Name: probing nicotinic acetylcholine receptor function in mouse brain slices via laser flash photolysis of photoactivatable nicotine
Uploaded: 2019-01-25T13:00:00
Duration: 10 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Probing Nicotinic Acetylcholine Receptor Function in Mouse Brain Slices via Laser Flash Photolysis of Photoactivatable Nicotine at JoVE.com

Forfatterne takker laboratorium medlemmer av følgende nordvest viktigste etterforskerne: Ryan Drenan, D. James Surmeier, Yevgenia Kozorovitskiy og Anis entreprenør. Dette arbeidet ble støttet av oss National Institutes of Health (NIH) (gir DA035942 og DA040626 til R.M.D.), PhRMA Foundation (fellesskap til M.C.A.) og HHMI.

<ol>
	<li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholinergic+tone+in+ventral+tegmental+area:+Functional+organization+and+behavioral+implications.">Cholinergic tone in ventral tegmental area: Functional organization and behavioral implications.</a> Neurochemistry International. 114, 127-133 (2018).</li><li>Sarter, M., Parikh, V., Howe, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phasic+acetylcholine+release+and+the+volume+transmission+hypothesis:+time+to+move+on.">Phasic acetylcholine release and the volume transmission hypothesis: time to move on.</a> Nature Reviews Neuroscience. 10 (5), 383-390 (2009).</li><li>Coyle, J. T., Price, D. L., DeLong, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's+disease:+a+disorder+of+cortical+cholinergic+innervation.">Alzheimer's disease: a disorder of cortical cholinergic innervation.</a> Science. 219 (4589), 1184-1190 (1983).</li><li>Katz, B., Thesleff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+study+of+the+desensitization+produced+by+acetylcholine+at+the+motor+end-plate.">A study of the desensitization produced by acetylcholine at the motor end-plate.</a> Journal of Physiology. 138 (1), 63-80 (1957).</li><li>Banala, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoactivatable+drugs+for+nicotinic+optopharmacology.">Photoactivatable drugs for nicotinic optopharmacology.</a> Nature Methods. 15 (5), 347-350 (2018).</li><li>Yan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotinic+Cholinergic+Receptors+in+VTA+Glutamate+Neurons+Modulate+Excitatory+Transmission.">Nicotinic Cholinergic Receptors in VTA Glutamate Neurons Modulate Excitatory Transmission.</a> Cell Reports. 23 (8), 2236-2244 (2018).</li><li>Engle, S. E., Shih, P. Y., McIntosh, J. M., Drenan, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#945;4&#945;6&#946;2*+nicotinic+acetylcholine+receptor+activation+on+ventral+tegmental+area+dopamine+neurons+is+sufficient+to+stimulate+a+depolarizing+conductance+and+enhance+surface+AMPA+receptor+function.">&#945;4&#945;6&#946;2* nicotinic acetylcholine receptor activation on ventral tegmental area dopamine neurons is sufficient to stimulate a depolarizing conductance and enhance surface AMPA receptor function.</a> Molecular Pharmacology. 84 (3), 393-406 (2013).</li><li>Engle, S. E., Broderick, H. J., Drenan, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+application+of+drugs+to+study+nicotinic+acetylcholine+receptor+function+in+mouse+brain+slices.">Local application of drugs to study nicotinic acetylcholine receptor function in mouse brain slices.</a> Journal of Visualized Experiments. (68), (2012).</li><li>Ren, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Habenula+&amp;#34;cholinergic&amp;#34;+neurons+co-release+glutamate+and+acetylcholine+and+activate+postsynaptic+neurons+via+distinct+transmission+modes.">Habenula &amp;#34;cholinergic&amp;#34; neurons co-release glutamate and acetylcholine and activate postsynaptic neurons via distinct transmission modes.</a> Neuron. 69 (3), 445-452 (2011).</li><li>Koppensteiner, P., Melani, R., Ninan, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Cooperative+Mechanism+Involving+Ca(2+)-Permeable+AMPA+Receptors+and+Retrograde+Activation+of+GABAB+Receptors+in+Interpeduncular+Nucleus+Plasticity.">A Cooperative Mechanism Involving Ca(2+)-Permeable AMPA Receptors and Retrograde Activation of GABAB Receptors in Interpeduncular Nucleus Plasticity.</a> Cell Reports. 20 (5), 1111-1122 (2017).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+Excitation+via+GABAB+Receptors+in+Habenula+Cholinergic+Neurons+Regulates+Fear+Memory+Expression.">Presynaptic Excitation via GABAB Receptors in Habenula Cholinergic Neurons Regulates Fear Memory Expression.</a> Cell. 166 (3), 716-728 (2016).</li><li>Chen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+Baseline+and+Nicotine-Mediated+Behavioral+and+Cholinergic+Profiles+in+ChAT-Cre+Mouse+Lines.">Altered Baseline and Nicotine-Mediated Behavioral and Cholinergic Profiles in ChAT-Cre Mouse Lines.</a> The Journal of Neuroscience. 38 (9), 2177-2188 (2018).</li><li>Nagy, P. M., Aubert, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+the+vesicular+acetylcholine+transporter+increased+acetylcholine+release+in+the+hippocampus.">Overexpression of the vesicular acetylcholine transporter increased acetylcholine release in the hippocampus.</a> Neuroscience. 218, 1-11 (2012).</li><li>Ting, J. T., Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombineering+strategies+for+developing+next+generation+BAC+transgenic+tools+for+optogenetics+and+beyond.">Recombineering strategies for developing next generation BAC transgenic tools for optogenetics and beyond.</a> Frontiers in Behavioral Neuroscience. 8, 111 (2014).</li><li>Crittenden, J. R., Lacey, C. J., Lee, T., Bowden, H. A., Graybiel, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severe+drug-induced+repetitive+behaviors+and+striatal+overexpression+of+VAChT+in+ChAT-ChR2-EYFP+BAC+transgenic+mice.">Severe drug-induced repetitive behaviors and striatal overexpression of VAChT in ChAT-ChR2-EYFP BAC transgenic mice.</a> Frontiers in Neural Circuits. 8, 57 (2014).</li><li>Kolisnyk, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChAT-ChR2-EYFP+mice+have+enhanced+motor+endurance+but+show+deficits+in+attention+and+several+additional+cognitive+domains.">ChAT-ChR2-EYFP mice have enhanced motor endurance but show deficits in attention and several additional cognitive domains.</a> The Journal of Neuroscience. 33 (25), 10427-10438 (2013).</li><li>Nagy, P. M., Aubert, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+the+vesicular+acetylcholine+transporter+enhances+dendritic+complexity+of+adult-born+hippocampal+neurons+and+improves+acquisition+of+spatial+memory+during+aging.">Overexpression of the vesicular acetylcholine transporter enhances dendritic complexity of adult-born hippocampal neurons and improves acquisition of spatial memory during aging.</a> Neurobiology of Aging. 36 (5), 1881-1889 (2015).</li><li>Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+scanning+photochemical+microscopy:+mapping+ligand-gated+ion+channel+distributions.">Two-photon scanning photochemical microscopy: mapping ligand-gated ion channel distributions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (14), 6629-6633 (1994).</li><li>Khiroug, L., Giniatullin, R., Klein, R. C., Fayuk, D., Yakel, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+mapping+and+Ca2++regulation+of+nicotinic+acetylcholine+receptor+channels+in+rat+hippocampal+CA1+neurons.">Functional mapping and Ca2+ regulation of nicotinic acetylcholine receptor channels in rat hippocampal CA1 neurons.</a> The Journal of Neuroscience. 23 (27), 9024-9031 (2003).</li><li>Filevich, O., Salierno, M., Etchenique, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+caged+nicotine+with+nanosecond+range+kinetics+and+visible+light+sensitivity.">A caged nicotine with nanosecond range kinetics and visible light sensitivity.</a> Journal of Inorganic Biochemistry. 104 (12), 1248-1251 (2010).</li><li>Tochitsky, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optochemical+control+of+genetically+engineered+neuronal+nicotinic+acetylcholine+receptors.">Optochemical control of genetically engineered neuronal nicotinic acetylcholine receptors.</a> Nature Chemistry. 4 (2), 105-111 (2012).</li><li>Wokosin, D. L., Squirrell, J. M., Eliceiri, K. W., White, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+workstation+with+concurrent,+independent+multiphoton+imaging+and+experimental+laser+microbeam+capabilities.">Optical workstation with concurrent, independent multiphoton imaging and experimental laser microbeam capabilities.</a> Review of Scientific Instruments. 74 (1), 193-201 (2003).</li><li>Plotkin, J. L., Day, M., Surmeier, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptically+driven+state+transitions+in+distal+dendrites+of+striatal+spiny+neurons.">Synaptically driven state transitions in distal dendrites of striatal spiny neurons.</a> Nature Neuroscience. 14 (7), 881-888 (2011).</li><li>Galtieri, D. J., Estep, C. M., Wokosin, D. L., Traynelis, S., Surmeier, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pedunculopontine+glutamatergic+neurons+control+spike+patterning+in+substantia+nigra+dopaminergic+neurons.">Pedunculopontine glutamatergic neurons control spike patterning in substantia nigra dopaminergic neurons.</a> Elife. 6, (2017).</li><li>Yasuda, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+calcium+concentration+dynamics+in+small+neuronal+compartments.">Imaging calcium concentration dynamics in small neuronal compartments.</a> Science STKE. (219), pl5 (2004).</li><li>Inoue, S., Spring, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Video microscopy: The fundamentals. , 163-186 (1997).</li><li>Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonlinear+magic:+multiphoton+microscopy+in+the+biosciences.">Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences.</a> Nature Biotechnology. 21 (11), 1369-1377 (2003).</li><li>Maravall, M., Mainen, Z. F., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimating+intracellular+calcium+concentrations+and+buffering+without+wavelength+ratioing.">Estimating intracellular calcium concentrations and buffering without wavelength ratioing.</a> Biophysical Journal. 78 (5), 2655-2667 (2000).</li><li>Wathey, J. C., Nass, M. M., Lester, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Numerical+reconstruction+of+the+quantal+event+at+nicotinic+synapses.">Numerical reconstruction of the quantal event at nicotinic synapses.</a> Biophysical Journal. 27 (1), 145-164 (1979).</li><li>Shih, P. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+and+function+of+nicotinic+acetylcholine+receptors+in+subdivisions+of+medial+habenula.">Differential expression and function of nicotinic acetylcholine receptors in subdivisions of medial habenula.</a> The Journal of Neuroscience. 34 (29), 9789-9802 (2014).</li><li>Verhoog, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Layer-specific+cholinergic+control+of+human+and+mouse+cortical+synaptic+plasticity.">Layer-specific cholinergic control of human and mouse cortical synaptic plasticity.</a> Nature Communications. 7, 12826 (2016).</li><li>Koukouli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotine+reverses+hypofrontality+in+animal+models+of+addiction+and+schizophrenia.">Nicotine reverses hypofrontality in animal models of addiction and schizophrenia.</a> Nature Medicine. 23 (3), 347-354 (2017).</li><li>Xiao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+nicotine+selectively+enhances+&#945;4&#946;2*+nicotinic+acetylcholine+receptors+in+the+nigrostriatal+dopamine+pathway.">Chronic nicotine selectively enhances &#945;4&#946;2* nicotinic acetylcholine receptors in the nigrostriatal dopamine pathway.</a> The Journal of Neuroscience. 29 (40), 12428-12439 (2009).</li><li>Peng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Editing+Vectors+for+Studying+Nicotinic+Acetylcholine+Receptors+in+Cholinergic+Transmission.">Gene Editing Vectors for Studying Nicotinic Acetylcholine Receptors in Cholinergic Transmission.</a> European Journal of Neuroscience. , (2018).</li></ol>

D.L.W. fungerer som en betalt konsulent for Bruker Nano fluorescens mikroskopi.

Valget av PA-Nic/levering metoden er det mest avgjørende skrittet i denne lokaliserte Foto-stimulering teknikken. To metoder, bad programmet og lokale perfusjon, tilbyr hver forskjellige fordeler og begrensninger. Valget er i stor grad påvirket av hvilket nAChR funksjonelle uttrykk i celle type interesse. Ofte er det best å bruke bad program når funksjonelle uttrykk nivået er høyt, som bad program gir en ensartet sonde konsentrasjon rundt innspilte cellen, tilrettelegge data tolkning. Bad applikasjonen også eliminerer behovet for en andre perfusjon pipette vev, gjør hele prosessen lettere. Men forbindelser bad anvendelse av dyre koster mer per forsøk.
Vanligvis omfatter feilsøking prøver å forstå hvorfor nei nAChR aktivisering er sett følgende flash photolysis. Når du arbeider med en celle som ikke har blitt tidligere studert med PA-Nic, etterforskeren skal utføre lokale puff-anvendelse av ACh eller nikotin fastslå om tilstrekkelig reseptorer er funksjonelt uttrykt5. For å bekrefte at systemet er i stand til å oppdage photolysis svar, bør kontroll eksperimenter gjøres i mediale habenula nerveceller som uttrykker store mengder reseptor30. I dette hjernen området er PA-Nic bad programmet mulig, som er å foretrekke for validering eksperimenter. Etter utfører disse validering eksperimenter bør man gå videre til en unstudied celle type. Hvis eksperimentelle systemet er validert og svar er fortsatt svært liten eller uoppdagbar, det kan være berettiget å øke konsentrasjonen av PA-Nic, øke glimtet intensiteten eller puls varighet, legge til en nAChR positiv allosteric modulator å forbedre nAChR aktivitet6, eller en kombinasjon av disse.
Noen ganger uncaging svar er for stor, med betydelige nAChR aktivisering resulterer i indirekte spenning gated Na+ kanal aktivisering og unclamped innover strøm på grunn av dårlig plass klemme. Disse gjenstander, som helt obskure nAChR innover strømninger og gjøre data tolkning umulig, kan elimineres ved inkludering av QX-314 (2 mM) i innspillingen pipette. De kan også bli eliminert ved å redusere konsentrasjonen av PA-Nic eller ved å redusere glimtet intensiteten eller puls varighet. Alle synlig lys bilde-stimulering eksperimenter, må varsomhet utøves når stimulering nettsteder for å unngå utilsiktet stimulering/photolysis over eller under ønsket fokalplanet. I tillegg og når aktuelt, laser makt må alltid være titreres reprodusere fysiologiske responser. Det er spesielt viktig å være klar over z photostimulation når du arbeider med bur ligander, som ligander som aktiveres over/under focal stedet kan fortsatt diffuse og samhandle med de biologiske system (dvs., reseptorer) under studien.
PA-Nic laser flash photolysis kanskje ikke passer for alle etterforskere, som flere begrensninger finnes. Først er den relativt høye kostnadene ved et passende oppsett. Når du arbeider med intakt hjernen skiver, uncaging nær liten diameter strukturer som dendrites krever et sofistikert visualisering system som 2-fotonet mikroskop. Bortsett fra de høye kostnadene ved en Ti:sapphire, tunable IR pulsed laser for resultater 2-fotonet mikroskopi, øker en dual-galvanometer system i stand til selvstendig posisjonering to laserstråler ytterligere systemet kostnadene. Totale systemet kostnadene kan reduseres ved hjelp av en hjemme-bygget system hvis etterforskeren har tilstrekkelig kompetanse og tid til å bygge, feilsøke og vedlikeholde et slikt system. En andre begrensning ofte innebærer lav nAChR funksjonelle uttrykk som kan være delvis motvirket av tiltak som nevnt ovenfor, men dette kan ikke garantere suksess. Vanligvis, hvis man ikke kan måle ligand-aktivert strøm etter puff-anvendelse av agonister, PA-Nic flash photolysis under spenning klemme kan ikke gi akseptable resultater. En tredje begrensning innebærer den iboende fluorescens av PA-Nic. PA-Nic absorberer ~ 405 nm lys og slipper ut i et lignende område som grønne fluorescerende protein (GFP) eller Alexa 4885. Når PA-Nic konsentrasjoner overskrider ~ 1 mM, kan fluorescens egenskapen gjøre det utfordrende å visualisere samtidig neuronal strukturer. For å løse dette, er det avgjørende å kunne enkelt kontrollere flyten av PA-Nic fra perfusjon pipette. Regelmessig ble PA-Nic flyten stoppet for å tillate fluorescerende molekyler å spre bort. Dette tillatt re-tenkelig av Nevron for å sjekke uncaging strålen spot posisjon. En fjerde potensielle begrensning å nevne innebærer bruk av 405 nm lys for photolysis. Kortere bølgelengder som 405 nm er mer utsatt for spredning i komplekse vev som en hjerne skive. Dermed på en gitt blits intensitet og varighet påvirkes uncaging svar amplitudes og forfall kinetics narkotikalovgivningen av dybden på uncaging fokus i stykket. Konklusjoner om biologiske aspekter av nAChRs ta dette viktig påminnelse.
Denne lokaliserte laser flash photolysis teknikken har nylig blitt brukt å avdekke nye detaljer om nAChR nevrobiologi. For eksempel forbedrer kronisk nikotin eksponering perisomatic og dendrittiske nAChR funksjon i mediale habenula neurons5. Det ble også brukt til å demonstrere, for første gang, at ventrale tegmental området glutamat neurons uttrykke funksjonell nAChRs i perisomatic og dendrittiske mobilnettet rom6. Det er mange mulige fremtidige bruker denne teknikken, og tilnærmingen kan brukes på andre viktige Nevron typer som er kjent for å uttrykke nAChRs, som kortikale pyramidale nevroner31 eller interneurons i hjernebarken32, striatum33 , og hippocampus19. Denne teknikken kan også kombineres med farmakologi og/eller nAChR gene redigering34 for å lokalisere bestemt reseptor undertypene til forskjellige neuronal avdelinger. Tilnærming kan lett tilpasses andre kumarin-bur forbindelser, inkludert men ikke begrenset til, de utviklet parallelt med PA-Nic5. Endelig bli PA-Nic flash photolysis kan en dag brukt i en våken/oppføre dyr for å studere nikotin er handlingen i romanen atferdsmessige farmakologi paradigmer.

Cholinergic signalering modulerer tallrike hjernen prosesser, inkludert attentional kontroll, volitional bevegelse og belønning1,2. Stoffer som forbedrer acetylkolin (ACh) overføring brukes til å behandle kognitiv svekkelse forbundet med Alzheimers sykdom, antyder en viktig rolle for cholinergic systemer i kognisjon3. En bedre forståelse av cholinergic reseptorer og krets i friske og syke tilstander kan føre til bedre terapeutiske metoder for flere nevrologiske sykdommer/lidelser.
Nikotinsyre ACh reseptorer (nAChRs) er en familie av ligand-gated ionekanaler som flux kasjoner svar på endogene ACh eller eksogene nikotin fra tobakksprodukter. Gitt det faktum at de var blant første nevrotransmitter receptors skal beskrives4, er nAChR farmakologi og beliggenhet i muskelfibre lett å forstå for muskel-type reseptorer. Derimot er relativt lite kjent om farmakologi og subcellular fordeling av innfødte nAChRs i hjernen. Dette gapet i kunnskap ble nylig behandlet ved å utvikle en roman kjemiske sonde som tillater romlig begrenset og rask aktivering av nAChRs i hjernevevet under mobil bildebehandling og elektrofysiologiske innspillingen5. Her, er de viktigste metodologiske trinnene involvert i denne tilnærmingen beskrevet, med det overordnede målet for å styrke evnen til å koble nAChR fungere med neuronal struktur.
Photoactivatable nikotin (PA-Nic, kjemisk navn: 1-[7-[bis(carboxymethyl)-amino] kumarin-4-yl] metyl-nikotin) kan photolyzed med ~ 405 nm laser blinker å gi effektivt nikotin5,6. Før uncaging, PA-Nic er stabil i løsningen og utstillinger ingen uheldige farmakologiske eller fotokjemisk funksjoner5. Etter photolysis, utgitt nikotin forutsigbart aktiverer nAChRs og uncaging biprodukter er farmakologisk inert5. En continuous-wave laser brukes som photolysis lyskilden med en utgangseffekt > 1 mW målt på prøven. Når lokalisert, målrettet Foto-stimulering er kombinert med muligheten til å finne mobilnettet membraner med 2-fotonet laserskanning mikroskopi (2PLSM), og de to viktigste fordelene med denne tilnærmingen er fullt ut realisert: photolysis fart og romlig presisjon.
I de fleste henseender er photolysis av PA-Nic overordnet andre metoder for å levere nAChR ligander til reseptorer i hjernen skiver. Disse inkluderer bad programmet7 og lokale stoffet levering via en puffer pipette8. Mens tidligere tilnærming tendens til å over-understreke de langsiktige effektene av brukte stoffet, kan sistnevnte tilnærming lide av variasjon i svaret kinetics mellom forsøk og i celler. Ingen av disse alternative metodene kan tilstrekkelig skille reseptor aktiviteter i mobilnettet steder fra samme Nevron. Optogenetically-aktivert versjon av ACh er brukt for undersøkelse av innfødte nAChRs9,10,11, men det har ikke vist seg nyttig for kartlegging subcellular nAChR steder. Videre, de fleste studier utnytte denne tilnærmingen har stolt på ChR2-uttrykke bakteriell kunstig kromosom transgene mus med unormal cholinergic overføring12,13,14, 15 , 16 , 17.
PA-Nic photolysis er ikke bare optisk tilnærming for å studere cholinergic reseptorer. En bur carbachol ble brukt til å tilordne funksjonelt ACh reseptor aktiviteter i kulturperler celler18 og hjernen skiver19, men var ikke kommersielt tilgjengelig for komparative studier under utviklingen av PA-nettverkskortet. En selskapets bis (bipyridine)-nikotin komplekse (RuBi-nikotin) ble rapportert å ha nikotin uncaging20, men kommersielle preparater av RuBi-nikotin viste seg underlegne PA-Nic i en head-to-head sammenligning studere5. Det kan være nyttig å gjenta slike sammenlignende eksperimenter med ikke-kommersielle svært renset RuBi-nikotin, som sine synlig absorpsjon kan kompliment PA-nettverkskortets funksjoner for cholinergic studier. Til slutt, nAChRs har også blitt optisk manipulert ved hjelp av en kombinasjon av foto-valgbar ligander og genetisk endret reseptorer21. Denne tilnærmingen er utfyllende til PA-Nic photolysis i hjernevev, med evne til/kravet til genetisk målretting av den endrede nAChR sett både en fordel og en ulempe.
Flere viktige krav av denne tilnærmingen bør bemerkes. Først er en passende visualisering metode nødvendig for å nøyaktig finne neuronal membranen. Bildebehandling med konvensjonelle epi-fluorescens mikroskopi kan være tilstrekkelig når studere kulturperler celler, men for opptak fra nerveceller i hjernen skiver eller andre tykk vev preparater, 2PLSM eller AC confocal mikroskopi er et krav. Andre er en egnet metode nødvendig å plassere photolysis laserstrålen. Denne tilnærmingen utnytter en dual-galvanometer Skannerhodet med to uavhengige XY speil for raster skanning av tenkelig strålen, og punktet photoactivation med de uncaging laser stråle22,23,24. Andre, mer begrenset løsninger er mulig, for eksempel (1) en enkelt-galvanometer Skannerhodet at alternativt raster skanner tenkelig strålen og uncaging strålen, eller (2) bare beordrer uncaging strålen til midten av synsfeltet slik at cellen er brakt til denne posisjonen for flash photolysis. Tredje, et system er nødvendig for samtidige elektrofysiologiske opptak hvis man ønsker å samle fysiologiske signaler under eksperimenter. Kravene ovenfor kan bli møtt med en egnet all-optisk tenkelig teknikk, som nylig beskrevet5. Nedenfor en detaljert protokoll er inkludert som beskriver de viktigste trinnene av denne tilnærmingen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Instruments, Consumables, and Miscellaneous Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiclamp 700B</td>
			<td>Molecular Devices Corp.</td>
			<td></td>
			<td>Patch clamp amplifier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pneumatic Picopump</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>PV820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instrument Co</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature Controller</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>TC-324C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibrating blade microtome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>VT1200S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrafree-MC Centrifugal Filter</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>UFC30GV0S</td>
			<td>internal solution filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass Capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B150F-4</td>
			<td>patch and local application pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(-)-Nicotine hydrogen tartrate salt</td>
			<td>Glentham</td>
			<td>GL9693</td>
			<td>nicotine salt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7-carboxymethylamino-4-methyl coumarin</td>
			<td>Janelia Research Campus</td>
			<td></td>
			<td>PA-Nic by-product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-[7-[bis(carboxymethyl)- amino]coumarin-4-yl]methyl-nicotine</td>
			<td>Janelia Research Campus</td>
			<td></td>
			<td>PA-Nic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Euthasol (Pentobarbital Sodium and Phenytoin Sodium)</td>
			<td>Virbac</td>
			<td>ANADA #200-071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa FluorTM 488 Hydrazide</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A10436</td>
			<td>green fill dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa FluorTM 568 Hydrazide</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A10437</td>
			<td>red fill dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-carboxy-AF594 (Alexa Fluor 594)</td>
			<td>Janelia Research Campus</td>
			<td></td>
			<td>red fill dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX 314 chloride</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2313</td>
			<td>voltage-gated sodium channel blocker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power Meter&#160;</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>S120C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals for Solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Methyl-D-glucamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic monohydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(+)-Sodium L-ascorbate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiourea</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>230391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>223506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&#8242;,N&#8242;-tetraacetic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8242;-triphosphate magnesium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanosine 5&#8242;-triphosphate sodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Components of 2-Photon Microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Ultima Laser Scanner for Olympus BX51 Microscope</td>
			<td>Bruker Nano, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>imaging software and galvos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160; Imaging X-Y galvanometers</td>
			<td>Cambridge Technology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Mai Tai HP1040</td>
			<td>Spectra-Physics</td>
			<td></td>
			<td>Tuneable IR laser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; &#160;&#160;&#160;&#160;&#160;Pockels cell M350-80-02-BK with M302RM Driver</td>
			<td>Conoptics, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>for IR laser attenuation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Integrating Sphere Photodiode Power Sensor</td>
			<td>Thorlabs, Inc</td>
			<td></td>
			<td>laser power pick-off photodiode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160; Uncaging X-Y galvanometers</td>
			<td>Cambridge Technology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Helios 2-Line Laser Launch</td>
			<td>Bruker Nano, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>uncaging laser components</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; OBIS LX/LS 405 nm (100 mW)</td>
			<td>Coherent, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; OBIS LX/LS 473 nm (75 mW)</td>
			<td>Coherent, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; &#160;Point-Photoactivation / Fiber Input Module for Limo Sidecar - Uncaging</td>
			<td>Bruker Nano, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upright Microscope</td>
			<td>&#160;Olympus</td>
			<td>BX51WIF</td>
			<td>Upright microscope chasis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160; Objective: Olympus M Plan FL 10x; NA 0.3 WD 11 mm</td>
			<td>&#160;Olympus</td>
			<td></td>
			<td>10x objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160; Objective: Olympus M Plan Fluorite 60x/1.0 WD=2mm NIR</td>
			<td>&#160;Olympus</td>
			<td></td>
			<td>60x water-dipping objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160; X-Cite 110, four-LED LLG coupled epi-fluorescence light source</td>
			<td>Excelitas Technologies</td>
			<td></td>
			<td>LED Light Source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Epi-Fluorescence Filter: ET-GFP (FITC/CY2) for Epi-Turret</td>
			<td>Chroma Technologies</td>
			<td></td>
			<td>LED Filter for blue light excitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Epi-Fluorescence Filter: ET-DsRed (TRITC/CY3) for Epi-Turret</td>
			<td>Chroma Technologies</td>
			<td></td>
			<td>LED Filter for green light excitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160; B&#38;W CCD camera; Watec, 0.5in B/W CCD</td>
			<td>Watec Co., LTD.</td>
			<td></td>
			<td>CCD camera for patch clamp recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>External Detectors - Dual Reflected Emission - Olympus Upright (Multi-Alkali, GaAsP)</td>
			<td>Bruker Nano, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160; Multi-alkali side-on PMT</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>R3896</td>
			<td>red channel PMT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 595/50m</td>
			<td>Chroma Technologies</td>
			<td></td>
			<td>red channel emission filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 565lpxr</td>
			<td>Chroma Technologies</td>
			<td></td>
			<td>dichroic beam splitter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160; GaAsP end-on PMT</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>7422PA-40</td>
			<td>green channel PMT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 525/70m</td>
			<td>Chroma Technologies</td>
			<td></td>
			<td>green channel emission filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; High-Speed Shutter for Hamamatsu H7422 PMT</td>
			<td>Vincent Associates / Bruker</td>
			<td>517329</td>
			<td>PMT shutter mount</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dodt Gradient Contrast Transmission Detection Module</td>
			<td>Bruker Nano, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160; Multi-alkali side-on PMT</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>R3896</td>
			<td>Dodt PMT</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

probing nicotinic acetylcholine receptor function in mouse brain slices via laser flash photolysis of photoactivatable nicotine

Acetylcholin (ACh) fungerer gjennom reseptorer å modulere en rekke neuronal prosesser, men det har vært utfordrende koble ACh reseptor funksjon subcellular beliggenhet i celler der denne funksjonen blir utført. For å studere subcellular plasseringen av nikotinsyre ACh reseptorer (nAChRs) i native hjernevev, ble en optisk metoden utviklet for presis utgivelsen av nikotin diskret steder nær neuronal membraner under elektrofysiologiske innspillinger. Patch-festet nerveceller i hjernen skiver er fylt med fargestoff visualisere deres morfologi under 2-fotonet laser skanning mikroskopi og nikotin uncaging utføres med en lys flash ved å fokusere en 405 nm laserstråle nær én eller flere mobilnettet membraner. Mobilnettet gjeldende avvisninger er måles og tredimensjonale (3D) oppløsning av innspilte Nevron er laget for å tillate avstemming av nAChR svar med cellular morfologi. Denne metoden gir detaljert analyse av nAChR funksjonelle distribusjon i komplekse vev preparater, lovende å forbedre forståelsen av cholinergic neurotransmission.

Photolysis er stimulering, eksponering dose (intensitet og tid), eksponering plasseringen og strålen geometri viktige variabler. Systemet er beskrevet i denne artikkelen er dugelig av to forskjellige photostimulation bjelker, justerbar via flytte en linse inn/ut av photostimulation lys banen før strålen kommer inn i galvanometer-systemet. Uten dette objektivet, photostimulation strålen fyller inngangen eleven av 60 x / 1.0 NA vann-dipping [60 x WD] mål, produsere en nær-Diffraksjon-begrenset, sub-µm plass ved fokalplanet inne prøven. Dette er forbundet med photostimulation lys med en timeglass form, strekker seg over og under focal stedet symmetrisk med den optiske aksen. Med linsen inn banen, photostimulation laserlys er fokusert på inngangen elev av linsen og avslutter som en blyant-like bjelke. Denne stråle, som forventes å bli ~ 10 µm i diameter for en 60 x målsetting, plassert mellom/loddrett gjennom utvalget. I denne modusen blir lysintensiteten på gitt overalt i stimulering stedet ~ 1% av nær-Diffraksjon-begrenset liten flekk intensiteten. Dermed er høyere laser krefter vanligvis nødvendig ved ~ 10 µm spot stimulering. For alle eksperimenter i denne artikkelen, ble et timeglass-type photostimulation strålen brukt.
Leverte eksempel makt kan tegnes mot innstillingen inngangsspenning etter måling laser makt på prøven ved hjelp av en strømmåleren. Disse studiene bruker en 60 x WD målet med en arbeidsavstand 2 mm, men det er ikke senkes ned i vann for makt mål å unngå potensielle skader detektor elementet. Når målene listet NA > 0,95 måles i luften (uten nedsenkning væske), kan det være totalt interne refleksjon tap på linsen forsiden elementet på grunn av lavere indeksen (luft). I dette tilfellet for en mer nøyaktig utvalg ytelsesmåling (for å rette for total intern refleksjon tap), øke den målte strømmen av 1.0 NA objektiv (1.0/0,95)2 målt i luften. Figur 1a viser et typisk inndata/utdata-plott for 405 nm og 473 nm synlig lasere som er innlemmet i laser starte systemet i denne studien. Disse laser systemer er ideelle for foto-stimulering EKSPONERINGSKONTROLL dose av følgende årsaker: (1) de er pre kalibrert å gi direkte lineær effekt i forhold til Inngangsspenning (0-5 V), (2) de gir en stille utløser operasjon (med ingen laser utgang), og (3) de har rask, sub-ms intensitet pulsstyring varighet (0,1 ms respons). Når du bruker flekk Foto-stimulering med en laser/galvo, er rutinemessige kalibrering av MarkPoints en viktig oppgave. Figur 1b (venstre panel) viser et system er kalibrering (ønsket punkt å stimulere til Foto ikke fører nøyaktig stimulering av det punktet, som indikert av brannsår-plasseringen), med en tilbakevending til nøyaktig plassering av sted etter kalibrering ( Figur 1b, høyre panel). 
PA-Nic er beskjedent fluorescerende (utslipp peak på ~ 510 nm), viser effektiv eksitasjon mellom 350-450 nm (1-fotonet eksitasjon) eller 700-900 nm (2-fotonet eksitasjon)5. For å visualisere PA-Nic under lokalt program, PA-Nic (1 mM) ble brukt i nærheten hjernevev etterfulgt av samtidige imaging (1) hjernen vev optisk delt overføring sammenhengen via Dodt kontrast og (2) slippes ut fluorescens fra eksitasjon (900 nm) av PA-Nic. PA-Nic 2PE fluorescens var lett synlig under press utstøting fra et lokalt program Pipetter (figur 2a). Nikotin og en monoalkylcoumarin, 7-carboxymethylamino-4-metyl kumarin, er de viktigste fotokjemisk produktene av PA-Nic photolysis reaksjon5. Bruker samme imaging innstillinger/parametere som ble brukt til PA-Nic imaging, ble vevet avbildet i enten den ene eller den andre av nikotin (1 mM) / 7-carboxymethylamino-4-metyl kumarin (1 mM). Ingen fluorescerende signal ble oppdaget (figur 2a, midterste og nedre paneler) viser spesifisitet av PA-Nic resultatene. Til slutt, PA-Nic ble brukt i hjernevevet og PA-Nic fluorescens utslipp ble avbildet (figur 2b). Dette bekrefter at PA-Nic finnes innenfor 100-200 µm av lokalt program pipette. Sammen bekrefte disse data at PA-Nic effektivt leveres til hjernen vev via lokale programmet.
Elektrofysiologi opptak med samtidige 2PLSM for visualisering av cellulære strukturer krever etterforsker til balanse betraktninger for begge komponentene av eksperimentet, og ofte en smale vinduet (~ 20 min) er tilgjengelig for gyldig eksempel datainnsamling fra en lappet celle. Uten betraktning mobilnettet visualisering, er det best å begynne innspillingen så snart som mulig etter innbrudd fordi innspillingen stabilitet tendens til å avta med tid. Men når imaging er et krav, må elektrofysiologiske hensyn tillate tilstrekkelig tid for fluorescens konsentrasjonen øker i små/eksterne strukturer. Dette er eksemplifisert ved å undersøke en dye konsentrasjon fylle kurve28, som er noen ganger nyttig å avlede når imaging en ny celle type. Figur 3 viser flere eksempel neurons avbildet som Z-stabler via 2PLSM og kollapset i en maksimale intensitet projeksjon for presentasjon formål. Figur 3a viser høy kvalitet bilder der neuronal morfologi synes å være komplett, støy er minimert og rusk forstyrrer ikke tolkning av mobilnettet morfologi. Figur 3b viser bilder av lavere kvalitet, en lavere signal-til-bakgrunn forhold og store rusk. Dette rusk vises ofte som sfærisk lommer av intens fluorescens, fremkommer fra utstøting imaging fargestoff fra oppdateringen pipette mens nærmer cellen. Spesielt inkludering av 100 µM PA-Nic i badekaret (når bad programmet) tendens til å redusere signal-til-bakgrunn forholdet og fører til sub-optimale bildekontrasten. Alexa Fluor 568 eller 594 er ofte ganske nyttig i lokalt program eksperimenter som en finder fargestoff eller en normalisering 2PE referanse/normalisering signal. En effektiv bølgelengde for to-fotonet magnetisering av disse fargestoffer er ~ 780 nm27, som tillater samtidig visualisering av PA-Nic og identifikasjon av mobilnettet avdelinger. Denne bølgelengde, men unngå ikke helt to-fotonet photolysis PA-Nic5. Alexa Fluor 488 er fordelaktig PA-Nic bad-program eksperimenter; Når opphisset med en egnet bølgelengde ≥900 nm, kan to-fotonet photolysis PA-Nic5 unngås samtidig opprettholde egnet visualisering mobilnettet rom.
Figur 4 viser eksempeldata for lokaliserte PA-Nic laser flash photolysis MHb nerveceller i hjernen skiver. Figur 4a (øvre panel) viser et eksempel på en "referanse", som er et skjermbilde av det siste 2PLSM bildet tatt før MarkPoints protokollen ble kjørt, kledde med foto-stimulering spot plasseringen. Figur 4a (lavere bilde paneler) viser en zoomet visning av foto-stimulering spot over mobilnettet morfologi. Den tilsvarende tid-korrelert elektrofysiologiske svaret på PA-Nic photolysis vises i den nedre paneler av figur 4a. Tidligere arbeid har vist at disse strømmer er følsomme for nAChR antagonister5. Figur 4b viser representant data fra forskjellige celler hvor enkelt spot photolysis ble utført på et intervall på enten 1 s eller 10 s. mens en 10 s intervall tillatt utvinning tid for den opprinnelige holder gjeldende, et kortere 1 s intervall førte til en gradvis økning i beholdning som protokollen fortsatte. Den økende gjeldende antyder at nikotin ikke har nok tid til å spre fra systemet med 1 Hz intervall29. Slike timelige respons analyser må være utført de novo på en ny celle type blir studert, som neuropharmacology av nAChRs kan variere mellom celletyper.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58873/58873fig1.jpg"> Figur 1: Photostimulation laser kalibrering. (en) Foto-stimulering laser utgangseffekt. Makt på prøven flyet (gjennom en 60 x / 1.0 NA vann-dipping mål) ble målt for 405 nm og 473 nm Foto-stimulering lasere på innstillingen angitt utdata. (b) Foto-stimulering laser kalibrering. Skjermen fange profilen viser romlige forholdet mellom tiltenkte Foto-stimulering stedet og den tilsvarende plasseringen der Foto-stimulering oppstod (brenne hull) før (venstre) og etter (til høyre) kjører kalibrering i MarkPoints. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58873/58873fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58873/58873fig2.jpg"> Figur 2: PA-Nic lokalt program. (en) oppdagelsen av PA-Nic fra en lokal applikasjon pipette. 1 mM PA-Nic, photolysis biprodukt eller nikotin ble oppløst i ACSF, lastes inn i et lokalt program pipette og utlevert på hjernevev under 2PLSM (900 nm eksitasjon) imaging med samme tenkelig innstillinger av hvert legemiddel. Laserskanning Dodt kontrast overføring bildet viser vev/pipette mens en GaAsP katode avdrag ble brukt til å fange fluorescens utslipp. (b) PA-Nic (1 mM) var parfyme i hjernevevet og fotografert via 2PLSM som (en) vise lateral spredning av PA-Nic med sin iboende fluorescens. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58873/58873fig2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58873/58873fig3.jpg"> Figur 3: oppkjøp av 2-fotonet laserskanning mikroskopi bilder. (en) optimale 2PLSM Z-stabler. To eksempler på 2PLSM Z stabel maksimale intensitet anslag er vises MHb neurons med godt løst dendrites og lite til ingen forstyrrende rusk. (b) sub-optimale 2PLSM Z-stabler. To eksempler på 2PLSM Z stabel maksimale intensitet anslag vises for MHb neurons omgitt av rusk (fargestoff utvist fra pipette under cellen tilnærming). Slike bilder er vanskeligere å tolke enn bilder som de vises i (en). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58873/58873fig3large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58873/58873fig4.jpg"> Figur 4: Laser flash photolysis av PA-NIC (en) MarkPoints referanse bilder og innover strøm fremkalt av PA-Nic photolysis. For en MHb Nevron vises rå referanse bilder for MarkPoints Foto-stimulering forsøk på en enkelt (angitt) mobilnettet plassering. Merk at noen Foto-stimulering steder (høyre bildet i denne serien) dendrittiske strukturen er i fokus, men det soma og proksimale dendrite er ikke. Under hvert referanse bilde tegnes nikotin uncaging-utløste innover gjeldende. (b) mellom stimulans intervaller for PA-Nic photolysis. Exemplar opptak vises for MHb neurons der nikotin var gjentatte ganger uncaged på samme perisomatic sted med et intervall mellom stimulans 1 s eller 10 s. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58873/58873fig4large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Probing Nicotinic Acetylcholine Receptor Function in Mouse Brain Slices via Laser Flash Photolysis of Photoactivatable Nicotine at JoVE.com

Probing Nicotinic Acetylcholine Receptor Function in Mouse Brain Slices via Laser Flash Photolysis of Photoactivatable Nicotine

Denne artikkelen presenterer en metode for å studere nikotinsyre acetylkolin reseptorer (nAChRs) i musen hjernen skiver av nikotin uncaging. Når kombinert med samtidige oppdateringen klemme opptak og 2-fotonet laserskanning mikroskopi, forbinder nikotin uncaging nikotinsyre reseptoren funksjonen med cellular morfologi, gir en dypere forståelse av cholinergic nevrobiologi.

Verifiserer nikotinsyre acetylcholin reseptor-funksjonen i musen hjernen skiver via Laser Flash Photolysis Photoactivatable nikotin

Acetylcholine (ACh) acts through receptors to modulate a variety of neuronal processes, but it has been challenging to link ACh receptor function with ...

Denne teknikken utnytter multi-foton laserskanning mikroskopi i forbindelse med laser-flash fotolyse av en fotoaktiverbar nikotin molekyl. Tillater presis aktivering av nikotinkolinerge reseptorer. Denne teknikken gir mulighet for fin spatiotemporal kontroll over nikotinreseptoragonistapplikasjon, noe som gir et kraftig verktøy for studiet av reseptorfunksjonelle uttrykksmønstre og kolinerge synaptisk eller volumoverføring.Før du begynner prosedyren, bruk en programmerbar pipette avtrekker til å trekke en glassmikropipette med en 20-til 40-mikrometeråpningsdiameter. Stamme omtrent en milliliter opptaksløsning gjennom et 0,22-mikronfilter. Og resuspend nok lyofilisert fotoaktiverbar nikotin i den filtrerte opptaksløsningen for å gi en to millimolar endelig konsentrasjon.Fyll tilbake den trekkede lokale applikasjonsmikropipetten med 50 mikroliter av det fotoaktivatable stoffet, og fest pipetten i en pipetteholder montert på en mikromanipulator. Koble pipetteholderen via en passende slangelengde til et trykkutstøtingssystem som er i stand til vedvarende lavtrykksapplikasjon. Og bruk mikromanipulatoren til å manøvrere den lokale applikasjonspipetten i den ekstracellulære opptaksløsningen.Plasser pipettespissen litt over en mushjernevevsprøve, ca. 50 mikrometer fra interessecellen. Og kort bruke en til to pounds per kvadrattomme av trykk på pipetten. Det bør være minimal eller ingen forskyvning av cellen av interesse.Etter å ha oppnådd en stabil helcelleplastklemme, slå på den lave applikasjonen på trykkutstøtingsenheten, og metter vevet rundt cellen med fotoaktiverbar nikotin i ett til to minutter. Lokal applikasjon introduserer ekstra kompleksitet til eksperimentet. Men det sparer sammensatte og tillater høyere konsentrasjoner av PA-Nic som skal benyttes.For bad påføring av fotoaktiverbar nikotin oppløses først nok av det lyofiliserte stoffet i et volum av opptaksløsning som passer for kontinuerlig resirkulering til en 100 mikromolar endelig konsentrasjon. Og last den resulterende blandingen inn i et perfusjonssystem. Deretter begynner resirkulering av den fotoaktive nikotinløsningen med en hastighet på 1,5 til 2 millimeter per minutt, ved hjelp av rør med minimal indre diameter og total lengde for å minimere det nødvendige resirkuleringsvolumet.Under resirkulering, kontinuerlig boble løsningen med karbaogen, og opprettholde badetemperaturen ved 32 grader Celsius under dårlige lysforhold. Bath søknad drar nytte av enkelhet og ensartethet av PA-Nic permeasjon av vevet. Men det bruker nødvendigvis lavere mikromolar PA-Nic konsentrasjoner, og bruker høyere totale mengder sammensatte.For live visualisering av en medial habenula neuron, bruk overført lys eller infrarød differensial interferens kontrast optikk og et videokamera for å etablere en stabil, helcellet patch klemme opptak. Etter å ha etablert den høymotstandscelle-tilkoblede konfigurasjonen, men før innbrudd, bytter du oppsettet og programvaren til laserskanningsmodus. Etter innbrudd, bruk laserskanning for å bekrefte at bildefargen av interesse passivt fyller nevronen ved diffusjon.La fargestoffet fylle cellulære rom i minst 20 til 30 minutter før du bruker live scan-funksjonen til å visualisere nevronen og det subcellulære rommet av interesse. Velg bildeparametere som tillater en nøyaktig live visualisering av de nevronale funksjonene, manipulere de riktige innstillingene for å påvirke eller endre skjermvisualisering, oppløsning, signal-til-støy-forhold og bilderammeanskaffelsestid etter behov. For å forbedre signalkontrasten åpner du oppslagstabellvinduet og justerer oppslagsbordet og takinnstillingene.Hvis du vil finne et interesseområde i vevet, velger du 1X optisk zoom og bruker panoreringskontrollene. Bruk Z-serien til å velge en start- og stoppposisjon som inneholder cellen av interesse. Angi en trinnstørrelse på ett mikrometer, og velg en bildestørrelse som gir et bilde med høyest oppløsning.Ofte 1, 024 med 1, 024 piksler per linje. Deretter bilde neuronet i hvert Z-plan som inneholder cellen. For å kalibrere laserstimuleringen, start systemskanningen med en bildelasereffekt som er større enn minimum, og finjuster objektivfokuset på det tynne røde markørfluorescenslaget.Velg et område i fluorescensfeltet uten rusk og jevnt belagt med markør, og åpne verktøy-, kalibrerings- og justeringsmenyen for å velge den uavklarende galvokalibreringsfunksjonen. Følg brenne flekker opplæringen for romlig kalibrering av den andre galvanometer speil par, velge 405-nanometer laser, en laser stimulering kraft på 400, og en stimulering varighet på 20 millisekunder. For å gi en-til-fem-mikrometer diameter hull i den røde markøren.Velg oppdatering for å stimulere og oppdatere bildet etter midtpunktbrenningen, og flytt den runde røde indikatoren til den faktiske spotplasseringen til de midterre, midtre og nedre midtpunktene for å få et rutenett på ni punkter. Hvis du vil teste kalibreringen, åpner du merkepunktvinduet og aktiverer stimuleringsparametrene for de definerte flekkene manuelt i et nytt område av prøven, og tar vare på at den riktige siste kalibreringsfilen lastes inn i merkepunktvinduet. Påfør deretter en testpuls for å verifisere riktig kalibrering.Hvis du vil bilde av og finne det subcellulære interesseområdet, velger du live scan og bruker øke den optiske zoomen til å visualisere eventuelle små strukturer etter behov. Plasser markpunktet enkeltflekks trådkors umiddelbart ved siden av cellemembranen, og sett fotostimuleringsparametrene til en 1-50-millisekund varighet, en en-til fire-milliwatt laserkraft og minst en studie. Velg deretter kjøremerkepunkter for å starte markpunktprotokollen, og observere elektrofysiologidatainnsamlingen i sanntid.Fotoaktiv nikotin 2PE fluorescens av en millimolar PA-Nic oppdages lett under trykkutstøting fra en lokal applikasjonpipette som demonstrert. Mens levering av de viktigste fotokjemiske produktene av den fotoaktive nikotinfotolysereaksjonen ikke genererer noe fluorescerende signal ved samme konsentrasjon og eksitasjonskraft og bølgelengde. Viser spesifisiteten til de fotoaktive nikotinresultatene.Avbildning av fotoaktiverbar nikotin som påføres hjernevevet som demonstrert avslører tilstedeværelsen av stoffet innen 100 til 200 mikrometer av den lokale applikasjonspipetten. Bekrefter at fotoaktiverbar nikotin effektivt kan leveres til hjernevevet via lokal applikasjon. Her er bilder av høy kvalitet der den nevronale morfologien ser ut til å være komplett, støyen minimeres, og ruskene forstyrrer ikke tolkningen av cellulær morfologi, vises.Disse bildene er imidlertid av lavere kvalitet. På grunn av et lavere signal-til-bakgrunn-forhold og betydelig rusk. Paring to-foton laser skanning mikroskopi av mediale habenula nevroner i hjernen skiver med laser flash fotolyse av PA-Nic som demonstrert, gjør det mulig for avstemming av elektrofysiologiske responser med cellulær morfologi.Fotolyse på ett punkt som utføres med 10-sekunders intervaller, gir tilstrekkelig restitusjonstid for grunnlinjeholdestrømmen. Mens et kortere intervall på ett sekund fører til en gradvis økning i holdestrømmen etter hvert som protokollen fortsetter. Noe som tyder på at nikotinet ikke har nok tid til å spre seg bort fra systemet med kortere intervaller.Ved å utforme eksperimenter som bruker fotoaktive molekyler, er det viktig å huske å velge fluorescerende indikatorer og rapportere fluoroforer med kompatible eksitasjonsutslippsspektra. PA-Nic er kompatibel med de vanligste fluoroforene på grunn av sin korte bølgelengde fotolyse topp. Når du velger den mest hensiktsmessige PA-Nic-applikasjonsteknikken, er det viktig å nøye vurdere det funksjonelle uttrykket, den fysiologiske aktiviteten til nikotinreseptorene i nevronene av interesse.Dyktig utnyttelse av denne teknikken gir mulighet for fin spatiotemporal kontroll av nikotinapplikasjon, noe som muliggjør spennende nye muligheter for å studere kinetikken til innfødt nikotinreseptorengasjement, subcellulær lokalisering og modulering av nevronal aktivitet ved nikotinreseptoraktivering.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Flash Photolysis of Caged Compounds in the Cilia of Olfactory Sensory  Neurons

Flash Fotolyse av Caged forbindelser i Cilia av olfactory sensoriske nevroner

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. ...

Spectral Confocal Imaging of Fluorescently tagged Nicotinic Receptors in Knock-in Mice with Chronic Nicotine Administration

Spectral confocal Imaging av fluorescently tagget nikotinreseptorene i Knock-in Mus med kronisk Nikotin Administrasjon

Ligand-gated ion channels in the central nervous system (CNS) are implicated in numerous conditions with serious medical and social consequences.  For ...

Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

Bildebehandling Kalsium Responses i GFP-merket Neurons av hypothalamus mus hjernen Slices

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the ...

Local Application of Drugs to Study Nicotinic Acetylcholine Receptor Function in Mouse Brain Slices

Tobacco use leads to numerous health problems, including cancer, heart disease, emphysema, and stroke. Addiction to cigarette smoking is a prevalent ...

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

In vivo Postnatal Electroporation og Time-lapse Imaging av neuroblast Migration in Mouse Akutt Brain Slices

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to ...

Laser-guided Neuronal Tracing In Brain Explants

Laserstyrte Neuronal Tracing i Brain eksplantater

We present a technique which combines an in vitro tracer injection protocol, which uses a series of electrical and pressure pulses to increase dye uptake ...

Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique

Imaging Serotonerge Fibers i Mouse Spinal Cord Bruke CLARITY / CUBIC Technique

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal ...

Studying Brain Function in Children Using Magnetoencephalography

Studere hjernefunksjon hos barn med Magnetoencephalography

Magnetoencephalography (MEG) is a non-invasive neuroimaging technique which directly measures magnetic fields produced by the electrical activity of the ...

Chronic Implantation of Whole-cortical Electrocorticographic Array in the Common Marmoset

Kronisk implantering av hele-kortikale Electrocorticographic matrise i den vanlige Marmoset

Electrocorticography (ECoG) allows the monitoring of electrical field potentials from the cerebral cortex with high spatiotemporal resolution. Recent ...