Photoactivatable निकोटीन के लेजर फ्लैश Photolysis के माध्यम से माउस मस्तिष्क स्लाइस में कोर्टेक्स Acetylcholine रिसेप्टर समारोह की जांच

यह तकनीक एक फोटोएक्टिवेट निकोटीन अणु के लेजर-फ्लैश फोटोलिसिस के साथ मिलकर मल्टी-फोटॉन लेजर-स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी का लाभ उठाती है। निकोटीन कोलिनेर्गिक रिसेप्टर्स की सटीक सक्रियता की अनुमति देना। यह तकनीक निकोटीन रिसेप्टर एगोनिस्ट एप्लिकेशन पर ठीक स्थानिक नियंत्रण की अनुमति देती है, रिसेप्टर कार्यात्मक अभिव्यक्ति पैटर्न और कोलिनेर्जिक सिनैप्टिक या वॉल्यूम ट्रांसमिशन के अध्ययन के लिए एक शक्तिशाली उपकरण प्रदान करता है।

प्रक्रिया शुरू करने से पहले, 20-से 40-माइक्रोमीटर खोलने व्यास के साथ ग्लास माइक्रोपिपेट खींचने के लिए एक प्रोग्राम योग्य पिपेट पुलर का उपयोग करें। 0.22-माइक्रोन फ़िल्टर के माध्यम से रिकॉर्डिंग समाधान का लगभग एक मिलीलीटर तनाव। और फ़िल्टर रिकॉर्डिंग समाधान में पर्याप्त ल्योफिलाइज्ड फोटोएक्टिवेट निकोटीन को पुनः खर्च करें ताकि दो-मिलीमोलर अंतिम एकाग्रता प्राप्त हो सके।

फोटोएक्टिवेट दवा के 50 माइक्रोलीटर के साथ खींचे गए स्थानीय एप्लिकेशन माइक्रोपिपेट को बैकफिल करें, और माइक्रोमैनीपुलेटर पर चढ़कर पिपेट धारक में पिपेट को सुरक्षित करें। एक दबाव इंजेक्शन निरंतर कम दबाव आवेदन करने में सक्षम करने के लिए टयूबिंग की एक उचित लंबाई के माध्यम से पिपेट धारक कनेक्ट। और अतिरिक्त सेल्युलर रिकॉर्डिंग समाधान में स्थानीय एप्लिकेशन पिपेट को पैंतरेबाज़ी करने के लिए माइक्रोमैनीपुलेटर का उपयोग करें।

एक माउस मस्तिष्क ऊतक नमूने से थोड़ा ऊपर पिपेट टिप की स्थिति, ब्याज की कोशिका से लगभग 50 माइक्रोमीटर। और संक्षेप में पिपेट के लिए दबाव के प्रति वर्ग इंच एक से दो पाउंड लागू होते हैं । ब्याज की कोशिका का विस्थापन नहीं होना चाहिए ।

एक स्थिर पूरे सेल पैच क्लैंप को प्राप्त करने के बाद, दबाव इंजेक्शन डिवाइस पर कम आवेदन चालू करें, और एक से दो मिनट के लिए फोटोएक्टिवेट निकोटीन के साथ सेल के आसपास के ऊतकों को संतृप्त करें। स्थानीय आवेदन प्रयोग के लिए अतिरिक्त जटिलता का परिचय देता है। लेकिन यह यौगिक पुर्जों और पीए एनआईसी की उच्च सांद्रता का उपयोग करने की अनुमति देता है ।

फोटोएक्टिवेट निकोटीन के स्नान आवेदन के लिए, पहले 100-माइक्रोमोलर अंतिम एकाग्रता के लिए निरंतर रिसर्चर के लिए उपयुक्त रिकॉर्डिंग समाधान की मात्रा में लियोफिलाइज्ड दवा को पर्याप्त रूप से भंग करें। और परिणामी मिश्रण को एक पर्फ्यूजन सिस्टम में लोड करें। फिर आवश्यक रिसर्चर मात्रा को कम करने के लिए न्यूनतम आंतरिक व्यास और समग्र लंबाई के साथ ट्यूबिंग का उपयोग करके, 1.5 से 2-मिलीमीटर प्रति मिनट की दर से फोटोएक्टिवेट करने योग्य निकोटीन समाधान का पुनरर्केशन शुरू करें।

रिसर्चर के दौरान, लगातार कार्सोजेन के साथ समाधान बुलबुला, और कम प्रकाश की स्थिति में ३२ डिग्री सेल्सियस पर स्नान तापमान बनाए रखने । स्नान आवेदन ऊतक के पीए-एनआईसी पारमेशन की सादगी और एकरूपता से लाभ। लेकिन यह जरूरी कम माइक्रोमोलर पीए-एनआईसी सांद्रता का उपयोग करता है, और यौगिक की उच्च कुल मात्रा व्यय करता है ।

एक मध्यवर्ती habenula न्यूरॉन के लाइव दृश्य के लिए, एक स्थिर, पूरे सेल पैच क्लैंप रिकॉर्डिंग स्थापित करने के लिए संचारित प्रकाश या अवरक्त अंतर हस्तक्षेप विपरीत प्रकाशिकी और एक वीडियो कैमरा का उपयोग करें। उच्च प्रतिरोध सेल संलग्न विन्यास स्थापित करने के बाद, लेकिन ब्रेक-इन से पहले, सेटअप और सॉफ्टवेयर को लेजर स्कैनिंग मोड में स्विच करें। ब्रेक-इन के बाद, लेजर स्कैनिंग का उपयोग यह सत्यापित करने के लिए करें कि ब्याज की इमेजिंग डाई निष्क्रिय रूप से प्रसार द्वारा न्यूरॉन को भर रही है।

डाई को ब्याज के न्यूरॉन और उपकोशिकीय डिब्बे की कल्पना करने के लिए लाइव स्कैन फ़ंक्शन का उपयोग करने से पहले कम से कम 20 से 30 मिनट के लिए सेलुलर डिब्बों को भरने की अनुमति दें। इमेजिंग पैरामीटर का चयन करें जो न्यूरोनल सुविधाओं के सटीक लाइव विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति देते हैं, उपयुक्त सेटिंग्स को प्रभावित करने या प्रदर्शन दृश्य, संकल्प, सिग्नल-टू-शोर अनुपात और छवि फ्रेम अधिग्रहण समय को आवश्यक रूप से प्रभावित या बदलने के लिए जोड़ते हैं। सिग्नल कंट्रास्ट को बढ़ाने के लिए लुकअप टेबल विंडो खोलें और लुकअप टेबल फ्लोर और सीलिंग सेटिंग्स को एडजस्ट करें।

ऊतक के भीतर ब्याज के क्षेत्र का पता लगाने के लिए, 1X ऑप्टिकल ज़ूम का चयन करें और पैनिंग नियंत्रण का उपयोग करें। एक स्टार्ट और स्टॉप स्थिति का चयन करने के लिए जेड-सीरीज टूल का उपयोग करें जिसमें रुचि की कोशिका शामिल है। एक माइक्रोमीटर का एक कदम आकार सेट करें, और एक छवि आकार का चयन करें जो उच्चतम-रिज़ॉल्यूशन छवि उत्पीलक करेगा।

अक्सर 1, 024 बाय 1, 024 पिक्सल प्रति लाइन। फिर लगातार हर जेड-प्लेन में न्यूरॉन की इमेज करें जिसमें सेल होता है। लेजर उत्तेजना को जांचने के लिए, न्यूनतम से अधिक इमेजिंग लेजर शक्ति के साथ स्कैनिंग सिस्टम शुरू करें, और पतली लाल मार्कर फ्लोरेसेंस परत पर उद्देश्य फोकस को ठीक करें।

फ्लोरेसेंस क्षेत्र के भीतर एक क्षेत्र का चयन करें जो मलबे से स्पष्ट है और मार्कर के साथ समान रूप से लेपित है, और अनकिंग गैलवोकैलिब्रेशन फ़ंक्शन का चयन करने के लिए उपकरण, अंशांकन और संरेखण मेनू खोलें। दूसरी गैलेवनोमीटर मिरर जोड़ी के स्थानिक अंशांकन के लिए बर्न स्पॉट ट्यूटोरियल का पालन करें, 405-नैनोमीटर लेजर, 400 की लेजर उत्तेजना शक्ति, और 20 मिलीसेकंड की उत्तेजना अवधि का चयन करें। लाल मार्कर में एक से पांच माइक्रोमीटर व्यास छेद उपज।

केंद्र स्थान को जलाने के बाद छवि को उत्तेजित और ताज़ा करने के लिए अद्यतन का चयन करें, और नौ स्थानों की ग्रिड प्राप्त करने के लिए केंद्र, दाएं-केंद्र और निचले केंद्र स्थानों के वास्तविक स्थान स्थान पर गोल लाल संकेतक को स्थानांतरित करें। अंशांकन का परीक्षण करने के लिए, मार्क पॉइंट्स विंडो खोलें और नमूने के एक नए क्षेत्र में परिभाषित स्थानों के उत्तेजना मापदंडों को मैन्युअल रूप से सक्रिय करें, यह ध्यान रखते हुए कि सही नवीनतम अंशांकन फ़ाइल को मार्क पॉइंट्स विंडो में लोड किया जाता है। फिर सही अंशांकन को सत्यापित करने के लिए एक परीक्षण नाड़ी लागू करें।

संक्षेप में छवि और ब्याज के उपकोशिकीय क्षेत्र का पता लगाने के लिए, लाइव स्कैन का चयन करें और आवश्यक के रूप में किसी भी छोटी संरचनाओं की कल्पना करने के लिए ऑप्टिकल ज़ूम में वृद्धि का उपयोग करें । मार्क पॉइंट सिंगल-स्पॉट क्रॉसहेयर को कोशिका झिल्ली के तुरंत निकट रखें, और फोटोटिमुलेशन पैरामीटर को एक-से-50-मिलीसेकंड अवधि, एक-चार-मिलीवाट लेजर पावर और कम से कम एक परीक्षण के लिए सेट करें। फिर मार्क पॉइंट्स प्रोटोकॉल शुरू करने के लिए रन मार्क पॉइंट्स का चयन करें, और वास्तविक समय में इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी डेटा अधिग्रहण का निरीक्षण करें।

एक मिलीमोलर पीए-एनआईसी के फोटोएक्टिवेबल निकोटीन 2PE फ्लोरेसेंस को प्रदर्शन के अनुसार स्थानीय एप्लिकेशन पिपेट से दबाव इंजेक्शन के दौरान आसानी से पता लगाया जाता है। जबकि फोटोएक्टिवेबल निकोटीन फोटोलिसिस रिएक्शन के मुख्य फोटोकेमिकल उत्पादों की डिलीवरी से एक ही एकाग्रता और उत्तेजन शक्ति और तरंगदैर्ध्य पर कोई फ्लोरोसेंट सिग्नल उत्पन्न नहीं होता है। फोटोएक्टिवेट निकोटीन परिणामों की विशिष्टता का प्रदर्शन।

मस्तिष्क के ऊतकों पर लागू फोटोएक्टिवेट निकोटीन की इमेजिंग के रूप में प्रदर्शन स्थानीय आवेदन पिपेट के 100 से 200 माइक्रोमीटर के भीतर दवा की उपस्थिति का पता चलता है। इस बात की पुष्टि करते हुए कि फोटोएक्टिवेट करने योग्य निकोटीन को स्थानीय अनुप्रयोग के माध्यम से मस्तिष्क के ऊतकों में प्रभावी रूप से वितरित किया जा सकता है। यहां, उच्च गुणवत्ता वाली छवियां जिनके भीतर न्यूरोनल आकृति विज्ञान पूरा प्रतीत होता है, शोर को कम किया जाता है, और मलबे सेलुलर आकृति विज्ञान की व्याख्या में हस्तक्षेप नहीं करता है, दिखाया जाता है।

हालांकि, ये छवियां कम गुणवत्ता की हैं। कम सिग्नल-टू-बैकग्राउंड अनुपात और पर्याप्त मलबे के कारण। प्रदर्शन के रूप में पीए-एनआईसी के लेजर फ्लैश फोटोलिसिस के साथ मस्तिष्क स्लाइस में मध्याह्न हबनुला न्यूरॉन्स की दो फोटॉन लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी बांधना, सेलुलर आकृति विज्ञान के साथ इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल प्रतिक्रियाओं के सामंजस्य के लिए अनुमति देता है।

10-सेकंड के अंतराल पर किए गए एकल-स्थान फोटोलिसिस बेसलाइन होल्डिंग वर्तमान के लिए पर्याप्त वसूली समय की अनुमति देता है। जबकि एक छोटे से एक सेकंड के अंतराल में प्रोटोकॉल आय के रूप में होल्डिंग वर्तमान में क्रमिक वृद्धि होती है। सुझाव है कि निकोटीन के पास कम अंतराल के साथ सिस्टम से दूर फैलाने के लिए पर्याप्त समय नहीं है।

फोटोएक्टिवेट अणुओं का उपयोग करने वाले प्रयोगों को डिजाइन करने में, फ्लोरोसेंट संकेतकों का चयन करना और संगत उत्तेजन उत्सर्जन स्पेक्ट्रा के साथ फ्लोरोफोरस की रिपोर्ट करना याद रखना महत्वपूर्ण है। पीए-एनआईसी अपनी छोटी तरंगदैर्ध्य फोटोलिसिस पीक के कारण सबसे आम फ्लोरोफोरस के साथ संगत है। सबसे उपयुक्त पीए-एनआईसी आवेदन तकनीक चुनते समय, रुचि के न्यूरॉन्स में निकोटीन रिसेप्टर्स की कार्यात्मक अभिव्यक्ति, शारीरिक गतिविधि पर सावधानीपूर्वक विचार करना महत्वपूर्ण है।

इस तकनीक का कुशल उपयोग निकोटीन आवेदन के ठीक स्थानिक नियंत्रण के लिए अनुमति देता है, जो निकोटीन रिसेप्टर सगाई, उपकोशिक स्थानीयकरण, और निकोटीन रिसेप्टर सक्रियण द्वारा न्यूरोनल गतिविधि के मॉड्यूलेशन के काइनेटिक्स का अध्ययन करने के लिए रोमांचक नई संभावनाओं को सक्षम बनाता है।