Name: probing nicotinic acetylcholine receptor function in mouse brain slices via laser flash photolysis of photoactivatable nicotine
Uploaded: 2019-01-25T13:00:00
Duration: 10 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Probing Nicotinic Acetylcholine Receptor Function in Mouse Brain Slices via Laser Flash Photolysis of Photoactivatable Nicotine at JoVE.com

המחברים תודה מעבדה חברי החוקרים העיקרי מערבי הבאים: ריאן Drenan, ד ג'יימס Surmeier, יבגניה Kozorovitskiy ו קבלן אניס. עבודה זו נתמכה על ידי אותנו במכון הלאומי של בריאות (NIH) (מענקים DA035942 ו- DA040626 כדי R.M.D.), חברת פארמה קרן (מלגת אל תיתן) ו HHMI.

<ol>
	<li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholinergic+tone+in+ventral+tegmental+area:+Functional+organization+and+behavioral+implications.">Cholinergic tone in ventral tegmental area: Functional organization and behavioral implications.</a> Neurochemistry International. 114, 127-133 (2018).</li><li>Sarter, M., Parikh, V., Howe, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phasic+acetylcholine+release+and+the+volume+transmission+hypothesis:+time+to+move+on.">Phasic acetylcholine release and the volume transmission hypothesis: time to move on.</a> Nature Reviews Neuroscience. 10 (5), 383-390 (2009).</li><li>Coyle, J. T., Price, D. L., DeLong, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's+disease:+a+disorder+of+cortical+cholinergic+innervation.">Alzheimer's disease: a disorder of cortical cholinergic innervation.</a> Science. 219 (4589), 1184-1190 (1983).</li><li>Katz, B., Thesleff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+study+of+the+desensitization+produced+by+acetylcholine+at+the+motor+end-plate.">A study of the desensitization produced by acetylcholine at the motor end-plate.</a> Journal of Physiology. 138 (1), 63-80 (1957).</li><li>Banala, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoactivatable+drugs+for+nicotinic+optopharmacology.">Photoactivatable drugs for nicotinic optopharmacology.</a> Nature Methods. 15 (5), 347-350 (2018).</li><li>Yan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotinic+Cholinergic+Receptors+in+VTA+Glutamate+Neurons+Modulate+Excitatory+Transmission.">Nicotinic Cholinergic Receptors in VTA Glutamate Neurons Modulate Excitatory Transmission.</a> Cell Reports. 23 (8), 2236-2244 (2018).</li><li>Engle, S. E., Shih, P. Y., McIntosh, J. M., Drenan, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#945;4&#945;6&#946;2*+nicotinic+acetylcholine+receptor+activation+on+ventral+tegmental+area+dopamine+neurons+is+sufficient+to+stimulate+a+depolarizing+conductance+and+enhance+surface+AMPA+receptor+function.">&#945;4&#945;6&#946;2* nicotinic acetylcholine receptor activation on ventral tegmental area dopamine neurons is sufficient to stimulate a depolarizing conductance and enhance surface AMPA receptor function.</a> Molecular Pharmacology. 84 (3), 393-406 (2013).</li><li>Engle, S. E., Broderick, H. J., Drenan, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+application+of+drugs+to+study+nicotinic+acetylcholine+receptor+function+in+mouse+brain+slices.">Local application of drugs to study nicotinic acetylcholine receptor function in mouse brain slices.</a> Journal of Visualized Experiments. (68), (2012).</li><li>Ren, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Habenula+&amp;#34;cholinergic&amp;#34;+neurons+co-release+glutamate+and+acetylcholine+and+activate+postsynaptic+neurons+via+distinct+transmission+modes.">Habenula &amp;#34;cholinergic&amp;#34; neurons co-release glutamate and acetylcholine and activate postsynaptic neurons via distinct transmission modes.</a> Neuron. 69 (3), 445-452 (2011).</li><li>Koppensteiner, P., Melani, R., Ninan, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Cooperative+Mechanism+Involving+Ca(2+)-Permeable+AMPA+Receptors+and+Retrograde+Activation+of+GABAB+Receptors+in+Interpeduncular+Nucleus+Plasticity.">A Cooperative Mechanism Involving Ca(2+)-Permeable AMPA Receptors and Retrograde Activation of GABAB Receptors in Interpeduncular Nucleus Plasticity.</a> Cell Reports. 20 (5), 1111-1122 (2017).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+Excitation+via+GABAB+Receptors+in+Habenula+Cholinergic+Neurons+Regulates+Fear+Memory+Expression.">Presynaptic Excitation via GABAB Receptors in Habenula Cholinergic Neurons Regulates Fear Memory Expression.</a> Cell. 166 (3), 716-728 (2016).</li><li>Chen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+Baseline+and+Nicotine-Mediated+Behavioral+and+Cholinergic+Profiles+in+ChAT-Cre+Mouse+Lines.">Altered Baseline and Nicotine-Mediated Behavioral and Cholinergic Profiles in ChAT-Cre Mouse Lines.</a> The Journal of Neuroscience. 38 (9), 2177-2188 (2018).</li><li>Nagy, P. M., Aubert, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+the+vesicular+acetylcholine+transporter+increased+acetylcholine+release+in+the+hippocampus.">Overexpression of the vesicular acetylcholine transporter increased acetylcholine release in the hippocampus.</a> Neuroscience. 218, 1-11 (2012).</li><li>Ting, J. T., Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombineering+strategies+for+developing+next+generation+BAC+transgenic+tools+for+optogenetics+and+beyond.">Recombineering strategies for developing next generation BAC transgenic tools for optogenetics and beyond.</a> Frontiers in Behavioral Neuroscience. 8, 111 (2014).</li><li>Crittenden, J. R., Lacey, C. J., Lee, T., Bowden, H. A., Graybiel, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severe+drug-induced+repetitive+behaviors+and+striatal+overexpression+of+VAChT+in+ChAT-ChR2-EYFP+BAC+transgenic+mice.">Severe drug-induced repetitive behaviors and striatal overexpression of VAChT in ChAT-ChR2-EYFP BAC transgenic mice.</a> Frontiers in Neural Circuits. 8, 57 (2014).</li><li>Kolisnyk, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChAT-ChR2-EYFP+mice+have+enhanced+motor+endurance+but+show+deficits+in+attention+and+several+additional+cognitive+domains.">ChAT-ChR2-EYFP mice have enhanced motor endurance but show deficits in attention and several additional cognitive domains.</a> The Journal of Neuroscience. 33 (25), 10427-10438 (2013).</li><li>Nagy, P. M., Aubert, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+the+vesicular+acetylcholine+transporter+enhances+dendritic+complexity+of+adult-born+hippocampal+neurons+and+improves+acquisition+of+spatial+memory+during+aging.">Overexpression of the vesicular acetylcholine transporter enhances dendritic complexity of adult-born hippocampal neurons and improves acquisition of spatial memory during aging.</a> Neurobiology of Aging. 36 (5), 1881-1889 (2015).</li><li>Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+scanning+photochemical+microscopy:+mapping+ligand-gated+ion+channel+distributions.">Two-photon scanning photochemical microscopy: mapping ligand-gated ion channel distributions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (14), 6629-6633 (1994).</li><li>Khiroug, L., Giniatullin, R., Klein, R. C., Fayuk, D., Yakel, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+mapping+and+Ca2++regulation+of+nicotinic+acetylcholine+receptor+channels+in+rat+hippocampal+CA1+neurons.">Functional mapping and Ca2+ regulation of nicotinic acetylcholine receptor channels in rat hippocampal CA1 neurons.</a> The Journal of Neuroscience. 23 (27), 9024-9031 (2003).</li><li>Filevich, O., Salierno, M., Etchenique, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+caged+nicotine+with+nanosecond+range+kinetics+and+visible+light+sensitivity.">A caged nicotine with nanosecond range kinetics and visible light sensitivity.</a> Journal of Inorganic Biochemistry. 104 (12), 1248-1251 (2010).</li><li>Tochitsky, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optochemical+control+of+genetically+engineered+neuronal+nicotinic+acetylcholine+receptors.">Optochemical control of genetically engineered neuronal nicotinic acetylcholine receptors.</a> Nature Chemistry. 4 (2), 105-111 (2012).</li><li>Wokosin, D. L., Squirrell, J. M., Eliceiri, K. W., White, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+workstation+with+concurrent,+independent+multiphoton+imaging+and+experimental+laser+microbeam+capabilities.">Optical workstation with concurrent, independent multiphoton imaging and experimental laser microbeam capabilities.</a> Review of Scientific Instruments. 74 (1), 193-201 (2003).</li><li>Plotkin, J. L., Day, M., Surmeier, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptically+driven+state+transitions+in+distal+dendrites+of+striatal+spiny+neurons.">Synaptically driven state transitions in distal dendrites of striatal spiny neurons.</a> Nature Neuroscience. 14 (7), 881-888 (2011).</li><li>Galtieri, D. J., Estep, C. M., Wokosin, D. L., Traynelis, S., Surmeier, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pedunculopontine+glutamatergic+neurons+control+spike+patterning+in+substantia+nigra+dopaminergic+neurons.">Pedunculopontine glutamatergic neurons control spike patterning in substantia nigra dopaminergic neurons.</a> Elife. 6, (2017).</li><li>Yasuda, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+calcium+concentration+dynamics+in+small+neuronal+compartments.">Imaging calcium concentration dynamics in small neuronal compartments.</a> Science STKE. (219), pl5 (2004).</li><li>Inoue, S., Spring, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Video microscopy: The fundamentals. , 163-186 (1997).</li><li>Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonlinear+magic:+multiphoton+microscopy+in+the+biosciences.">Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences.</a> Nature Biotechnology. 21 (11), 1369-1377 (2003).</li><li>Maravall, M., Mainen, Z. F., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimating+intracellular+calcium+concentrations+and+buffering+without+wavelength+ratioing.">Estimating intracellular calcium concentrations and buffering without wavelength ratioing.</a> Biophysical Journal. 78 (5), 2655-2667 (2000).</li><li>Wathey, J. C., Nass, M. M., Lester, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Numerical+reconstruction+of+the+quantal+event+at+nicotinic+synapses.">Numerical reconstruction of the quantal event at nicotinic synapses.</a> Biophysical Journal. 27 (1), 145-164 (1979).</li><li>Shih, P. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+and+function+of+nicotinic+acetylcholine+receptors+in+subdivisions+of+medial+habenula.">Differential expression and function of nicotinic acetylcholine receptors in subdivisions of medial habenula.</a> The Journal of Neuroscience. 34 (29), 9789-9802 (2014).</li><li>Verhoog, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Layer-specific+cholinergic+control+of+human+and+mouse+cortical+synaptic+plasticity.">Layer-specific cholinergic control of human and mouse cortical synaptic plasticity.</a> Nature Communications. 7, 12826 (2016).</li><li>Koukouli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotine+reverses+hypofrontality+in+animal+models+of+addiction+and+schizophrenia.">Nicotine reverses hypofrontality in animal models of addiction and schizophrenia.</a> Nature Medicine. 23 (3), 347-354 (2017).</li><li>Xiao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+nicotine+selectively+enhances+&#945;4&#946;2*+nicotinic+acetylcholine+receptors+in+the+nigrostriatal+dopamine+pathway.">Chronic nicotine selectively enhances &#945;4&#946;2* nicotinic acetylcholine receptors in the nigrostriatal dopamine pathway.</a> The Journal of Neuroscience. 29 (40), 12428-12439 (2009).</li><li>Peng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Editing+Vectors+for+Studying+Nicotinic+Acetylcholine+Receptors+in+Cholinergic+Transmission.">Gene Editing Vectors for Studying Nicotinic Acetylcholine Receptors in Cholinergic Transmission.</a> European Journal of Neuroscience. , (2018).</li></ol>

D.L.W. משמש כיועץ בשכר של ברוקר ננו פלורסצנטיות מיקרוסקופ.

הבחירה של שיטת יישום/מסירה של הרשות הפלסטינית-Nic היא השלב הקריטי ביותר בטכניקה זו צילום מקומי-גירוי. שתי השיטות, אמבט יישום זלוף מקומיים, אחד מציעים יתרונות ומגבלות. הבחירה מושפע במידה רבה רמת הביטוי פונקציונלי nAChR בסוג התא עניין. לעיתים קרובות עדיף להשתמש ביישום אמבט כאשר הביטוי פונקציונלי רמות גבוהות, כמו אמבט היישום מאפשר ריכוז בדיקה אחידה סביב התא מוקלטות, דבר המקל על פרשנות הנתונים. אמבט היישום גם מבטלת את הצורך פיפטה זלוף השני בתוך הרקמה, המקל על התהליך כולו. עם זאת, יישום אמבט של יקר תרכובות עולה יותר לכל ניסוי.
בדרך כלל, פתרון בעיות כרוך מנסה להבין למה אין הפעלת nAChR היא לראות הבאים פלאש פוטוליזה. בעת עבודה עם סוג התא לא היה בעבר למדה עם הרשות הפלסטינית-Nic, החוקר צריך לבצע פאף-יישום מקומי של ACh או ניקוטין כדי לקבוע אם מספיק רצפטורים פונקציונלית הביע5. כדי לאמת כי המערכת היא מסוגלת לאתר פוטוליזה תגובות, בקרת ניסויים צריך להיעשות בנוירונים habenula המדיאלי לבטא כמויות גדולות של קולטן30. באזור זה של המוח, הרשות הפלסטינית-Nic אמבט יישום אפשרי, אשר עדיפה לניסויים אימות. רק לאחר ביצוע ניסויים אימות אלה צריך אחד לעבור מסוג תא מחקר כלשהו. אם מערכת ניסויית אומתה ולהישאר תגובות מאד קטנה, או לא לגילוי, זה עשוי להיות מוצדקת כדי להגביר את הריכוז של הרשות הפלסטינית-Nic, להגביר את עוצמת פלאש או משך פעימה, להוסיף אפנן חיובי nAChR allosteric כדי לשפר את nAChR פעילות6, או שילוב של אלה.
לעיתים, תגובות uncaging גדולים מדי, עם הפעלת nAChR משמעותי וכתוצאה מכך מתח עקיף מגודרת Na+ ערוץ הפעלה וזרמים פנימה unclamped עקב ענייה שטח קלאמפ. ניתן לסלק לכלוכים אלה, אשר לחלוטין מטשטשים זרמי פנימה nAChR, לעשות פרשנות הנתונים בלתי אפשרי, על ידי הכללת QX-314 (2 מ מ) בפיפטה ההקלטה. הם עשויים להימחק גם על-ידי הפחתת הריכוז של הרשות הפלסטינית-Nic או על-ידי הפחתת בעוצמה פלאש או משך פעימה. בניסויים צילום-גירוי אור לעין כל, החייבים אימון טיפול בעת בחירת אתרי גירוי כדי למנוע גירוי לא מכוונות/פוטוליזה מעל או מתחת למטוס מוקד הרצוי. בנוסף, בעת הצורך, עוצמת הלייזר חייב תמיד להיות טיטרציה להתרבות תגובות פיזיולוגיות. במיוחד חשוב להיות מודעים photostimulation ציר z, כאשר עובדים עם ליגנדים בכלוב, כמו ליגנדים אשר מופעלים מעל/מתחת נקודת מוקד עדיין ייתכן לפזר ולקיים אינטראקציה עם מערכת ביולוגית (קרי קולטנים, ) שנבחנה.
הרשות הפלסטינית-Nic לייזר פלאש פוטוליזה לא ייתכן המתאימה עבור כל החוקרים, כפי קיימות מספר מגבלות. הראשון הוא העלות הגבוהה יחסית של תרגיל מתאים. בעת עבודה עם פרוסות המוח ללא פגע, uncaging ליד מבנים בקוטר קטן כמו דנדריטים דורש מערכת הדמיה מתוחכמות כגון מיקרוסקופ 2-פוטון. מלבד העלות הגבוהה של Ti:sapphire, tunable IR לייזר פעמו עבור ביצוע 2-פוטון מיקרוסקופ, מערכת כפולה-גלוונומטר מסוגל באופן עצמאי מיצוב שתי קרני לייזר נוסף מגדיל את עלות המערכת. מערכת כוללת עלויות ניתן לצמצם באמצעות מערכת מתוצרת בית, אם החוקר מספיק מתמחה ובעל זמן לבנות, פתרון בעיות, ולשמור על מערכת כזו. מגבלה נוספת לעתים קרובות כרוך הביטוי פונקציונלי nAChR נמוך, אשר יכולה להיות חלקית חמאני נקיטת פעולות כאמור לעיל, אבל זה אינו מבטיח הצלחה. בדרך כלל, אם אי אפשר למדוד זרמים מופעל ליגנד בעקבות פאף-בקשה של אגוניסטים, הרשות הפלסטינית-Nic פלאש פוטוליזה תחת מתח קלאמפ לא תניב תוצאות מתקבלות על הדעת. מגבלה שלישית כרוכה מהותי זריחה של הרשות הפלסטינית-nic. הרשות הפלסטינית-Nic סופג אור ~ 405 ננומטר ויפלטו בטווח דומה חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) או אלקסה 4885. הרשות הפלסטינית-Nic ריכוזים חורגים ~ 1 מ מ, מאפיין זה קרינה פלואורסצנטית יכול לעשות את זה מאתגר בו-זמנית להמחיש מבנים עצביים. כדי להמתיק את זה, זה קריטי כדי להיות מסוגל לשלוט בקלות את הזרימה של הרשות הפלסטינית-Nic מ פיפטה זלוף. מעת לעת, הזרימה הרשות הפלסטינית-Nic הופסק כדי לאפשר מולקולות פלורסנט לנטרל את זה משם. זה מותר מחדש הדמיה של הנוירון לבדיקת המיקום ספוט של קרן uncaging. מגבלה פוטנציאליים הרביעי להזכיר כרוכה בשימוש של 405 ננומטר אור עבור פוטוליזה. באורכי גל קצרים יותר כגון 405 ננומטר נוטים יותר הפיזור ברקמות מורכבות כגון פרוסה המוח. לפיכך, נתון ההבזקה, משך, uncaging amplitudes התגובה וקינטיקה דעיכה באופן שונה מושפעת העומק של המוקד uncaging בתוך הפרוסה. מסקנות על היבטים ביולוגיים nAChRs צריך לקחת זה הקונה חשובים בחשבון.
זו טכניקה פלאש פוטוליזה לייזר מקומי לאחרונה שימש לחשוף פרטים חדשים אודות נוירוביולוגיה nAChR. לדוגמה, חשיפה כרונית ניקוטין מגבירה את perisomatic ואת nAChR דנדריטים פונקציה habenula המדיאלי נוירונים5. היא שימשה גם כדי לסייע בהמחשת, בפעם הראשונה, כי אזור הטגמנטום הגחוני גלוטמט נוירונים להביע nAChRs תפקודית שלהם perisomatic, תאים דנדריטים הסלולר6. ישנם שרבים הפוטנציאל בעתיד שימושים של טכניקה זו, וכל הגישה יכול לחול על סוגים אחרים של הנוירון מפתח הידועות nAChRs אקספרס, כגון נוירונים בקליפת המוח כפירמידה31 או interneurons של קליפת המוח32סטריאטום33 , ההיפוקמפוס19. טכניקה זו יכול גם להיות משולב עם הגן פרמקולוגיה ו/או nAChR עריכה34 כדי להתאים לשפה קולטן ספציפי יחוברו אל תאים עצביים שונים. הגישה עשוי להיות מותאם בקלות תרכובות אחרות קומרין כלואים, לרבות אך לא רק, אלה שפותחו במקביל עם הרשות הפלסטינית-Nic5. לבסוף, הרשות הפלסטינית-Nic פלאש פוטוליזה אולי יום אחד לשמש חיה ער/מתנהג ללמוד הפעולה של ניקוטין פרדיגמות הרומן פרמקולוגיה התנהגותית.

שימוש באיתות ממיקרו תהליכים מוחיים רבים, כולל שליטה כל מעסיק, תנועה ופרסומיה פרס1,2. תרופות המשפרים את שידור אצטילכולין (ACh) משמשים לטיפול ליקוי קוגנטיבי הקשורים עם מחלת אלצהיימר, רומז תפקיד חשוב עבור מערכות שימוש קוגניציה3. הבנה משופרת של קולטנים שימוש ואת המעגלים במצבים בריאים וחולים עלול להוביל יותר גישות טיפוליות עבור מספר מחלות/הפרעות נוירולוגיות.
ACh nicotinic קולטנים (nAChRs) הם משפחה של תעלות יונים ממותגת ליגנד זה שטף קטיונים בתגובה אנדוגני ACh או ניקוטין אקסוגני של מוצרי טבק. בהתחשב בעובדה כי הם היו בין קולטני עצבי הראשון שתואר4, פרמקולוגיה nAChR מיקום בתוך סיבי השריר הוא מובנות על רצפטורים שרירים-סוג. לעומת זאת, יחסית מעט מאוד ידוע על פרמקולוגיה, subcellular והפצה של יליד nAChRs במוח. פער זה מתוך ידיעה זו נדונה לאחרונה על ידי פיתוח מכשיר בדיקה כימית הרומן המאפשר הפעלה במרחב מוגבל ומהירה של nAChRs ברקמת המוח במהלך דימות הסלולר, הקלטה אלקטרופיזיולוגיות5. . הנה, השלבים מתודולוגי המפתח מעורבים בגישה זו מתוארים, עם המטרה הכוללת של שיפור היכולת להתחבר nAChR פונקציה עם מבנה עצביים.
Photoactivatable ניקוטין (PA-Nic; שם כימי: 1-[7-[bis(carboxymethyl)-אמינו] קומרין-4-yl] מתיל-ניקוטין) יכול להיות photolyzed עם ~ 405 ננומטר לייזר הבזקים לשחרר ביעילות ניקוטין5,6. לפני uncaging, הרשות הפלסטינית-Nic יציב בפתרון ותערוכות לא רע לא תרופתי או פוטו אטמוספרי תכונות5. לאחר פוטוליזה, שפורסמו ניקוטין מפעיל כצפוי nAChRs, uncaging לוואי פרמקולוגית אינרטי5. לייזר מכ משמש מקור האור פוטוליזה עם כוח פלט > 1 mW נמדד ב המדגם. כאשר מקומי, צילום יישוב-גירוי בשילוב עם היכולת לאתר ממברנות הסלולר עם לייזר הפוטונים 2 סריקה מיקרוסקופ (2PLSM), שני יתרונות מרכזיים של גישה זו הם הבינו במלואם: פוטוליזה מהירות ודיוק מרחבית.
בכל הכבוד, פוטוליזה של הרשות הפלסטינית-Nic עדיפה בשיטות אחרות של העברת nAChR ליגנדים לקולטנים בתוך פרוסות המוח. גישות כאלה כוללים אמבט יישום7 , סמים מקומי משלוח באמצעות פיפטה puffer8. בעוד הגישה נוטה להדגיש יתר על המידה את ההשפעות ארוכות הטווח של הסם יישומית, הצגנו יכולה סובלים השתנות ב קינטיקה התגובה בין ניסויים על-פני תאים. גם גישות חלופיות אלה יכולים להבחין שלמאחה קולטן הפעילויות במיקומים שונים הסלולר של נוירון אותו. מופעל Optogenetically שחרור ACh שימש במשך החקירה של יליד nAChRs9,10,11, אבל זה לא הוכיח שימושי עבור מיפוי subcellular nAChR מקומות. יתר על כן, רוב המחקרים ניצול גישה זו צריכים לסמוך על הבעת ChR2 חיידקי מלאכותי כרומוזום עכבר עם שידור שימוש חריג12,13,14, 15 , 16 , 17.
הרשות הפלסטינית-Nic פוטוליזה אינה הגישה אופטי רק ללמוד שימוש קולטנים. Carbachol בכלובים שימש למיפוי פונקציונלית ACh פעילות הקולטן תאים בתרבית18 ו המוח פרוסות19, אבל לא היה זמינים מסחרית עבור מחקרים השוואתיים, במהלך הפיתוח של הרשות הפלסטינית-nic. Bis רותניום (bipyridine)-ניקוטין מורכבים (RuBi-ניקוטין) דווח כדי לאפשר uncaging ניקוטין20, אבל ההכנות מסחרי של רובי-ניקוטין הוכיחה הרשות הפלסטינית-Nic נחות בהשוואה עפות ללמוד5. זה עשוי להיות שימושי לחזור על ניסויים אלה השוואתית עם מסחרי, מאוד מטוהרים RuBi-ניקוטין, כמו בליעה גלוי יכול להחמיא התכונות של הרשות הפלסטינית-Nic ללימודי שימוש. לבסוף, nAChRs יש גם שטיחות תומרנו באמצעות שילוב של קולטנים מהונדס גנטית21של ליגנדים צילום-להחלפה. גישה זו היא משלימה את הרשות הפלסטינית-Nic פוטוליזה ברקמת המוח, עם הדרישה/היכולת של התמקדות גנטי nAChR ששונה לראות גם יתרון וגם חיסרון.
ראוי לציין מספר דרישות המפתח של גישה זו. ראשית, שיטת הדמיה המתאימה נחוץ כדי לאתר במדויק את הקרום עצביים. הדמיה עם מיקרוסקופ אפינפרין קונבנציונלי-ידי קרינה פלואורסצנטית עשוי להיות מספיק כשלמדתי תאים בתרבית, אך עבור הקלטה של נוירונים במוח פרוסות או תכשירים אחרים רקמות עבות, 2PLSM או מיקרוסקופיה קונפוקלית היא דרישה. שנית, שיטה מתאימה יש צורך למקם את קרן הלייזר פוטוליזה. גישה זו מנצל ראש כפול-גלוונומטר סריקה עם שתי מראות עצמאיות x-y עבור סריקה סריקה של קרן הדמיה, נקודת photoactivation באמצעות uncaging לייזר קרן22,23,24. פתרונות מוגבלת יותר אפשריות, כגון (1) ראש חד-גלוונומטר סריקה כי לחלופין רסטר סורקת קרן הדמיה, קרן uncaging, או פשוט (2) בבימוי קרן uncaging למרכז שדה הראייה כך התא הוא הביא עמדה זו עבור פלאש פוטוליזה. שלישית, מערכת נדרש אלקטרופיזיולוגיות הקלטה סימולטני אם אדם רוצה לאסוף אותות פיזיולוגיים במהלך הניסויים. הדרישות לעיל ניתן נפגשו עם טכניקה מתאימה כל-אופטיים הדמיה, כמו תיאר לאחרונה5. להלן, פרוטוקול מפורט נכלל זה מתאר את השלבים החשובים של גישה זו.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Instruments, Consumables, and Miscellaneous Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiclamp 700B</td>
			<td>Molecular Devices Corp.</td>
			<td></td>
			<td>Patch clamp amplifier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pneumatic Picopump</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>PV820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instrument Co</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature Controller</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>TC-324C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibrating blade microtome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>VT1200S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrafree-MC Centrifugal Filter</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>UFC30GV0S</td>
			<td>internal solution filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass Capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B150F-4</td>
			<td>patch and local application pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(-)-Nicotine hydrogen tartrate salt</td>
			<td>Glentham</td>
			<td>GL9693</td>
			<td>nicotine salt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7-carboxymethylamino-4-methyl coumarin</td>
			<td>Janelia Research Campus</td>
			<td></td>
			<td>PA-Nic by-product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-[7-[bis(carboxymethyl)- amino]coumarin-4-yl]methyl-nicotine</td>
			<td>Janelia Research Campus</td>
			<td></td>
			<td>PA-Nic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Euthasol (Pentobarbital Sodium and Phenytoin Sodium)</td>
			<td>Virbac</td>
			<td>ANADA #200-071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa FluorTM 488 Hydrazide</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A10436</td>
			<td>green fill dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa FluorTM 568 Hydrazide</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A10437</td>
			<td>red fill dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-carboxy-AF594 (Alexa Fluor 594)</td>
			<td>Janelia Research Campus</td>
			<td></td>
			<td>red fill dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX 314 chloride</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2313</td>
			<td>voltage-gated sodium channel blocker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power Meter&#160;</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>S120C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals for Solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Methyl-D-glucamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic monohydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(+)-Sodium L-ascorbate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiourea</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>230391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>223506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&#8242;,N&#8242;-tetraacetic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8242;-triphosphate magnesium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanosine 5&#8242;-triphosphate sodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Components of 2-Photon Microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Ultima Laser Scanner for Olympus BX51 Microscope</td>
			<td>Bruker Nano, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>imaging software and galvos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160; Imaging X-Y galvanometers</td>
			<td>Cambridge Technology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Mai Tai HP1040</td>
			<td>Spectra-Physics</td>
			<td></td>
			<td>Tuneable IR laser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; &#160;&#160;&#160;&#160;&#160;Pockels cell M350-80-02-BK with M302RM Driver</td>
			<td>Conoptics, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>for IR laser attenuation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Integrating Sphere Photodiode Power Sensor</td>
			<td>Thorlabs, Inc</td>
			<td></td>
			<td>laser power pick-off photodiode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160; Uncaging X-Y galvanometers</td>
			<td>Cambridge Technology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Helios 2-Line Laser Launch</td>
			<td>Bruker Nano, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>uncaging laser components</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; OBIS LX/LS 405 nm (100 mW)</td>
			<td>Coherent, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; OBIS LX/LS 473 nm (75 mW)</td>
			<td>Coherent, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; &#160;Point-Photoactivation / Fiber Input Module for Limo Sidecar - Uncaging</td>
			<td>Bruker Nano, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upright Microscope</td>
			<td>&#160;Olympus</td>
			<td>BX51WIF</td>
			<td>Upright microscope chasis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160; Objective: Olympus M Plan FL 10x; NA 0.3 WD 11 mm</td>
			<td>&#160;Olympus</td>
			<td></td>
			<td>10x objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160; Objective: Olympus M Plan Fluorite 60x/1.0 WD=2mm NIR</td>
			<td>&#160;Olympus</td>
			<td></td>
			<td>60x water-dipping objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160; X-Cite 110, four-LED LLG coupled epi-fluorescence light source</td>
			<td>Excelitas Technologies</td>
			<td></td>
			<td>LED Light Source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Epi-Fluorescence Filter: ET-GFP (FITC/CY2) for Epi-Turret</td>
			<td>Chroma Technologies</td>
			<td></td>
			<td>LED Filter for blue light excitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Epi-Fluorescence Filter: ET-DsRed (TRITC/CY3) for Epi-Turret</td>
			<td>Chroma Technologies</td>
			<td></td>
			<td>LED Filter for green light excitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160; B&#38;W CCD camera; Watec, 0.5in B/W CCD</td>
			<td>Watec Co., LTD.</td>
			<td></td>
			<td>CCD camera for patch clamp recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>External Detectors - Dual Reflected Emission - Olympus Upright (Multi-Alkali, GaAsP)</td>
			<td>Bruker Nano, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160; Multi-alkali side-on PMT</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>R3896</td>
			<td>red channel PMT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 595/50m</td>
			<td>Chroma Technologies</td>
			<td></td>
			<td>red channel emission filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 565lpxr</td>
			<td>Chroma Technologies</td>
			<td></td>
			<td>dichroic beam splitter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160; GaAsP end-on PMT</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>7422PA-40</td>
			<td>green channel PMT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 525/70m</td>
			<td>Chroma Technologies</td>
			<td></td>
			<td>green channel emission filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; High-Speed Shutter for Hamamatsu H7422 PMT</td>
			<td>Vincent Associates / Bruker</td>
			<td>517329</td>
			<td>PMT shutter mount</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dodt Gradient Contrast Transmission Detection Module</td>
			<td>Bruker Nano, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160; Multi-alkali side-on PMT</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>R3896</td>
			<td>Dodt PMT</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

probing nicotinic acetylcholine receptor function in mouse brain slices via laser flash photolysis of photoactivatable nicotine

אצטילכולין (ACh) פועל באמצעות קולטנים לווסת מגוון רחב של תהליכים עצביים, אבל זה מאתגר לקשר ACh פונקציה קולטן עם subcellular מיקום בתוך התאים שם פונקציה זו מבוצעת. ללמוד את המיקום subcellular של הקולטנים ACh nicotinic (nAChRs) בתוך רקמת המוח מקורית, פותחה שיטה אופטית לשחרור מדויק של ניקוטין מקומות דיסקרטית ליד ממברנות העצבית במהלך הקלטות אלקטרופיזיולוגיות. תיקון מהודקי נוירונים במוח פרוסות מלאים לצבוע כדי להמחיש את המורפולוגיה שלהם במהלך מיקרוסקופ לייזר הפוטונים 2 סריקה, ניקוטין uncaging מתבצע בעזרת הבזק אור על ידי התמקדות קרן לייזר 405 ננומטר ליד אחד או יותר ממברנות הסלולר. Deflections הנוכחי הסלולר נמדדים, תמונה (3D) תלת-ממדית ברזולוציה גבוהה של מוקלטת הנוירון עשוי לאפשר התאמה של תגובות nAChR עם מורפולוגיה הסלולר. שיטה זו מאפשרת ניתוח מפורט של התפלגות פונקציונלי nAChR רקמות מורכבות ההכנות, מבטיח לשפר את ההבנה של שימוש עצבית.

עבור פוטוליזה גירוי, מינון החשיפה (עוצמה וזמן), חשיפה, והמיקום קרן הגיאומטריה הם משתני מפתח. המערכת המתוארות במאמר זה הוא מסוגל שתי הקורות photostimulation שונים, הניתנים לשינוי באמצעות הזזת עדשה וצ'ק אאוט של נתיב האור photostimulation לפני הקורה נכנס למערכת גלוונומטר. ללא עדשה זו, קרן photostimulation ממלא את התלמיד הכניסה של 60 x / נה 1.0 מים-טבילה [60 x WD] המטרה, בהפקת ליד-עקיפה-מוגבל, sub-מיקרומטר ספוט על המטוס מוקד בתוך המדגם. זה משויך photostimulation אור עם צורת שעון החול, הרחבת מעל ומתחת נקודת מוקד סימטרי לציר האופטי. עם העדשה מוכנס לתוך הנתיב, photostimulation אור לייזר ממוקד אל התלמיד הכניסה של העדשה המטרה ולאחר מכן נסגר כמו קרן דמוי-עיפרון. קרן זו, אשר צפוי להיות ~ 10 מיקרומטר בקוטר עבור מטרה 60 x, מרחיב בצורה אחידה/אנכית לאורך כל המדגם. במצב זה, עוצמת האור בכל מיקום נתון בתוך המקום גירוי יהיה ~ 1% של עוצמת ספוט קטן ליד-עקיפה-מוגבלת. לפיכך, הכוחות לייזר נדרשים בדרך כלל כאשר באמצעות גירוי ספוט ~ 10 מיקרומטר. לניסויים כל דיווח במאמר זה, שימשה קרן שעון חול-סוג photostimulation.
ניתן להתוות את הכוח מדגם ונמסרו נגד ההגדרה מתח קלט, לאחר מדידה את עוצמת הלייזר ב המדגם באמצעות מד כוח. מחקרים אלה להשתמש 60 x WD המטרה עם מרחק עבודה של 2 מ מ, אבל זה לא שקוע במים למדידות חשמל למנוע נזק אפשרי לרכיב גלאי. כאשר המטרות עם רשומה נה > 0.95 נמדדים באוויר (ללא טבילה נוזל), שם יכול להיות גמורה הפסדים ברכיב לפנים עדשה בשל מדד נמוך (אוויר). במקרה זה, עבור מדויקת יותר דוגמת כוח מידה (לתיקון גמורה הפסדים), להגדיל את כוח נמדד על ידי 1.0 נה אובייקטיבית (1.0/0.95)2 נמדדו באוויר. איור 1a מציג מגרש קלט/פלט טיפוסי על 405 ננומטר 473 ננומטר לייזר גלוי זה משולבים הלייזר השקת מערכת במחקר זה. מערכות לייזר אלה הם אידיאליים עבור צילום-גירוי חשיפה מנה מלאה מהסיבות הבאות: (1) הם מראש המכויל לספק כוח לינארי ישירות פלט יחסי הקלט מתח (0-5 V), (2) הם לספק מבצע תריס שקט (לא לייזר פלט), (3) להם מהירה, sub-ms עוצמת הדופק משך שליטה (0.1 ms תגובה). בעת שימוש צילום ספוט-גירוי עם מערכת לייזר/galvo, כיול שוטף של כתמים MarkPoints היא משימה חיונית. איור 1b (החלונית הימנית) מדגים מערכת מחוץ כיול (הנקודה הרצויה לעורר על-ידי צילום לא לגרום גירוי מדויק של הנקודה הזו, כמצוין על-ידי מיקום הכוויה-חור), עם חזרה מיקום מדויק של המקום לאחר כיול ( איור 1b, לוח נכון). 
הרשות הפלסטינית-Nic זה בצניעות פלורסנט (פליטת לשיא בגיל ~ 510 ננומטר), מפגין עירור יעיל בין 350-450 nm (1-פוטון עירור) או 700-900 ננומטר (2-פוטון עירור)5. להמחיש הרשות הפלסטינית-Nic במהלך יישום מקומיות, הרשות הפלסטינית-Nic (1 מ מ) הוחל ליד רקמת המוח ואחריה סימולטני הדמיה של המוח (1) רקמת שידור משרטוטי אופטי הקשר דרך הניגוד Dodt ו- (2) על ידי קרינה פלואורסצנטית הנפלט עירור (900 ננומטר) של הרשות הפלסטינית-ניק-Nic 2PE זריחה היה בקלות לזיהוי במהלך הפליטה בלחץ של פיפטה יישום מקומי (איור 2 א). ניקוטין המחפשים לשלב בין טיפול אלטרנטיבי ונוחות המוצרים פוטו אטמוספרי העיקריים של הרשות הפלסטינית-Nic פוטוליזה תגובה5monoalkylcoumarin, 7-carboxymethylamino-4-methyl קומרין. באמצעות אותן הגדרות או פרמטרים לצורכי הרשות הפלסטינית-Nic הדמיה הדימות, הרקמה צולמה במהלך הלידה של ניקוטין (1 מ מ) או 7-carboxymethylamino-4-methyl קומרין (1 מ"מ). אין אות ניאון זוהה (איור 2 א, לוחות האמצעי והתחתון), הוכחת יחודיות של התוצאות הרשות הפלסטינית-Nic. לבסוף, הרשות הפלסטינית-Nic הוחלה בתוך רקמת המוח, פליטת קרינה פלואורסצנטית הרשות הפלסטינית-Nic היה עם תמונה (איור 2b). גישה זו מאשר כי הרשות הפלסטינית-Nic הוא מתנה בתוך 100-200 מיקרומטר של פיפטה יישום מקומי... יחד, נתונים אלו מאשרים כי הרשות הפלסטינית-Nic ביעילות יועברו אל המוח רקמות באמצעות יישום מקומי.
אלקטרופיזיולוגיה הקלטות עם 2PLSM בו זמנית עבור ויזואליזציה של מבנים הסלולר מחייב לחוקר איזון שיקולים עבור שני הרכיבים של הניסוי, לעיתים קרובות חלון זמן קצר (~ 20 דקות) זמין עבור חוקי רכישת נתונים לדוגמה מתא תוקנו. בלי לקחת בחשבון הסלולר ויזואליזציה, זה הכי טוב להתאמן כדי להתחיל בהקלטת בהקדם האפשרי לאחר הפריצה כי הקלטת יציבות נוטה לרדת עם הזמן. עם זאת, כאשר ההדמיה היא דרישה, שיקולים אלקטרופיזיולוגיות לאפשר מספיק זמן עבור מגביר ריכוז קרינה פלואורסצנטית במבנים קטנים/מרחוק. דוגמה לכך הוא על-ידי בדיקת ריכוז צבע מילוי עקומת28, אשר שימושי לפעמים להפיק כאשר הדמיה סוג חדש של התא. איור 3 מראה מספר הנוירונים דוגמה עם תמונה כמו Z-במחסן באמצעות 2PLSM, התמוטטה לתוך הקרנה העוצמה המקסימלית למטרות המצגת. איור 3a מציג תמונות באיכות גבוהה שבו מורפולוגיה עצביים שנראה מלא, רעש הוא ממוזער, פסולת לא מפריע פרשנות של מורפולוגיה הסלולר. איור 3b מציג תמונות באיכות נמוכה יותר, בשל יחס אות-כדי-ברקע התחתון ופסולת משמעותי. פסולת זו מופיעה לעיתים קרובות כיסים כדורית של קרינה פלואורסצנטית אינטנסיבי, הנובעים הוצאה של הדמיה מ פיפטה תיקון בעודם מתקרבים התא. ראוי לציין, הכללת 100 מיקרומטר הרשות הפלסטינית-Nic באמבטיה (בעת ביצוע יישום אמבט) נוטה להפחית את יחס אות-כדי-ברקע ומוביל בחדות התמונה תת אופטימלית. אלקסה עבור חיל הים 568 או 594 הוא לעיתים קרובות שימושי בניסויים יישום מקומי כמו צבע finder או אות הפניה/נורמליזציה תהליך 2PE. יעיל עבור שני הפוטונים עירור של צבעים אלה הוא ~ 780 nm27, המאפשר ויזואליזציה סימולטני של הרשות הפלסטינית-Nic וזיהוי של תאים סלולריים. הגל הזה, עם זאת, לא לחלוטין להימנע שני הפוטונים פוטוליזה של הרשות הפלסטינית-Nic5. אלקסה עבור חיל הים 488 יש יתרון בניסויים אמבט-יישום הרשות הפלסטינית-Nic; כשהוא מתרגש עם nm ≥900 אורך גל המתאים, ניתן להימנע שני הפוטונים פוטוליזה של הרשות הפלסטינית-Nic5 תוך שמירה על ויזואליזציה מתאים של תאים סלולריים.
איור 4 מראה דוגמה נתונים עבור לשפות אחרות הרשות הפלסטינית-Nic לייזר פלאש פוטוליזה MHb נוירונים במוח פרוסות. איור 4a מראה (לוחות העליון) דוגמה של תמונה "אסמכתא", אשר לכידת מסך של תמונת 2PLSM האחרון נלקח לפני הפעלת בפרוטוקול MarkPoints , בשכבות עם המיקום ספוט צילום-גירוי. איור 4a (להוריד את התמונה פאנלים) מראה תצוגה מוגדלת של צילום-הגירוי ספוט על המורפולוגיה הסלולר. המתאימים בקורלציה זמן אלקטרופיזיולוגיות תגובת הרשות הפלסטינית-Nic פוטוליזה מוצג הלוחות התחתון של איור 4a. העבודות הקודמות הפגינו כי זרמים אלו רגישים היריבים nAChR5. איור 4b מציג נתונים נציג מתאי שונה שבו בוצעה פוטוליזה ספוט יחיד במרווח של 1 או s או 10 ס' ואילו מרווח s 10 מותר זמן התאוששות מספיק הבסיס מחזיק הנוכחי, מרווח s 1 קצר הוביל עלייה הדרגתית החזקתו הנוכחי כמו הפרוטוקול המשיך. הגדלת הנוכחי עולה כי ניקוטין לא היה מספיק זמן כדי לפזר מן המערכת עם מרווח 1 הרץ29. תגובה כזו טמפורלית ניתוחים בטח לבצע דה נובו כל סוג התא החדש, נחקר גם neuropharmacology של nAChRs עשויות להיות שונות בין סוגי תאים.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58873/58873fig1.jpg"> איור 1: כיול לייזר Photostimulation- () צילום-גירוי לייזר כוח פלט. כוח על המטוס מדגם (באמצעות סימן x 60 / 1.0 נה טובלים במים המטרה) נמדדה על 405 ננומטר, 473 לייזרים צילום-גירוי nm ב ההגדרה הפלט המצוין. (b) צילום-גירוי לייזר כיול. תמונות לכידת מסך להראות את היחסים המרחביים בין המקום המיועד צילום-גירוי המיקום המתאים שבו צילום-גירוי אירעה (צריבה גומות) לפני (משמאל) ואחרי (מימין) כיול פועל ב- MarkPoints. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58873/58873fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58873/58873fig2.jpg"> איור 2: יישום מקומי של הרשות הפלסטינית-Nic. פיפטה () זיהוי של הרשות הפלסטינית-Nic מ מקומי יישום. 1 מ מ הרשות הפלסטינית-Nic, כנגזרת פוטוליזה או ניקוטין היו מומס חנה המבר נטען לתוך פיפטה יישום מקומי, ויתרו על רקמת המוח במהלך 2PLSM (900 ננומטר עירור) הדמיה באמצעות אותן הגדרות הדמיה לכל סם. מופעי לייזר סורק Dodt חדות שידור תמונה של הרקמות/פיפטה ואילו הקתודה חאספ PMT שימש כדי ללכוד פליטת קרינה פלואורסצנטית. (b) הרשות הפלסטינית-Nic (1 מ מ) perfused לתוך רקמת המוח, עם תמונה באמצעות 2PLSM כמו () כדי להציג את התפשטות לרוחב של הרשות הפלסטינית-Nic באמצעות קרינה פלואורסצנטית מהותי שלה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58873/58873fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58873/58873fig3.jpg"> איור 3: רכישת סריקת תמונות מיקרוסקופ לייזר הפוטונים 2. Z () 2PLSM אופטימלית-במחסן. שתי דוגמאות 2PLSM Z-מחסנית העוצמה המקסימלית הקרנות הינם המוצגות עבור MHb נוירונים עם דנדריטים היטב נפתרה מעט אין פסולת מפריעות. Z 2PLSM תת אופטימלית (b)-במחסן. שתי דוגמאות 2PLSM Z-מחסנית העוצמה המקסימלית תחזיות מוצגים עבור נוירונים MHb מוקף פסולת (צבען שגורשו על פיפטה במהלך תא גישה). תמונות כאלה קשים יותר לפרש יותר תמונות כמו אלה המוצגים (). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58873/58873fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58873/58873fig4.jpg"> איור 4: לייזר פלאש פוטוליזה של הרשות הפלסטינית-nic תמונות () MarkPoints התייחסות וזרמים פנימה עורר על-ידי הרשות הפלסטינית-Nic פוטוליזה. עבור נוירון אחד MHb, מוצגות תמונות raw הפניה לניסויים צילום-גירוי MarkPoints במיקום יחיד הסלולר (המצוין). שימו לב כי עבור מיקומים מסוימים צילום-גירוי (התמונה הימנית ביותר בסדרה זו), המבנה הדנדריטי נמצא בפוקוס אך וראשה דנדריט proximal אינם. מתחת לכל תמונה הפניה, מותווים ניקוטין uncaging-עורר פנימה הנוכחי. (b) בין הגירוי מרווחי פוטוליזה הרשות הפלסטינית-Nic. המיתר הקלטות מוצגים עבור MHb נוירונים איפה ניקוטין היה שוב ושוב שברחה מכלוב באותו מיקום perisomatic במרווח הבין-גירוי של 1 s או 10 ס <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58873/58873fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Probing Nicotinic Acetylcholine Receptor Function in Mouse Brain Slices via Laser Flash Photolysis of Photoactivatable Nicotine at JoVE.com

Probing Nicotinic Acetylcholine Receptor Function in Mouse Brain Slices via Laser Flash Photolysis of Photoactivatable Nicotine

מאמר זה מציג שיטה ללימוד קולטני אצטילכולין nicotinic (nAChRs) העכבר פרוסות המוח על-ידי uncaging ניקוטין. כאשר משולב עם הקלטה מלחציים תיקון בו זמנית של סריקת מיקרוסקופ לייזר הפוטונים 2, ניקוטין uncaging מחבר קולטן nicotinic פונקציה עם מורפולוגיה הסלולר, מתן הבנה עמוקה יותר של שימוש הנוירו-ביולוגיה.

חקירת פונקציה קולטן אצטילכולין Nicotinic פרוסות המוח העכבר באמצעות לייזר פלאש פוטוליזה של ניקוטין Photoactivatable

Acetylcholine (ACh) acts through receptors to modulate a variety of neuronal processes, but it has been challenging to link ACh receptor function with ...

טכניקה זו ממנפת מיקרוסקופיה מרובת פוטונים לסריקת לייזר בשילוב עם פוטוליזה של לייזר-פלאש של מולקולת ניקוטין פוטואקטיבית. המאפשר הפעלה מדויקת של קולטני כולין ניקוטין. טכניקה זו מאפשרת שליטה מרחבית עדין על יישום אגוניסט קולטן nicotinic, מתן כלי רב עוצמה לחקר דפוסי ביטוי תפקודי קולטן שידור סינפטית כולין או נפח.לפני תחילת ההליך, השתמש במשוך פיפטה ניתן לתיכנת כדי למשוך מיקרופיגט זכוכית בקוטר פתיחה של 20 עד 40 מיקרומטר. מסננים כמיליליטר של פתרון הקלטה באמצעות מסנן 0.22 מיקרון. ולתלות מחדש מספיק ניקוטין פוטו-אקטיביזציה lyophilized בתת פתרון ההקלטה המסונן כדי להניב ריכוז סופי של שני מילימולים.למילוי אחורי של מיקרופיגט היישום המקומי משך עם 50 microliters של התרופה photoactivatable, ולאבטח את פיפטה במחזיק פיפטה רכוב על מיקרומניפולטור. חבר את מחזיק פיפטה באמצעות אורך מתאים של צינורות למערכת פליטת לחץ המסוגלת להתקיים יישום בלחץ נמוך. ולהשתמש במיקרומניפולטור כדי לתמרן את פיפטה היישום המקומי לתוך פתרון הקלטה חוץ תאית.מקם את קצה פיפטה מעט מעל מדגם רקמת המוח של העכבר, כ 50 מיקרומטר מתא העניין. ולזמן קצר להחיל אחד עד שני קילוגרמים לאינץ 'מרובע של לחץ על פיפטה. צריך להיות מינימום עד שום עקירה של התא של עניין.לאחר השגת מהדק תיקון יציב שלם התא, להפעיל את היישום נמוך על מכשיר פליטת הלחץ, ולרווה את הרקמה המקיפה את התא עם ניקוטין photoactivatable במשך 1 עד 2 דקות. היישום המקומי מציג מורכבות נוספת לניסוי. אבל זה חוסך תרכובת ומאפשר ריכוזים גבוהים יותר של PA-Nic להיות מנוצל.עבור יישום אמבטיה של ניקוטין photoactivatable, הראשון להמיס מספיק של התרופה lyophilized בנפח של פתרון הקלטה מתאים recirculation מתמשך לריכוז סופי 100 מיקרומולר. ותטעינה את התערובת שנוצרת למערכת חיסון. לאחר מכן התחילו בהשבתת תותבת הניקוטין הפוטואקטיבית בקצב של 1.5 עד 2 מילימטר לדקה, תוך שימוש באמבטים בקוטר פנימי מינימלי ובאורך כולל כדי למזער את נפח ההיקף הנדרש.במהלך recirculation, ברציפות בועה הפתרון עם קרבוגן, ולשמור על טמפרטורת האמבטיה ב 32 מעלות צלזיוס בתנאי תאורה נמוכה. יישום אמבטיה נהנה הפשטות ואחידות של חלחלה PA-Nic של הרקמה. אבל זה בהכרח מנצל ריכוזי PA-Nic מיקרומולרים נמוכים יותר, ומ Expends כמויות כוללות גבוהות יותר של תרכובת.להדמיה חיה של נוירון habenula המדיאלי, להשתמש אור משודר או אינפרא אדום הפרעה דיפרנציאלית ניגודיות אופטיקה ומצלמת וידאו כדי להקים יציב, כל התא תיקון מהדק הקלטה. לאחר יצירת התצורה המחוברת לתאים בעלי התנגדות גבוהה, אך לפני הפריצה, העבר את ההתקנה והתוכנה למצב סריקת לייזר. לאחר הפריצה, השתמש בסריקת לייזר כדי לוודא שצבע ההדמיה של העניין ממלא באופן פסיבי את הנוירון על ידי דיפוזיה.אפשר לצבע למלא את התאים התאיים לפחות 20 עד 30 דקות לפני השימוש בפונקציית הסריקה החיה כדי לדמיין את הנוירון ואת תא העניין התת-תאי. בחר פרמטרי דימות המאפשרים תצוגה חזותית חיה מדויקת של התכונות העצביות, טיפול בהגדרות המתאימות כדי להשפיע או לשנות את התצוגה החזותית, הרזולוציה, יחס אות לרעש ותזמן רכישת מסגרת תמונה לפי הצורך. כדי לשפר את ניגודיות האות, פתח את חלון טבלת בדיקת המידע והתאם את הגדרות רצפת שולחן בדיקת המידע והתקרה.כדי לאתר אזור עניין בתוך הרקמה, בחר את הזום האופטי 1X ולהשתמש בפקדי גלילה. השתמש בכלי סידרת Z כדי לבחור מיקום התחלה ו עצירה המכיל את תא העניין. קבעו גודל צעד של מיקרומטר אחד ובחרו גודל תמונה שיניב תמונה ברזולוציה הגבוהה ביותר.לעתים קרובות 1, 024 על ידי 1, 024 פיקסלים לכל שורה. ואז ברציפות תמונה הנוירון בכל מישור Z המכיל את התא. כדי לכייל את גירוי הלייזר, התחל את סריקת המערכת עם כוח לייזר הדמיה גדול מהמינימום, וכוונן את המיקוד האובייקטיבי לשכבת הפלואורסצנטיות הדקה של הסמן האדום.בחרו אזור בתוך שדה הפלואורסצנטיות נקי מפסולת ומצויד באופן שווה בסמן, פתחו את הכלים, הכיול ותפריט היישור כדי לבחור את פונקציית הגלבוקליברציה הבלתי משתנה. בצע את הדרכת כתמי הכוויה לכיול המרחבי של זוג המראה השני של גלוונומטר, בחירת לייזר 405 ננומטר, כוח גירוי לייזר של 400, ומשך גירוי של 20 אלפיות שנייה. כדי להניב חורים בקוטר 1 עד 5 מיקרומטר בסמן האדום.בחר עדכן כדי לעורר ולרענן את התמונה לאחר שריפת הנקודה המרכזית, והזז את המחוון האדום העגול למיקום הנקודה בפועל של נקודות המרכז, המרכז-ימין והמרכז התחתון כדי לקבל רשת של תשע נקודות. כדי לבדוק את הכיול, פתח את חלון נקודות הסימון והפעל ידנית את פרמטרי הגירוי של הנקודות המוגדרות באזור חדש של המדגם, תוך טיפול טען של קובץ הכיול העדכני ביותר הנכון לחלון נקודות הסימון. לאחר מכן החל פעימת בדיקה כדי לאמת את הכיול הנכון.כדי לתדמיין ולאתר בקצרה את אזור העניין התת-תאי, בחר סריקה חיה ולהשתמש בהגדלת הזום האופטי כדי לדמיין מבנים קטנים לפי הצורך. מקם את הכוונת החד-נקודתית של נקודת הסימון הסמוכה מיד לממברנה של התא והגדר את פרמטרי הפוטו-טימוזיה למשך של 1 עד 50 אלפיות שנייה, כוח לייזר של 1 עד 4 מילי-וואט ולפחות משפט אחד. לאחר מכן בחר נקודות סימון ריצה כדי ליזום את פרוטוקול נקודות הסימון, ובחן את רכישת הנתונים האלקטרופיזיולוגיים בזמן אמת.פוטואקטיביות ניקוטין 2PE פלואורסצנטיות של PA-Nic מילימולר אחד מזוהה בקלות במהלך פליטת לחץ מ pipette יישום מקומי כפי שהודגם. בעוד שהמשלוח של המוצרים הפפוטוכימיים העיקריים של תגובת הניקוטין פוטוליזה פוטואקטיבית אינו יוצר אות פלואורסצנטי באותו ריכוז ועוצמת עירור ואורך גל. הדגמת הספציפיות של תוצאות הניקוטין photoactivatable.הדמיה של ניקוטין photoactivatable להחיל על רקמת המוח כפי שהוכח מגלה את נוכחותה של התרופה בתוך 100 עד 200 מיקרומטר של פיפטה היישום המקומי. אישור כי ניקוטין photoactivatable יכול להיות מועבר ביעילות לרקמת המוח באמצעות יישום מקומי. כאן מוצגות תמונות באיכות גבוהה שבהן המורפולוגיה העצבית הושלמה, הרעש ממוזער והפסולת אינה מפריעה לפרשנות המורפולוגיה התאית.תמונות אלה, לעומת זאת, הן באיכות נמוכה יותר. בשל יחס אות-לרקע נמוך יותר ופסולת משמעותית. זיווג מיקרוסקופיה סריקת לייזר שני פוטון של נוירונים habenula המדיאלי בפרוסות המוח עם פוטוליזה פלאש לייזר של PA-Nic כפי שהוכח, מאפשר התאמה של תגובות אלקטרופיזיולוגיות עם מורפולוגיה הסלולר.פוטוליזה של נקודה אחת המבוצעת במרווחים של 10 שניות מאפשרת זמן התאוששות מספיק עבור זרם ההחזקה הבסיסי. בעוד מרווח קצר יותר של שנייה אחת מוביל לעלייה הדרגתית בזרם האחזקה ככל שהפרוטוקול ממשיך. מה שמרמז כי לניקוטין אין מספיק זמן להתפזר הרחק מהמערכת עם המרווחים הקצרים יותר.בתכנון ניסויים המשתמשים במולקולות פוטואקטיביות, חשוב לזכור לבחור אינדיקטורים פלואורסצנטיים ולדווח על פלואורופורים עם ספקטרום פליטת עירור תואם. PA-Nic תואם את רוב הפלואורופורים הנפוצים בשל שיא הפוטוליזה באורך הגל הקצר שלו. בעת בחירת טכניקת היישום המתאימה ביותר PA-Nic, חשוב לשקול בזהירות את הביטוי הפונקציונלי, פעילות פיזיולוגית של הקולטנים nicotinic בנוירונים של עניין.ניצול מיומן של טכניקה זו מאפשר שליטה מרחבית עדינה של יישום ניקוטין, המאפשר אפשרויות חדשות ומלהיבות לחקר הקינטיקה של מעורבות קולטן ניקוטיני מקומי, לוקליזציה תת תאית, ואפנן של פעילות עצבית על ידי הפעלת קולטן ניקוטיני.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Flash Photolysis of Caged Compounds in the Cilia of Olfactory Sensory  Neurons

פלאש Photolysis של תרכובות כלואה צילה של עצב סנסורי חוש הריח

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. ...

Spectral Confocal Imaging of Fluorescently tagged Nicotinic Receptors in Knock-in Mice with Chronic Nicotine Administration

דימות ספקטרלי Confocal של קולטנים ניאציניות מתויג fluorescently ב עקום בעכברים עם מינהל ניקוטין כרונית

Ligand-gated ion channels in the central nervous system (CNS) are implicated in numerous conditions with serious medical and social consequences.  For ...

Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

תגובות סידן הדמיה בנוירונים GFP-tagged של פרוסות מוח עכבר ההיפותלמוס

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the ...

Local Application of Drugs to Study Nicotinic Acetylcholine Receptor Function in Mouse Brain Slices

יישום מקומי של תרופות לללמוד לתפקד קולטן אצטילכולין ניקוטינית בפרוסות מוח עכבר

Tobacco use leads to numerous health problems, including cancer, heart disease, emphysema, and stroke. Addiction to cigarette smoking is a prevalent ...

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

In vivo electroporation ואחרי הלידה וזמן לשגות הדמיה של neuroblast הגירה בעכבר חריפה פרוסות המוח

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to ...

Laser-guided Neuronal Tracing In Brain Explants

Explants מוח מונחי לייזר עצבי איתור ב

We present a technique which combines an in vitro tracer injection protocol, which uses a series of electrical and pressure pulses to increase dye uptake ...

Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique

הדמית סיבי serotonergic בחוט שדרת עכבר שימוש CLARITY / טכניקה מעוקבת

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal ...

Studying Brain Function in Children Using Magnetoencephalography

תפקוד המוח לומד אצל ילדים באמצעות מגנטואנצפלוגרפיה

Magnetoencephalography (MEG) is a non-invasive neuroimaging technique which directly measures magnetic fields produced by the electrical activity of the ...

Chronic Implantation of Whole-cortical Electrocorticographic Array in the Common Marmoset

השרשה כרונית של מערך שלם-קורטיקליים Electrocorticographic ב המרמוסט נפוצות

Electrocorticography (ECoG) allows the monitoring of electrical field potentials from the cerebral cortex with high spatiotemporal resolution. Recent ...