Name: probing nicotinic acetylcholine receptor function in mouse brain slices via laser flash photolysis of photoactivatable nicotine
Uploaded: 2019-01-25T13:00:00
Duration: 10 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Probing Nicotinic Acetylcholine Receptor Function in Mouse Brain Slices via Laser Flash Photolysis of Photoactivatable Nicotine at JoVE.com

Die Autoren danken Labor-Mitglieder der folgenden nordwestlichen Hauptprüfer: Ryan Drenan, D. James Surmeier, Yevgenia Kozorovitskiy und Anis Auftragnehmer. Diese Arbeit wurde durch die US National Institute of Health (NIH) (Zuschüsse, DA035942 und DA040626, R.M.D.), der PhRMA Stiftung (Stipendium, M.C.A) und HHMI unterstützt.

<ol>
	<li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholinergic+tone+in+ventral+tegmental+area:+Functional+organization+and+behavioral+implications.">Cholinergic tone in ventral tegmental area: Functional organization and behavioral implications.</a> Neurochemistry International. 114, 127-133 (2018).</li><li>Sarter, M., Parikh, V., Howe, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phasic+acetylcholine+release+and+the+volume+transmission+hypothesis:+time+to+move+on.">Phasic acetylcholine release and the volume transmission hypothesis: time to move on.</a> Nature Reviews Neuroscience. 10 (5), 383-390 (2009).</li><li>Coyle, J. T., Price, D. L., DeLong, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's+disease:+a+disorder+of+cortical+cholinergic+innervation.">Alzheimer's disease: a disorder of cortical cholinergic innervation.</a> Science. 219 (4589), 1184-1190 (1983).</li><li>Katz, B., Thesleff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+study+of+the+desensitization+produced+by+acetylcholine+at+the+motor+end-plate.">A study of the desensitization produced by acetylcholine at the motor end-plate.</a> Journal of Physiology. 138 (1), 63-80 (1957).</li><li>Banala, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoactivatable+drugs+for+nicotinic+optopharmacology.">Photoactivatable drugs for nicotinic optopharmacology.</a> Nature Methods. 15 (5), 347-350 (2018).</li><li>Yan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotinic+Cholinergic+Receptors+in+VTA+Glutamate+Neurons+Modulate+Excitatory+Transmission.">Nicotinic Cholinergic Receptors in VTA Glutamate Neurons Modulate Excitatory Transmission.</a> Cell Reports. 23 (8), 2236-2244 (2018).</li><li>Engle, S. E., Shih, P. Y., McIntosh, J. M., Drenan, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#945;4&#945;6&#946;2*+nicotinic+acetylcholine+receptor+activation+on+ventral+tegmental+area+dopamine+neurons+is+sufficient+to+stimulate+a+depolarizing+conductance+and+enhance+surface+AMPA+receptor+function.">&#945;4&#945;6&#946;2* nicotinic acetylcholine receptor activation on ventral tegmental area dopamine neurons is sufficient to stimulate a depolarizing conductance and enhance surface AMPA receptor function.</a> Molecular Pharmacology. 84 (3), 393-406 (2013).</li><li>Engle, S. E., Broderick, H. J., Drenan, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+application+of+drugs+to+study+nicotinic+acetylcholine+receptor+function+in+mouse+brain+slices.">Local application of drugs to study nicotinic acetylcholine receptor function in mouse brain slices.</a> Journal of Visualized Experiments. (68), (2012).</li><li>Ren, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Habenula+&amp;#34;cholinergic&amp;#34;+neurons+co-release+glutamate+and+acetylcholine+and+activate+postsynaptic+neurons+via+distinct+transmission+modes.">Habenula &amp;#34;cholinergic&amp;#34; neurons co-release glutamate and acetylcholine and activate postsynaptic neurons via distinct transmission modes.</a> Neuron. 69 (3), 445-452 (2011).</li><li>Koppensteiner, P., Melani, R., Ninan, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Cooperative+Mechanism+Involving+Ca(2+)-Permeable+AMPA+Receptors+and+Retrograde+Activation+of+GABAB+Receptors+in+Interpeduncular+Nucleus+Plasticity.">A Cooperative Mechanism Involving Ca(2+)-Permeable AMPA Receptors and Retrograde Activation of GABAB Receptors in Interpeduncular Nucleus Plasticity.</a> Cell Reports. 20 (5), 1111-1122 (2017).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+Excitation+via+GABAB+Receptors+in+Habenula+Cholinergic+Neurons+Regulates+Fear+Memory+Expression.">Presynaptic Excitation via GABAB Receptors in Habenula Cholinergic Neurons Regulates Fear Memory Expression.</a> Cell. 166 (3), 716-728 (2016).</li><li>Chen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+Baseline+and+Nicotine-Mediated+Behavioral+and+Cholinergic+Profiles+in+ChAT-Cre+Mouse+Lines.">Altered Baseline and Nicotine-Mediated Behavioral and Cholinergic Profiles in ChAT-Cre Mouse Lines.</a> The Journal of Neuroscience. 38 (9), 2177-2188 (2018).</li><li>Nagy, P. M., Aubert, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+the+vesicular+acetylcholine+transporter+increased+acetylcholine+release+in+the+hippocampus.">Overexpression of the vesicular acetylcholine transporter increased acetylcholine release in the hippocampus.</a> Neuroscience. 218, 1-11 (2012).</li><li>Ting, J. T., Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombineering+strategies+for+developing+next+generation+BAC+transgenic+tools+for+optogenetics+and+beyond.">Recombineering strategies for developing next generation BAC transgenic tools for optogenetics and beyond.</a> Frontiers in Behavioral Neuroscience. 8, 111 (2014).</li><li>Crittenden, J. R., Lacey, C. J., Lee, T., Bowden, H. A., Graybiel, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severe+drug-induced+repetitive+behaviors+and+striatal+overexpression+of+VAChT+in+ChAT-ChR2-EYFP+BAC+transgenic+mice.">Severe drug-induced repetitive behaviors and striatal overexpression of VAChT in ChAT-ChR2-EYFP BAC transgenic mice.</a> Frontiers in Neural Circuits. 8, 57 (2014).</li><li>Kolisnyk, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChAT-ChR2-EYFP+mice+have+enhanced+motor+endurance+but+show+deficits+in+attention+and+several+additional+cognitive+domains.">ChAT-ChR2-EYFP mice have enhanced motor endurance but show deficits in attention and several additional cognitive domains.</a> The Journal of Neuroscience. 33 (25), 10427-10438 (2013).</li><li>Nagy, P. M., Aubert, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+the+vesicular+acetylcholine+transporter+enhances+dendritic+complexity+of+adult-born+hippocampal+neurons+and+improves+acquisition+of+spatial+memory+during+aging.">Overexpression of the vesicular acetylcholine transporter enhances dendritic complexity of adult-born hippocampal neurons and improves acquisition of spatial memory during aging.</a> Neurobiology of Aging. 36 (5), 1881-1889 (2015).</li><li>Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+scanning+photochemical+microscopy:+mapping+ligand-gated+ion+channel+distributions.">Two-photon scanning photochemical microscopy: mapping ligand-gated ion channel distributions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (14), 6629-6633 (1994).</li><li>Khiroug, L., Giniatullin, R., Klein, R. C., Fayuk, D., Yakel, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+mapping+and+Ca2++regulation+of+nicotinic+acetylcholine+receptor+channels+in+rat+hippocampal+CA1+neurons.">Functional mapping and Ca2+ regulation of nicotinic acetylcholine receptor channels in rat hippocampal CA1 neurons.</a> The Journal of Neuroscience. 23 (27), 9024-9031 (2003).</li><li>Filevich, O., Salierno, M., Etchenique, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+caged+nicotine+with+nanosecond+range+kinetics+and+visible+light+sensitivity.">A caged nicotine with nanosecond range kinetics and visible light sensitivity.</a> Journal of Inorganic Biochemistry. 104 (12), 1248-1251 (2010).</li><li>Tochitsky, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optochemical+control+of+genetically+engineered+neuronal+nicotinic+acetylcholine+receptors.">Optochemical control of genetically engineered neuronal nicotinic acetylcholine receptors.</a> Nature Chemistry. 4 (2), 105-111 (2012).</li><li>Wokosin, D. L., Squirrell, J. M., Eliceiri, K. W., White, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+workstation+with+concurrent,+independent+multiphoton+imaging+and+experimental+laser+microbeam+capabilities.">Optical workstation with concurrent, independent multiphoton imaging and experimental laser microbeam capabilities.</a> Review of Scientific Instruments. 74 (1), 193-201 (2003).</li><li>Plotkin, J. L., Day, M., Surmeier, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptically+driven+state+transitions+in+distal+dendrites+of+striatal+spiny+neurons.">Synaptically driven state transitions in distal dendrites of striatal spiny neurons.</a> Nature Neuroscience. 14 (7), 881-888 (2011).</li><li>Galtieri, D. J., Estep, C. M., Wokosin, D. L., Traynelis, S., Surmeier, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pedunculopontine+glutamatergic+neurons+control+spike+patterning+in+substantia+nigra+dopaminergic+neurons.">Pedunculopontine glutamatergic neurons control spike patterning in substantia nigra dopaminergic neurons.</a> Elife. 6, (2017).</li><li>Yasuda, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+calcium+concentration+dynamics+in+small+neuronal+compartments.">Imaging calcium concentration dynamics in small neuronal compartments.</a> Science STKE. (219), pl5 (2004).</li><li>Inoue, S., Spring, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Video microscopy: The fundamentals. , 163-186 (1997).</li><li>Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonlinear+magic:+multiphoton+microscopy+in+the+biosciences.">Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences.</a> Nature Biotechnology. 21 (11), 1369-1377 (2003).</li><li>Maravall, M., Mainen, Z. F., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimating+intracellular+calcium+concentrations+and+buffering+without+wavelength+ratioing.">Estimating intracellular calcium concentrations and buffering without wavelength ratioing.</a> Biophysical Journal. 78 (5), 2655-2667 (2000).</li><li>Wathey, J. C., Nass, M. M., Lester, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Numerical+reconstruction+of+the+quantal+event+at+nicotinic+synapses.">Numerical reconstruction of the quantal event at nicotinic synapses.</a> Biophysical Journal. 27 (1), 145-164 (1979).</li><li>Shih, P. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+and+function+of+nicotinic+acetylcholine+receptors+in+subdivisions+of+medial+habenula.">Differential expression and function of nicotinic acetylcholine receptors in subdivisions of medial habenula.</a> The Journal of Neuroscience. 34 (29), 9789-9802 (2014).</li><li>Verhoog, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Layer-specific+cholinergic+control+of+human+and+mouse+cortical+synaptic+plasticity.">Layer-specific cholinergic control of human and mouse cortical synaptic plasticity.</a> Nature Communications. 7, 12826 (2016).</li><li>Koukouli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotine+reverses+hypofrontality+in+animal+models+of+addiction+and+schizophrenia.">Nicotine reverses hypofrontality in animal models of addiction and schizophrenia.</a> Nature Medicine. 23 (3), 347-354 (2017).</li><li>Xiao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+nicotine+selectively+enhances+&#945;4&#946;2*+nicotinic+acetylcholine+receptors+in+the+nigrostriatal+dopamine+pathway.">Chronic nicotine selectively enhances &#945;4&#946;2* nicotinic acetylcholine receptors in the nigrostriatal dopamine pathway.</a> The Journal of Neuroscience. 29 (40), 12428-12439 (2009).</li><li>Peng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Editing+Vectors+for+Studying+Nicotinic+Acetylcholine+Receptors+in+Cholinergic+Transmission.">Gene Editing Vectors for Studying Nicotinic Acetylcholine Receptors in Cholinergic Transmission.</a> European Journal of Neuroscience. , (2018).</li></ol>

D.L.W. dient als bezahlte Berater für die Bruker Nano-Fluoreszenz-Mikroskopie.

Die Wahl der PA-Nic Anwendungsbereitstellung/Methode ist der wichtigste Schritt in diese lokalisierten Foto-Stimulationstechnik. Zwei Methoden, Bad Anwendung und lokalen Perfusion, bietet jedes deutliche Vorteile und Einschränkungen. Die Wahl wird weitgehend durch die nAChR funktionelle Expression in der Zelle Art von Interesse beeinflusst. Es empfiehlt sich, Bad-Anwendung zu verwenden, wenn funktionelle Expression Ebenen hoch sind, denn Bad Anwendung eine einheitliche Sonde Konzentration rund um die aufgezeichneten Zelle ermöglicht, Interpretation der Daten zu erleichtern. Bad Anwendung beseitigt auch die Notwendigkeit einer zweiten Perfusion Pipette in das Gewebe, so dass des gesamten Prozess leichter. Bad Anwendung von teuren Verbindungen jedoch kostet mehr pro Versuch.
Im Allgemeinen beinhaltet Problembehandlung versuchen zu verstehen, warum keine nAChR Aktivierung gesehen folgende Flash Photolyse. Umgang mit einem Zelltyp, die zuvor nicht mit PA-Nic untersucht wurden, sollten die Ermittler lokale Blätterteig-Anwendung von ACh durchführen oder Nikotin um festzustellen, ob genügende Rezeptoren funktional sind ausgedrückt5. Um zu überprüfen, dass das System in der Lage erkennen Photolyse Antworten sollten Experimente in medialen Habenulae Neuronen erfolgen, die große Mengen an Rezeptor30ausdrücken. In diesem Bereich des Gehirns ist PA-Nic Bad Anwendung möglich, was für Validierung Experimente vorzuziehen. Erst nach dieser Validierung experimentieren sollte man auf ein rezenter Zelltyp bewegen. Fügen Sie wenn das experimentelle System validiert wurde und Antworten sehr klein oder nicht nachweisbar bleiben, kann es gerechtfertigt sein, zur Erhöhung der Konzentration von PA-Nic, erhöhen die Blitzintensität oder Pulsdauer, eine nAChR positive allosterische Modulator nAChR verbessern Aktivität-6, oder eine Kombination davon.
Gelegentlich uncaging Antworten sind zu groß, mit signifikanten nAChR Aktivierung wiederum indirekte Spannung gated Na+ Kanal Aktivierung und ausgespannt nach innen Ströme aufgrund schlechter Platz Klemme. Diese Artefakte, die vollständig verdecken nAChR nach innen Strömungen und Interpretation der Daten unmöglich machen, können durch die Aufnahme von QX-314 (2 mM) in die Aufnahme Pipette beseitigt werden. Sie können auch durch eine Verringerung der Konzentration von PA-Nic oder durch eine Verringerung der Blitzintensität oder Pulsdauer beseitigt werden. In allen sichtbaren Foto-Lichtstimulation versuchen müssen die Sorgfalt bei der Auswahl der Stimulation Websites, um unbeabsichtigte Stimulation/Photolyse oberhalb oder unterhalb der gewünschten Brennebene zu vermeiden. Zusätzlich und wenn zutreffend, die Laserleistung muss immer titriert werden, um physiologische Reaktionen zu reproduzieren. Es ist besonders wichtig zu wissen der z-Achse Photostimulation beim Arbeiten mit Käfig Liganden als Liganden, die oberhalb/unterhalb der Brennfleck aktiviert werden können noch diffus und Interaktion mit dem biologischen System (d. h., Rezeptoren) untersucht.
PA-Nic Laser Flash Photolyse möglicherweise nicht geeignet für alle Forscher, wie mehrere Einschränkungen vorhanden sind. Die erste ist die relativ hohen Kosten für eine geeignete Einrichtung. Beim Arbeiten mit intakten Gehirnscheiben uncaging in der Nähe von kleinem Durchmesser Strukturen wie Dendriten erfordert eine ausgefeilte Visualisierung wie ein 2-Photonen-Mikroskop. Abgesehen von der hohen Kosten für eine Exklusivrepräsentation abstimmbaren IR gepulsten Lasers für leistungsstarke 2-Photonen-Mikroskopie, erhöht ein Dual-Galvanometer-System in der Lage, selbständig Positionierung zwei Laserstrahlen weiter die Systemkosten. Gesamtsystem Kosten können reduziert werden, mit einem selbstgebauten System, wenn die Ermittler verfügt über ausreichend Fachwissen und Zeit zu konstruieren, zu beheben und pflegen ein solches System. Eine zweite Einschränkung oft beinhaltet niedrige nAChR funktionelle Expression, die teilweise entschärft werden kann, durch Maßnahmen wie oben erwähnt, aber dies kann keine Garantie für Erfolg. In der Regel einem Liganden aktiviert Strömungen nach Blätterteig-Anwendung des Agonisten nicht messen kann, können PA-Nic Flash Photolyse unter Spannung Klemme nicht akzeptable Ergebnissen führen. Eine dritte Einschränkung betrifft die intrinsische Fluoreszenz von PA-NIC PA-Nic ~ 405 nm Licht absorbiert und strahlt in einem ähnlichen Bereich wie grün fluoreszierendes Protein (GFP) oder Alexa 488-5. Wenn PA-Nic Konzentrationen ~ 1 mM überschreiten, machen diese Fluoreszenz-Eigenschaft eine Herausforderung, gleichzeitig neuronale Strukturen visualisieren es. Um dies zu mindern, ist es wichtig, den Fluss der PA-Nic aus der Perfusion Pipette leicht kontrollieren zu können. In regelmäßigen Abständen wurde die PA-Nic-Strömung gestoppt, um fluoreszierende Moleküle entfernt diffundieren zu lassen. Dies erlaubt die Neuerstellung des Neurons für die Überprüfung der Kassaposition des uncaging Strahls. Eine vierte mögliche Einschränkung zu erwähnen beinhaltet die Verwendung von 405 nm Licht für Photolyse. Kürzere Wellenlängen wie 405 nm sind anfälliger für Streuung in komplexen Gewebe wie ein Gehirn-Scheibe. So bei einem bestimmten Flash-Intensität und Dauer, können uncaging Resonanz-Amplituden und Verfall Kinetik differentiell die Schärfentiefe der uncaging innerhalb der Schicht betroffen sein. Rückschlüsse auf biologische Aspekte der nAChRs sollte diese wichtige Einschränkung berücksichtigt werden.
Diese lokalisierten Laser Flash Photolyse Technik hat kürzlich neue Details über nAChR Neurobiologie aufzudecken eingesetzt. Zum Beispiel verbessert chronische Nikotinexposition Perisomatic und dendritischen nAChR Funktion im medialen Habenulae Neuronen5. Es wurde auch verwendet, um zum ersten Mal zu demonstrieren, dass ventralen Haubengebiet Glutamat Nervenzellen funktionalen nAChRs in ihren Perisomatic und dendritischen Zellen Fächer6ausdrücken. Gibt es viele mögliche zukünftige dieser Technik verwendet, und der Ansatz angewandt werden, zu anderen wichtigen Neuron, die ausdrückliche nAChRs wie kortikale pyramidale Neuronen31 oder Interneuronen in der Großhirnrinde32, Striatum33 bekannt sind , und Hippocampus19. Diese Technik kann auch mit Pharmakologie und/oder nAChR gen Bearbeiten34 zum spezifischen Rezeptor-Subtypen zu verschiedenen neuronalen Kompartimenten lokalisieren kombiniert werden. Der Ansatz kann an andere Cumarin-Käfig Verbindungen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, diejenigen mit PA-Nic5parallel entwickelt leicht angepasst werden. Zu guter Letzt werden PA-Nic Flash Photolyse vielleicht eines Tages verwendet ein Tier wach/Verhalten, um Nikotin Aktion im Roman Verhaltens Pharmakologie Paradigmen zu studieren.

Cholinerge Signal moduliert zahlreiche Vorgänge im Gehirn, einschließlich Aufmerksamkeitskontrolle, willentlichen Bewegung und Belohnung1,2. Medikamente, die Acetylcholin (ACh) Übertragung zu verbessern sind zur Behandlung von kognitiven Beeinträchtigung, die Alzheimer-Krankheit, was bedeutet eine wichtige Rolle für die cholinerge Systeme in Wahrnehmung3zugeordnet. Ein verbessertes Verständnis von cholinergen Rezeptoren und Schaltungen in gesunden und Kranken Staaten könnten bessere therapeutische Ansätze für verschiedene neurologische Krankheiten/Störungen.
Nicotinsäure ACh-Rezeptoren (nAChRs) sind eine Familie der Liganden-gated Ionenkanäle, die kationen auf endogene ACh oder exogene Nikotin von Tabakerzeugnissen flux. Angesichts der Tatsache, dass sie zu den allerersten Neurotransmitter-Rezeptoren beschrieben4gehörten, ist nAChR Pharmakologie und Lage in Muskelfasern für Muskel-Typ Rezeptoren gut verstanden. Im Gegensatz dazu, ist über die Pharmakologie und subzelluläre Verteilung von native nAChRs im Gehirn vergleichsweise wenig bekannt. Diese Wissenslücke wurde vor kurzem durch eine neuartige chemische Sonde, die räumlich beschränkt und schnelle Aktivierung der nAChRs im Gehirngewebe während zelluläre Bildgebung und elektrophysiologische Aufnahme5ermöglicht die Entwicklung behoben. Hier werden die wichtigsten methodischen Schritte beteiligt in diesem Ansatz beschrieben, mit dem übergeordneten Ziel der Verbesserung der Fähigkeit, nAChR Funktion mit neuronalen Struktur zu verbinden.
Photoactivatable Nikotin (PA-Nic; chemische Bezeichnung: 1-[7-[bis(carboxymethyl)-amino] Cumarin-4-Yl] Methyl-Nikotin) können Photolyzed mit ~ 405 nm Laserblitze effizient Nikotin5,6veröffentlichen werden. Vor uncaging, PA-Nic ist in Lösung stabil und weist keine unerwünschten pharmakologischen oder photochemische Funktionen5. Nach Photolyse freigesetzte Nikotin aktiviert wie vorauszusehen war nAChRs und die uncaging Nebenprodukte sind pharmakologisch inert5. Ein Dauerstrich-Laser dient als die Photolyse Lichtquelle mit einer Leistung > 1 mW an der Probe gemessen. Wenn lokalisiert, gezielte Foto-Stimulation wird kombiniert mit der Fähigkeit, die Zellmembranen mit 2-Photonen-Laser-scanning-Mikroskopie (2PLSM) zu finden, und die zwei wichtigsten Vorteile dieses Ansatzes sind vollständig realisiert: Photolyse Geschwindigkeit und räumliche Präzision.
In den meisten Punkten ist Photolyse von PA-Nic besser als andere Methoden liefern nAChR Liganden an Rezeptoren im Gehirnscheiben. Solche Ansätze sind Bad Anwendung7 und lokalen Medikament Lieferung über ein Kugelfisch Pipette8. Während die ehemaligen Ansatz neigt dazu, die langfristigen Auswirkungen des angewandten Medikaments genug betonen, leiden Letzteres Variabilität in der Reaktionskinetik zwischen Studien und zellenübergreifend. Keiner dieser alternative Ansätze können angemessen Rezeptor-Aktivitäten in verschiedenen zellulären Orten aus der gleichen Neuron unterscheiden. Optogenetically-aktivierte Version von ACh dient zur Untersuchung von native nAChRs9,10,11, aber es hat sich nicht bewährt für Zuordnung subzelluläre nAChR Standorte. Darüber hinaus haben die meisten Studien unter Verwendung dieser Ansatz auf eine ChR2 exprimierenden bakterielle künstliches Chromosom transgenen Maus mit abnormen cholinerge Übertragung12,13,14, verlassen. 15 , 16 , 17.
PA-Nic Photolyse ist nicht nur optische Ansatz für das Studium von cholinerger Rezeptoren. Ein Käfig Carbachol wurde verwendet, um funktionell ACh-Rezeptor-Aktivitäten in kultivierten Zellen18 und Gehirn Scheiben19zuzuordnen, aber wurde nicht im Handel erhältlich für vergleichende Studien während der Entwicklung des PA-NIC. Ein Ruthenium-BIZ (Bipyridine)-Nikotin-Komplex (RuBi-Nikotin) wurde berichtet, dass Nikotin uncaging20zu ermöglichen, aber kommerzielle Vorbereitungen von RuBi-Nikotin erwies sich schlechter als PA-Nic in einem Direktvergleich studieren5. Es kann sinnvoll sein, solche vergleichende Versuche mit nicht-kommerziellen, wiederholen hoch gereinigt RuBi-Nikotin, wie seine sichtbare Absorption PA-Nic-Funktionen für cholinerge Studien ergänzen könnte. Schließlich wurden nAChRs auch optisch manipuliert mit einer Kombination von Foto-schaltbare Liganden und Rezeptoren genetisch veränderten21. Dieser Ansatz ist komplementär zur PA-Nic Photolyse im Hirngewebe, mit der Fähigkeit/Anforderung der genetischen Angriffe auf die veränderten nAChR als einen Vorteil und einen Nachteil.
Mehrere wichtige Anforderungen dieses Ansatzes hingewiesen. Zunächst wird eine geeignete Visualisierungsmethode musste die neuronale Membran genau zu lokalisieren. Bildgebung mit konventionellen Epi-Fluoreszenz-Mikroskopie kann ausreichend sein, wenn man kultivierte Zellen studiert, aber für die Aufnahme von Neuronen im Gehirnscheiben oder andere dicke Gewebe-Präparate, 2PLSM oder der konfokalen Mikroskopie ist eine Voraussetzung. Zweitens ist eine geeignete Methode erforderlich, um die Photolyse Laserstrahl zu positionieren. Dieser Ansatz nutzt einen Dual-Galvanometer Scankopf mit zwei unabhängige X-y-Spiegel für das Raster Scannen der bildgebenden Strahl und Punkt Photoaktivierungen mit dem uncaging Laser Beam22,23,24. Begrenzte Lösungen sind möglich, z. B. (1) eine Single-Galvanometer Scankopf, dass Alternativ Raster scannt der bildgebenden Strahl und der uncaging Strahl oder (2) einfach Regie des uncaging Strahls in die Mitte des Sichtfeldes, so dass die Zelle gebracht wird Diese Position für Flash Photolyse. Drittens ist ein System für gleichzeitige elektrophysiologische aufzeichnen will man physiologische Signale während der Experimente zu sammeln. Die oben genannten Anforderungen können mit einem geeigneten rein optischen bildgebendes Verfahren, wie kürzlich beschriebenen5erfüllt werden. Unten ist ein detailliertes Protokoll enthalten, beschreibt die wichtigsten Schritte dieses Ansatzes.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Instruments, Consumables, and Miscellaneous Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiclamp 700B</td>
			<td>Molecular Devices Corp.</td>
			<td></td>
			<td>Patch clamp amplifier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pneumatic Picopump</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>PV820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instrument Co</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature Controller</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>TC-324C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibrating blade microtome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>VT1200S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrafree-MC Centrifugal Filter</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>UFC30GV0S</td>
			<td>internal solution filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass Capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B150F-4</td>
			<td>patch and local application pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(-)-Nicotine hydrogen tartrate salt</td>
			<td>Glentham</td>
			<td>GL9693</td>
			<td>nicotine salt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7-carboxymethylamino-4-methyl coumarin</td>
			<td>Janelia Research Campus</td>
			<td></td>
			<td>PA-Nic by-product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-[7-[bis(carboxymethyl)- amino]coumarin-4-yl]methyl-nicotine</td>
			<td>Janelia Research Campus</td>
			<td></td>
			<td>PA-Nic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Euthasol (Pentobarbital Sodium and Phenytoin Sodium)</td>
			<td>Virbac</td>
			<td>ANADA #200-071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa FluorTM 488 Hydrazide</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A10436</td>
			<td>green fill dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa FluorTM 568 Hydrazide</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A10437</td>
			<td>red fill dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-carboxy-AF594 (Alexa Fluor 594)</td>
			<td>Janelia Research Campus</td>
			<td></td>
			<td>red fill dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX 314 chloride</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2313</td>
			<td>voltage-gated sodium channel blocker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power Meter&#160;</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>S120C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals for Solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Methyl-D-glucamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic monohydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(+)-Sodium L-ascorbate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiourea</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>230391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>223506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&#8242;,N&#8242;-tetraacetic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8242;-triphosphate magnesium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanosine 5&#8242;-triphosphate sodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Components of 2-Photon Microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Ultima Laser Scanner for Olympus BX51 Microscope</td>
			<td>Bruker Nano, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>imaging software and galvos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160; Imaging X-Y galvanometers</td>
			<td>Cambridge Technology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Mai Tai HP1040</td>
			<td>Spectra-Physics</td>
			<td></td>
			<td>Tuneable IR laser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; &#160;&#160;&#160;&#160;&#160;Pockels cell M350-80-02-BK with M302RM Driver</td>
			<td>Conoptics, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>for IR laser attenuation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Integrating Sphere Photodiode Power Sensor</td>
			<td>Thorlabs, Inc</td>
			<td></td>
			<td>laser power pick-off photodiode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160; Uncaging X-Y galvanometers</td>
			<td>Cambridge Technology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Helios 2-Line Laser Launch</td>
			<td>Bruker Nano, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>uncaging laser components</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; OBIS LX/LS 405 nm (100 mW)</td>
			<td>Coherent, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; OBIS LX/LS 473 nm (75 mW)</td>
			<td>Coherent, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; &#160;Point-Photoactivation / Fiber Input Module for Limo Sidecar - Uncaging</td>
			<td>Bruker Nano, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upright Microscope</td>
			<td>&#160;Olympus</td>
			<td>BX51WIF</td>
			<td>Upright microscope chasis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160; Objective: Olympus M Plan FL 10x; NA 0.3 WD 11 mm</td>
			<td>&#160;Olympus</td>
			<td></td>
			<td>10x objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160; Objective: Olympus M Plan Fluorite 60x/1.0 WD=2mm NIR</td>
			<td>&#160;Olympus</td>
			<td></td>
			<td>60x water-dipping objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160; X-Cite 110, four-LED LLG coupled epi-fluorescence light source</td>
			<td>Excelitas Technologies</td>
			<td></td>
			<td>LED Light Source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Epi-Fluorescence Filter: ET-GFP (FITC/CY2) for Epi-Turret</td>
			<td>Chroma Technologies</td>
			<td></td>
			<td>LED Filter for blue light excitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Epi-Fluorescence Filter: ET-DsRed (TRITC/CY3) for Epi-Turret</td>
			<td>Chroma Technologies</td>
			<td></td>
			<td>LED Filter for green light excitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160; B&#38;W CCD camera; Watec, 0.5in B/W CCD</td>
			<td>Watec Co., LTD.</td>
			<td></td>
			<td>CCD camera for patch clamp recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>External Detectors - Dual Reflected Emission - Olympus Upright (Multi-Alkali, GaAsP)</td>
			<td>Bruker Nano, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160; Multi-alkali side-on PMT</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>R3896</td>
			<td>red channel PMT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 595/50m</td>
			<td>Chroma Technologies</td>
			<td></td>
			<td>red channel emission filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 565lpxr</td>
			<td>Chroma Technologies</td>
			<td></td>
			<td>dichroic beam splitter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160; GaAsP end-on PMT</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>7422PA-40</td>
			<td>green channel PMT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 525/70m</td>
			<td>Chroma Technologies</td>
			<td></td>
			<td>green channel emission filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; High-Speed Shutter for Hamamatsu H7422 PMT</td>
			<td>Vincent Associates / Bruker</td>
			<td>517329</td>
			<td>PMT shutter mount</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dodt Gradient Contrast Transmission Detection Module</td>
			<td>Bruker Nano, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160; Multi-alkali side-on PMT</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>R3896</td>
			<td>Dodt PMT</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

probing nicotinic acetylcholine receptor function in mouse brain slices via laser flash photolysis of photoactivatable nicotine

Acetylcholin (ACh) wirkt durch Rezeptoren eine Vielzahl von neuronalen Prozessen zu modulieren, aber es ist eine Herausforderung gewesen, um ACh-Rezeptor-Funktion mit subzelluläre Lage innerhalb der Zellen zu verknüpfen, wo diese Funktion durchgeführt wird. Um die subzelluläre Lage von Nikotinsäure ACh-Rezeptoren (nAChRs) im nativen Hirngewebe zu untersuchen, wurde eine optische Methode für die genaue Version von Nikotin an diskreten stellen in der Nähe von neuronalen Membranen bei elektrophysiologische Aufnahmen entwickelt. Patch eingespannten Neuronen im Gehirn, die Scheiben mit gefüllt sind färben ihre Morphologie während 2-Photonen-Laser-scanning-Mikroskopie zu visualisieren und Nikotin uncaging mit einem hellen Blitz durch die Konzentration einer 405 nm-Laser-Strahl in der Nähe von einem oder mehreren Zellmembranen ausgeführt. Zelluläre aktuelle Umlenkungen werden gemessen, und eine hochauflösende dreidimensionale (3D) Darstellung der aufgezeichneten Neuron erfolgt um Versöhnung der nAChR Antworten mit zellulären Morphologie zu ermöglichen. Diese Methode ermöglicht detaillierte Analyse der nAChR funktionale Verteilung in komplexen Gewebe Vorbereitungen, verspricht, das Verständnis der cholinerge Neurotransmission zu verbessern.

Für die Photolyse sind Stimulation, die Strahlendosis (Intensität und Zeit), Exposition Lage und Strahlgeometrie Schlüsselvariablen. Das System in diesem Artikel beschriebenen ist in der Lage, zwei unterschiedliche Photostimulation Strahlen, einstellbar über Linsen in/Out von den Lichtweg Photostimulation verschieben, bevor der Strahl das Galvanometer-System gelangt. Ohne dieses Objektiv die Photostimulation Strahl füllt die Eintrittspupille des 60 X / 1,0 NA Wasser-tauchen [60 X WD] Ziel, produziert eine in der Nähe-Beugung begrenzte, Sub-µm-Spot in der Brennebene innerhalb der Probe. Dies ist leicht mit der Form einer Sanduhr, erweitern, oben und unten mit der optischen Achse symmetrisch Brennfleck Photostimulation zugeordnet. Mit dem Objektiv in den Pfad eingefügt Photostimulation Laserlicht konzentriert sich in der Eintrittspupille des Objektivs und beendet sich dann als Bleistift-wie Balken. Dieser Strahl, die ~ 10 µm im Durchmesser für ein 60 X Ziel sein soll, erweitert gleichmäßig/vertikal im gesamten Beispiel. In diesem Modus wird die Lichtintensität an einem bestimmten Ort innerhalb der Stimulation Spot ~ 1 % der kleine Ort Intensität in der Nähe von Beugung begrenzt sein. Somit sind höhere Laserleistungen in der Regel erforderlich, wenn ~ 10 µm spot Stimulation verwendet. Für alle Experimente, die in diesem Artikel berichtet wurde eine Sanduhr-Typ Photostimulation Balken verwendet.
Die gelieferten Probe macht kann gegen die Eingangsspannung Einstellung, nach der Messung der Laserleistung auf die Probe mit einem Leistungsmesser geplottet werden. Diese Studien eine 60 x WD Ziel mit einem Arbeitsabstand von 2 mm verwenden, aber es ist nicht untergetaucht im Wasser für Leistungsmessungen auf mögliche Beschädigung der Detektorelement zu vermeiden. Wenn Ziele mit NA aufgeführt kann > 0,95 in Luft (ohne Immersionflüssigkeit) gemessen werden, es Totalreflexion Verluste an der Vorderseite Linsenelement aufgrund der niedrigeren Index (Luft). In diesem Fall für eine genauere Probe Leistungsmessung (, Totalreflexion Verluste zu korrigieren) erhöhen die gemessene Leistung von 1,0 NA Objektive (1.0/0.95)2 in Luft gemessen. Abbildung 1a zeigt einen typischen input-/Output-Plot für 405 nm und 473 nm sichtbar Laser, die in den Laser integriert werden System in dieser Studie starten. Diese Lasersysteme sind ideal für Foto-Stimulation Belichtungssteuerung Dosis aus den folgenden Gründen: (1) sie sind vorkalibriert bieten direkt lineare Leistungsabgabe im Vergleich zu Eingangsspannung (0-5 V), (2) sie bieten einen Stille Verschluss-Betrieb (kein Laser Ausgang), und (3) sie haben schnelle, Sub-ms Intensität Dauer Impulsregelung (0,1 ms Reaktionszeit). Wenn Sie vor Ort Foto-Stimulation mit einem Laser/Galvo-System verwenden, ist regelmäßige Kalibrierung der Mäler Spots eine wesentliche Aufgabe. Abbildung 1 b (links) zeigt ein System, das aus der Kalibrierung (gewünschten Punkt Foto stimulieren führt nicht präzise Stimulation von diesem Punkt, wie Burn-Loch Standort angegeben), mit einer Rückkehr zur exakten Positionierung der Ort nach der Kalibrierung ( Abbildung 1 b, rechts). 
PA-Nic ist bescheiden fluoreszierende (Emission Peak bei ~ 510 nm), wirksame Erregung zwischen 350-450 nm (1-Photon Erregung) oder 700-900 nm (2-Photon Erregung)5ausstellen. PA-Nic bei lokaler Anwendung visualisieren, PA-Nic (1 mM) in der Nähe von Hirngewebe, gefolgt von simultane Bildgebung (1) Gehirn Gewebe optische geschnittenen Übertragung Kontext über Dodt Kontrast und (2) die emittierte Fluoreszenz von Erregung angewendet wurde (900 nm) des PA-NIC PA-Nic 2PE Fluoreszenz war beim Druck Auswerfen von einer lokalen Anwendung Pipette (Abb. 2a) leicht nachweisbar. Nikotin und ein Monoalkylcoumarin, 7-Carboxymethylamino-4-Methyl Cumarin, sind die wichtigsten photochemische Produkte der PA-Nic Photolyse Reaktion5. Mit dem gleichen imaging Einstellungsparameter, die für PA-Nic Bildgebung verwendet wurden, wurde das Gewebe während der Geburt von Nikotin (1 mM) oder 7-Carboxymethylamino-4-Methyl Cumarin (1 mM) abgebildet. Kein Fluoreszenzsignal erkannt wurde (Abbildung 2a, mittleren und unteren Platten), Nachweis der Spezifität der PA-Nic-Ergebnisse. Zu guter Letzt PA-Nic im Hirngewebe angewendet wurde und PA-Nic Fluoreszenzemission abgebildet war (Abb. 2 b). Dieser Ansatz bestätigt, dass PA-Nic im 100-200 µm der lokalen Anwendung Pipette vorhanden ist. Zusammen, bestätigen diese Daten, dass PA-Nic effektiv auf Gehirn Gewebe über lokale Anwendung geliefert wird.
Elektrophysiologie Aufnahmen mit gleichzeitiger 2PLSM zur Visualisierung der Zellstrukturen benötigt des Prüfers Gleichgewicht Erwägungen für beide Komponenten des Experiments, und oft eine schmale Zeitfenster (~ 20 min) steht für gültig Probe-Datenerfassung aus einer gepatchten Zelle. Ohne Rücksicht auf zelluläre Visualisierung, ist es empfehlenswert, mit der Aufnahme so bald wie möglich nach Einbruch, weil Stabilität Aufnahme tendenziell mit der Zeit sinken. Wenn Bildgebung erforderlich ist, müssen elektrophysiologische Überlegungen jedoch ausreichend Zeit für die Fluoreszenz Konzentration steigt in kleinen/Fernbedienung Strukturen ermöglichen. Dies kommt zum Ausdruck durch die Untersuchung einer Farbstoff-Konzentration füllen Kurve28, die ist manchmal nützlich, ableiten, wenn eine neue Zelle Art imaging. Abbildung 3 zeigt einige Beispiel Neuronen abgebildet als Z-Stapel über 2PLSM und stürzte in eine maximale Intensität Projektion für Präsentationszwecke. Abbildung 3a zeigt qualitativ hochwertige Bilder wo neuronale Morphologie erscheint auf Vollständigkeit, Lärm minimiert und Schutt Interpretation der zellulären Morphologie nicht stört. Abbildung 3 b zeigt Bilder von geringerer Qualität, aufgrund einer geringeren Signal-Hintergrund-Verhältnis und erheblichen Rückstand. Diese Ablagerungen erscheint oft als kugelförmige Taschen der intensive Fluoreszenz, Auswurf von imaging-Farbstoff aus der Patch-Pipette beim Anflug auf der Zelle aus. Insbesondere, Aufnahme von 100 µM PA-Nic in der Badewanne (bei Bad Anwendung) neigt dazu, das Signal-Hintergrund-Verhältnis reduzieren und führt zu suboptimalen Bildkontrast. Alexa Fluor 568 oder 594 ist oft sehr nützlich bei lokaler Anwendung versuchen, als Finder Farbstoff oder als Normalisierung 2PE Referenz/Normalisierung Signal. Eine effektive Wellenlänge für zwei-Photon Erregung dieser Farbstoffe ist ~ 780 nm27, die gleichzeitige Visualisierung von PA-Nic und Identifizierung von zellulären Kompartimenten ermöglicht. Diese Wellenlänge, jedoch nicht vollständig zwei-Photonen-Photolyse von PA-Nic5vermeiden. Alexa Fluor 488 ist vorteilhaft in PA-Nic Bad-Anwendung Experimente; Wenn mit einer geeigneten Wellenlänge ≥900 nm angeregt, kann zwei-Photonen-Photolyse von PA-Nic5 unter Beibehaltung geeignete Visualisierung der zellulären Kompartimenten vermieden werden.
Abbildung 4 zeigt die Beispieldaten für lokalisierte PA-Nic Laser Flash Photolyse bei MHb Neuronen im Gehirnscheiben. Abbildung 4a (oberen Platten) zeigt ein Beispiel für ein "Referenz"-Image, das ist ein Screenshot des letzten 2PLSM Bildes vor Mäler Protokoll überlagert mit dem Foto-Stimulation vor Ort Standort ausgeführt wurde, getroffen. Abbildung 4a (untere Bild Platten) zeigt eine vergrößerte Ansicht der Foto-Stimulation vor Ort überlagert, die zellulären Morphologie. Die unteren Platten Abbildung4a zeigt die entsprechende Zeit korreliert elektrophysiologische Antwort auf PA-Nic Photolyse. Frühere Arbeiten gezeigt, dass diese Ströme nAChR Antagonisten5anfällig sind. Abbildung 4 b zeigt repräsentative Daten aus verschiedenen Zellen, wo einzelne spot Photolyse in einem Intervall von entweder 1 erfolgte, s oder 10 s. 10 s-Intervall ausreichend Erholungszeit für die Basislinie Haltestrom gestattet, ein kürzeres Intervall für 1 s führte zu einer schrittweise Erhöhung der Haltestrom als das Protokoll ging. Der ansteigende Strom legt nahe, dass Nikotin nicht genug Zeit haben, vom System mit 1 Hz Intervall29zu verbreiten. Diese zeitliche Antwort, die analysiert werden müssen durchgeführt de Novo auf jede neue Zelle Art untersucht, da die Neuropharmacology nAChRs zwischen Zelltypen unterscheiden kann.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58873/58873fig1.jpg"> Abbildung 1: Photostimulation Laser Kalibrierung. (ein) Foto-Stimulation Laser Ausgangsleistung. Macht auf die Probe-Ebene (durch ein 60 X / 1,0 NA Wasser eintauchen Ziel) wurde gemessen, für 405 nm und 473 nm-Foto-Stimulation-Laser bei der angegebenen Ausgabeeinstellung. (b) Foto-Stimulation Laser Kalibrierung. Screen Capture Bilder zeigen die räumliche Beziehung zwischen der beabsichtigten Foto-Stimulation und die entsprechende Position wo Foto-Stimulation aufgetreten (Burn-Loch) vor (links ist) und nach (rechts) laufenden Kalibrierung in Mäler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58873/58873fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58873/58873fig2.jpg"> Abbildung 2: lokale Anwendung PA-Nic. (ein) Erkennung von PA-Nic von einer lokalen Anwendung Pipette. 1 mM PA-Nic, Photolyse Nebenprodukt oder Nikotin in ACFS aufgelöst, in einer lokalen Anwendung Pipette geladen und verzichtet auf Gehirngewebe während 2PLSM (900 nm Anregung) imaging mit den gleichen bildgebenden Einstellungen für jedes Medikament. Laser-scanning-Dodt Kontrast Übertragung Bild zeigt die Gewebe/Pipette während eine GaAsP Kathode PMT verwendet wurde, um Fluoreszenzemission zu erfassen. (b) PA-Nic (1 mM) wurde in das Gehirngewebe durchblutet und abgebildet über 2PLSM wie (ein), die seitliche Ausbreitung von PA-Nic mit seiner intrinsische Fluoreszenz zeigen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58873/58873fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58873/58873fig3.jpg"> Abbildung 3: Erwerb der 2-Photonen-Laser-scanning-Mikroskopie Bilder. (ein) optimale 2PLSM Z-Stapel. Zwei Beispiele für 2PLSM Z-Stapel Beihilfehöchstintensität Projektionen sind gezeigt für MHb Neuronen mit gut gelöst Dendriten und wenig bis keine störenden Ablagerungen. (b) suboptimal 2PLSM Z-Stapel. Zwei Beispiele für 2PLSM Z-Stapel Beihilfehöchstintensität Projektionen sind für MHb Neuronen umgeben von Schutt (Farbstoff vertrieben aus der Pipette in Zelle Ansatz). Solche Bilder sind schwieriger zu interpretieren als Bilder wie in (einem) gezeigt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58873/58873fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58873/58873fig4.jpg"> Abbildung 4: Laser Flash Photolyse PA-NIC (ein) Mäler Referenz Bilder und nach innen Ströme, hervorgerufen durch PA-Nic Photolyse. Ein MHb Neuron werden roh Referenzbilder für Mäler Foto-Stimulation Versuche an einem Standort (angegebenen) zellulären gezeigt. Beachten Sie, dass für ein paar Foto-Stimulation Orte (das am weitesten rechts Bild in dieser Serie), die dendritische Struktur steht im Mittelpunkt der Soma und proximalen Dendriten nicht sind. Unter dem jeweiligen Referenzbild ist die Nikotin uncaging-evozierten nach innen aktuelle aufgetragen. (b) inter-Stimulus Intervalle für PA-Nic Photolyse. Vorbild-Aufnahmen sind zeigte für MHb Neuronen wo Nikotin wiederholt uncaged an der gleichen Stelle der Perisomatic mit einem inter-Stimulus-Intervall von 1 s oder 10 s. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58873/58873fig4large.jpg" target="_blank">Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Probing Nicotinic Acetylcholine Receptor Function in Mouse Brain Slices via Laser Flash Photolysis of Photoactivatable Nicotine at JoVE.com

Probing Nicotinic Acetylcholine Receptor Function in Mouse Brain Slices via Laser Flash Photolysis of Photoactivatable Nicotine

Dieser Artikel stellt eine Methode zur Untersuchung von Nikotinsäure Acetylcholin-Rezeptoren (nAChRs) in Maus Hirnschnitten von Nikotin uncaging. Wenn gepaart mit gleichzeitiger Patch Clamp Aufnahme und 2-Photonen-Laser-scanning-Mikroskopie, verbindet Nikotin uncaging Nikotinsäure Rezeptor-Funktion mit zellulären Morphologie, bietet ein tieferes Verständnis der cholinergen Neurobiologie.

Sondieren Nikotinsäure Acetylcholin-Rezeptor-Funktion in Maus Gehirnscheiben per Laser Flash Photolyse von Photoactivatable Nikotin

Acetylcholine (ACh) acts through receptors to modulate a variety of neuronal processes, but it has been challenging to link ACh receptor function with ...

Diese Technik nutzt die Multi-Photonen-Laserscanmikroskopie in Verbindung mit der Laserblitz-Photolyse eines photoaktivierbaren Nikotinmoleküls. Ermöglicht eine präzise Aktivierung von nicotinischen cholinergen Rezeptoren. Diese Technik ermöglicht eine feine spatiotemporale Kontrolle über Nikotinrezeptor-Agonistanwendung, bietet ein leistungsfähiges Werkzeug für die Untersuchung von Rezeptor-funktionellen Expressionsmustern und cholinerge Synaptik oder Volumenübertragung.Bevor Sie mit dem Verfahren beginnen, verwenden Sie einen programmierbaren Pipettenzieher, um eine Glasmikropipette mit einem Öffnungsdurchmesser von 20 bis 40 Mikrometern zu ziehen. Etwa einen Milliliter Aufnahmelösung durch einen 0,22-Mikron-Filter abseihen. Und resuspendieren Sie genug lyophilisiertes photoaktivierbares Nikotin in der gefilterten Aufnahmelösung, um eine zweimillimolarige Endkonzentration zu ergeben.Füllen Sie die gezogene lokale Anwendung Micropipette mit 50 Mikroliter des photoaktivierbaren Medikaments, und sichern Sie die Pipette in einem Pipettenhalter auf einem Mikromanipulator montiert. Schließen Sie den Pipettenhalter über eine entsprechende Rohrlänge an ein Druckauswurfsystem an, das eine nachhaltige Niederdruckanwendung kann. Und verwenden Sie den Mikromanipulator, um die lokale Anwendungspipette in die extrazelluläre Aufnahmelösung zu manövrieren.Positionieren Sie die Pipettespitze etwas über einer Maus-Hirngewebeprobe, etwa 50 Mikrometer von der Zelle des Interesses entfernt. Und kurz ein bis zwei Pfund pro Quadratzoll Druck auf die Pipette auftragen. Es sollte minimale bis keine Verschiebung der Zelle von Interesse sein.Nachdem Sie eine stabile Ganzzell-Patchklemme erreicht haben, schalten Sie die niedrige Anwendung auf der Druckauswurfvorrichtung ein und sättigen Sie das Gewebe, das die Zelle umgibt, für ein bis zwei Minuten mit photoaktivierbarem Nikotin. Lokale Anwendung führt zu zusätzlicher Komplexität in das Experiment. Aber es schont Verbindung und ermöglicht höhere Konzentrationen von PA-Nic verwendet werden.Für die Badanwendung des photoaktivierbaren Nikotins zunächst genug des lyophilisierten Arzneimittels in einer Aufzeichnungslösung auflösen, die für die kontinuierliche Rezirkulation in eine 100-Mikromolar-Endkonzentration geeignet ist. Und laden Sie das resultierende Gemisch in ein Perfusionssystem. Beginnen Sie dann mit der Rückführung der photoaktivierbaren Nikotinlösung mit einer Rate von 1,5 bis 2 Millimetern pro Minute, indem Sie Schläuche mit minimalem Innendurchmesser und Gesamtlänge verwenden, um das erforderliche Rezirkulationsvolumen zu minimieren.Während der Rezirkulation die Lösung kontinuierlich mit Carbogen sprudeln und die Badtemperatur bei schlechten Lichtverhältnissen bei 32 Grad Celsius halten. Bad Anwendung profitiert von der Einfachheit und Gleichmäßigkeit der PA-Nic Permeation des Gewebes. Aber es nutzt notwendigerweise niedrigere mikromolare PA-Nic-Konzentrationen, und verbraucht höhere Gesamtmengen an Verbindung.Zur Live-Visualisierung eines medialen Hatula-Neurons verwenden Sie durch Übertragendes Licht oder Infrarot-Differential-Interferenz-Kontrastoptik und eine Videokamera, um eine stabile, ganzzellige Patchklemmenaufzeichnung zu erstellen. Nach dem Einrichten der hochwiderstandsgebundenen Konfiguration mit Zellen, aber vor dem Einbruch, schalten Sie setup und Software in den Laser-Scan-Modus. Verwenden Sie nach dem Einbruch laserscanning, um zu überprüfen, ob der bildgebende Farbstoff von Interesse das Neuron passiv durch Diffusion füllt.Lassen Sie den Farbstoff die Zellfächer für mindestens 20 bis 30 Minuten füllen, bevor Sie die Live-Scan-Funktion verwenden, um das Neuron und das subzelluläre Fach von Interesse zu visualisieren. Wählen Sie bildgebende Parameter aus, die eine genaue Live-Visualisierung der neuronalen Features ermöglichen, indem Sie die entsprechenden Einstellungen bearbeiten, um die Anzeigevisualisierung, Auflösung, Signal-Rausch-Verhältnis und Bildbildbildaufnahmezeit bei Bedarf zu beeinflussen oder zu ändern. Um den Signalkontrast zu verbessern, öffnen Sie das Fenster des Nachschlagenstischs, und passen Sie die Einstellungen für den Nachschlagenstischboden und die Deckeneinstellung an.Um einen Bereich von Interesse innerhalb des Gewebes zu finden, wählen Sie den 1X optischen Zoom und verwenden Sie die Schwenksteuerungen. Verwenden Sie das Werkzeug Z-Serie, um eine Start- und Stoppposition auszuwählen, die die zu sehenswürdigkeitende Zelle enthält. Legen Sie eine Schrittgröße von einem Mikrometer fest, und wählen Sie eine Bildgröße aus, die ein Bild mit der höchsten Auflösung liefert.Oft 1, 024 x 1, 024 Pixel pro Linie. Dann nacheinander bilden Sie das Neuron in jeder Z-Ebene, die die Zelle enthält. Um die Laserstimulation zu kalibrieren, starten Sie das Systemscannen mit einer bildgebenden Laserleistung größer als minimal, und optimieren Sie den objektiven Fokus auf die dünne rote Markerfluoreszenzschicht.Wählen Sie einen Bereich innerhalb des Fluoreszenzfeldes frei von Schmutz und gleichmäßig mit Marker beschichtet, und öffnen Sie das Werkzeug-, Kalibrierungs- und Ausrichtungsmenü, um die unkaging galvocalibration-Funktion auszuwählen. Folgen Sie dem Brennfleck-Tutorial zur räumlichen Kalibrierung des zweiten Galvanometer-Spiegelpaares, wählen Sie den 405-Nanometer-Laser, eine Laserstimulationsleistung von 400 und eine Stimulationsdauer von 20 Millisekunden. Um Löcher mit einem bis fünf Mikrometern Durchmesser in den roten Marker zu geben.Wählen Sie Aktualisieren aus, um das Bild nach dem Brennen des mittleren Punkts zu stimulieren und zu aktualisieren, und verschieben Sie die runde rote Anzeige an die tatsächliche Spotposition der mittleren, rechten Mitte und der unteren Mitte, um ein Raster von neun Punkten zu erhalten. Um die Kalibrierung zu testen, öffnen Sie das Markierungspunktfenster und aktivieren Sie manuell die Stimulationsparameter der definierten Flecken in einem neuen Bereich der Probe, wobei darauf zu achten ist, dass die richtige neueste Kalibrierdatei in das Markierungspunktfenster geladen wird. Wenden Sie dann einen Testimpuls an, um die korrekte Kalibrierung zu überprüfen.Um den subzellulären Bereich kurz abzubilden und zu lokalisieren, wählen Sie Live-Scan aus und erhöhen Sie den optischen Zoom, um bei Bedarf kleine Strukturen zu visualisieren. Platzieren Sie das Markpunkt-Einpunkt-Fadenkreuz direkt neben der Zellmembran, und legen Sie die Photostimulationsparameter auf eine Dauer von 1 bis 50 Millisekunden, eine Laserleistung von einem bis vier Milliwatt und mindestens eine Studie fest. Wählen Sie dann Run-Mark-Punkte aus, um das Markierungspunktprotokoll zu initiieren, und beobachten Sie die datenerfassung der Elektrophysiologie in Echtzeit.Photoaktivierbare Nikotin-2PE-Fluoreszenz von einMillimolar PA-Nic wird leicht beim Druckauswerfen aus einer lokalen Anwendungspipette nachgewiesen. Während die Lieferung der wichtigsten photochemischen Produkte der photoaktivierbaren Nikotinphotolysereaktion kein fluoreszierendes Signal bei gleicher Konzentration und Anregungsleistung und Wellenlänge erzeugt. Demonstrieren der Spezifität der photoaktivierbaren Nikotinergebnisse.Die Abbildung des photoaktivierbaren Nikotins, das auf das Hirngewebe aufgetragen wird, wie gezeigt, zeigt das Vorhandensein des Arzneimittels innerhalb von 100 bis 200 Mikrometern der lokalen Anwendungspipette. Bestätigen, dass photoaktivierbares Nikotin effektiv über eine lokale Anwendung in das Hirngewebe abgegeben werden kann. Hier werden hochwertige Bilder gezeigt, in denen die neuronale Morphologie vollständig zu sein scheint, das Rauschen minimiert wird und der Schmutz die Interpretation der zellulären Morphologie nicht beeinträchtigt.Diese Bilder sind jedoch von geringerer Qualität. Aufgrund eines niedrigeren Signal-Hintergrund-Verhältnisses und erheblicher Trümmer. Die Kombination der zweiphotonen Laserscanning-Mikroskopie von medialen Habenula-Neuronen in Gehirnscheiben mit Laserblitz-Photolyse von PA-Nic, wie gezeigt, ermöglicht die Abstimmung von elektrophysiologischen Reaktionen mit der zellulären Morphologie.Eine Einzelpunkt-Photolyse, die in 10-Sekunden-Intervallen durchgeführt wird, ermöglicht eine ausreichende Erholungszeit für den Basishaltestrom. Während ein kürzeres Ein-Sekunden-Intervall zu einer allmählichen Erhöhung des Haltestroms führt, während das Protokoll fortfährt. Der Hinweis, dass das Nikotin nicht genügend Zeit hat, um mit den kürzeren Intervallen vom System wegzudiffuszusein.Bei der Entwicklung von Experimenten, die photoaktivierbare Moleküle verwenden, ist es wichtig, sich daran zu erinnern, fluoreszierende Indikatoren auszuwählen und Fluorophore mit kompatiblen Anregungsemissionsspektren zu melden. PA-Nic ist aufgrund seiner kurzwelligen Photolyse-Spitze mit den gängigsten Fluorophoren kompatibel. Bei der Wahl der am besten geeigneten PA-Nic Anwendungstechnik ist es wichtig, die funktionelle Expression, physiologische Aktivität der Nikotinrezeptoren in den Neuronen von Interesse sorgfältig zu berücksichtigen.Die geschickte Anwendung dieser Technik ermöglicht eine feine raumzeitliche Kontrolle der Nikotinanwendung, die aufregende neue Möglichkeiten zur Untersuchung der Kinetik der nativen Nikotinrezeptor-Interaktion, subzellulären Lokalisierung und Modulation der neuronalen Aktivität durch Nikotinrezeptaktivierung ermöglicht.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Flash Photolysis of Caged Compounds in the Cilia of Olfactory Sensory  Neurons

Flash-Photolyse von Caged Compounds in den Zilien der Riechzellen

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. ...

Forschung

Neurowissenschaften

Spectral Confocal Imaging of Fluorescently tagged Nicotinic Receptors in Knock-in Mice with Chronic Nicotine Administration

Spectral konfokale Bildgebung von fluoreszenzmarkierten Nikotinrezeptoren in Knock-in Mäusen mit chronischer Gabe von Nikotin

Ligand-gated ion channels in the central nervous system (CNS) are implicated in numerous conditions with serious medical and social consequences.  For ...

Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

Imaging Calcium Antworten in GFP-markierten Neuronen des Hypothalamus Maus Hirnschnitten

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the ...

Local Application of Drugs to Study Nicotinic Acetylcholine Receptor Function in Mouse Brain Slices

Lokale Anwendung von Medikamenten zur nikotinischen Acetylcholin-Rezeptor-Funktion in Maus Hirnschnitten Studie

Tobacco use leads to numerous health problems, including cancer, heart disease, emphysema, and stroke. Addiction to cigarette smoking is a prevalent ...

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

In-vivo-Elektroporation und Postnatale Zeitraffer-Imaging Neuroblast von Migration in Maus Akute Hirnschnitten

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to ...

Laser-guided Neuronal Tracing In Brain Explants

Lasergelenkte neuronale Tracing in Brain Explantate

We present a technique which combines an in vitro tracer injection protocol, which uses a series of electrical and pressure pulses to increase dye uptake ...

Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique

Imaging Serotonerge Fasern im Rückenmark der Maus Mit der CLARITY / CUBIC Technik

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal ...

Studying Brain Function in Children Using Magnetoencephalography

Studium der Funktion des Gehirns bei Kindern mit Magnetoenzephalographie

Magnetoencephalography (MEG) is a non-invasive neuroimaging technique which directly measures magnetic fields produced by the electrical activity of the ...

Chronic Implantation of Whole-cortical Electrocorticographic Array in the Common Marmoset

Chronische Implantation des gesamten kortikalen Electrocorticographic Arrays in der Weißbüschelaffe

Electrocorticography (ECoG) allows the monitoring of electrical field potentials from the cerebral cortex with high spatiotemporal resolution. Recent ...