorescent gelabeld nicotinereceptoren in de knock-in muizen met chronische Nicotine Administratie

Ligand-gated ion channels in the central nervous system (CNS) are implicated in numerous conditions with serious medical and social consequences.  For ...

Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

Imaging Calcium Reacties in GFP-gelabelde neuronen van de hypothalamus Mouse Brain Slices

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the ...

Local Application of Drugs to Study Nicotinic Acetylcholine Receptor Function in Mouse Brain Slices

Lokale toepassing van geneesmiddelen aan nicotine acetylcholine receptor functie in de hersenen van muizen Slices Studie

Tobacco use leads to numerous health problems, including cancer, heart disease, emphysema, and stroke. Addiction to cigarette smoking is a prevalent ...

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

In vivo Postnatale Elektroporatie en time-lapse imaging van neuroblast Migratie in Muis Acute Brain Slices

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to ...

Laser-guided Neuronal Tracing In Brain Explants

Lasergestuurde Neuronal Tracing In Brain Explantaten

We present a technique which combines an in vitro tracer injection protocol, which uses a series of electrical and pressure pulses to increase dye uptake ...

Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique

Beeldvorming Serotonerge vezels in de muis Spinal Cord Met behulp van de DUIDELIJKHEID / CUBIC Techniek

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal ...

Studying Brain Function in Children Using Magnetoencephalography

Bestuderen van de hersenfunctie bij kinderen met behulp van Liquor

Magnetoencephalography (MEG) is a non-invasive neuroimaging technique which directly measures magnetic fields produced by the electrical activity of the ...

Chronic Implantation of Whole-cortical Electrocorticographic Array in the Common Marmoset

Chronische implantatie van geheel-corticale Electrocorticographic Array in de gemeenschappelijke Hapalomys

Electrocorticography (ECoG) allows the monitoring of electrical field potentials from the cerebral cortex with high spatiotemporal resolution. Recent ...