Name: probing nicotinic acetylcholine receptor function in mouse brain slices via laser flash photolysis of photoactivatable nicotine
Uploaded: 2019-01-25T13:00:00
Duration: 10 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Probing Nicotinic Acetylcholine Receptor Function in Mouse Brain Slices via Laser Flash Photolysis of Photoactivatable Nicotine at JoVE.com

Os autores agradecer laboratório membros dos seguintes investigadores principais noroeste: Ryan Drenan, D. James Surmeier, Yevgenia Kozorovitskiy e empreiteiro de Anis. Este trabalho foi apoiado pela nos National Institutes of Health (NIH) (subsídios, DA035942 e DA040626 para R.M.D.), a Fundação PhRMA (comunhão para M.C.A) e HHMI.

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D.L.W. serve como um consultor pago por microscopia de fluorescência Bruker Nano.

A escolha do método de aplicação/entrega de PA-Nic é o passo mais crítico nesta técnica de foto-estimulação localizadas. Os dois métodos, aplicação de banho e perfusão local, cada um para oferecer limitações e vantagens distintas. A escolha em grande parte é afetada pelo nível de expressão funcional de nAChR no tipo de célula de interesse. Muitas vezes é preferível usar aplicativo de banho quando os níveis de expressão funcional são elevados, como aplicação de banho permite uma concentração de sonda uniforme em torno da célula gravada, facilitando a interpretação dos dados. Aplicação de banho também elimina a necessidade de uma segunda pipeta de perfusão do tecido, facilitando todo o processo. No entanto, aplicação de banho de caro compostos custos mais por experiência.
Comumente, solução de problemas envolve tentando entender por que nenhuma ativação nAChR é visto seguir fotólise de flash. Ao trabalhar com um tipo de célula que não foi previamente estudado com PA-Nic, o investigador deve executar sopro-aplicação local de ACh ou nicotina para determinar se os receptores suficientes são funcionalmente expressa5. Para validar que o sistema é capaz de detectar respostas de fotólise, experimentos de controle deve ser feitos nos neurônios habenula medial que expressam grandes quantidades de receptores30. Nesta área do cérebro, aplicação de banho PA-Nic é possível, que é preferível para experimentos de validação. Somente após a realização desses experimentos de validação deve um passar para um tipo de célula espontâneo. Se o sistema experimental foi validado e respostas permanecem indetectáveis ou muito pequeno, pode ser garantido para aumentar a concentração de PA-Nic, aumentar a intensidade do flash ou duração do pulso, adicionar um modulador alostérico positivo de nAChR realçar nAChR atividade6, ou alguma combinação destes.
Ocasionalmente, uncaging respostas são grandes demais..., com ativação de nAChR significativa, resultando em tensão indireta gated at+ canal ativação e destravadas correntes para dentro devido a braçadeira espaço pobre. Esses artefatos, que completamente obscurecem nAChR correntes para dentro e impossibilitam a interpretação dos dados, podem ser eliminados pela inclusão de QX-314 (2mm) na gravação de pipeta. Eles também podem ser eliminados, reduzindo a concentração de PA-Nic ou reduzindo a intensidade do flash ou duração do pulso. Em todos os experimentos de foto-estimulação de luz visível, deve ter cuidado ao selecionar locais de estimulação para evitar estimulação involuntária/fotólise acima ou abaixo do plano focal desejado. Além disso e quando aplicável, a potência do laser deve ser sempre titulada para reproduzir respostas fisiológicas. É especialmente importante estar ciente do eixo z photostimulation ao trabalhar com ligantes enjaulados, como ligantes são ativadas acima/abaixo do ponto focal podem ainda difusa e interagir com o sistema biológico (ou seja, receptores de, ), em estudo.
PA-Nic do laser flash fotólise pode não ser apropriado para todos os investigadores, como existem várias limitações. O primeiro é o custo relativamente alto de uma configuração adequada. Ao trabalhar com fatias de cérebro intacto, uncaging perto de estruturas de pequeno diâmetro como dendrites requer um sistema de visualização sofisticados, tais como um microscópio 2-fóton. Além do alto custo de um Ti:sapphire, sintonizável laser pulsado de IR para desempenho 2-fotão microscopia, um sistema de dual-galvanômetro capaz de forma independente posicionamento dois feixes de laser mais aumenta o custo do sistema. Os custos do sistema total podem ser reduzidos usando um sistema de repouso-construído, se o investigador tem suficientes conhecimentos e tempo para construir, solucionar problemas e manter um sistema desse tipo. Uma segunda limitação muitas vezes envolve nAChR baixa expressão funcional, que pode ser parcialmente atenuado, dando passos como mencionado acima, mas isto não pode garantir o sucesso. Normalmente, se um não pode medir correntes ligante ativado após o sopro-aplicação dos agonistas, fotólise de flash PA-Nic sob grampo de tensão não pode produzir resultados aceitáveis. Uma terceira limitação envolve o intrínseco fluorescência de PA-NIC. PA-Nic absorve luz de ~ 405 nm e emite em uma faixa similar como proteína verde fluorescente (GFP) ou Alexa 4885. Quando PA-Nic concentrações excedem ~ 1 mM, esta propriedade de fluorescência pode torná-lo difícil de Visualizar simultaneamente estruturas neuronais. Para atenuar isso, é fundamental para ser capaz de controlar facilmente o fluxo de PA-Nic da pipeta perfusão. Periodicamente, o fluxo de PA-Nic foi interrompido para permitir moléculas fluorescentes difundir afastado. Isto permitiu re-imagem latente do neurônio para verificar a posição do feixe de uncaging. Uma quarta limitação potencial mencionar envolve o uso de luz de nm 405 por fotólise. Comprimentos de onda mais curtos tais como 405 nm são mais propensas a dispersão no tecido complexo como uma fatia do cérebro. Assim, em um determinado flash intensidade e duração, amplitudes de resposta uncaging e cinética de decomposição podem ser diferencialmente afectadas pela profundidade do foco uncaging dentro da fatia. Conclusões sobre aspectos biológicos de nAChRs devem considerar esta advertência importante.
Esta técnica de fotólise flash laser localizada recentemente serviu para descobrir novos detalhes sobre neurobiologia nAChR. Por exemplo, exposição crônica de nicotina aumenta a perisomatic e função nAChR dendríticas em habenula medial neurônios5. Ele também foi usado para ajudar a demonstrar, pela primeira vez, que os neurônios glutamato de área tegmental ventral expressam nAChRs funcional em suas perisomatic e compartimentos celulares dendríticas6. Existem que muitos potencial futuro usa essa técnica, e a abordagem poderia ser aplicada a outros tipos de neurônio de chave que são conhecidos por nAChRs expressa, tais como os neurônios piramidais corticais31 ou interneurônios no córtex cerebral32, striatum33 e o hipocampo19. Esta técnica também pode ser combinada com gene farmacologia e/ou nAChR edição34 para localizar subtipos de receptores específicos para diferentes compartimentos neuronais. A abordagem pode ser facilmente adaptada para outros compostos de cumarina-enjaulado, incluindo, mas não limitado a, aqueles desenvolvidos em paralelo com PA-Nic5. Finalmente, PA-Nic flash fotólise um de pode dia ser usado em um animal acordado/se comportando para estudar a ação da nicotina em paradigmas de romance farmacologia comportamental.

Sinalização colinérgicos modula numerosos processos cerebrais, incluindo controle de atenção, movimento volitivos e recompensa1,2. Drogas que melhoram a transmissão da acetilcolina (ACh) são usadas para tratar o impairment cognitive associado com a doença de Alzheimer, sugerindo um papel importante para sistemas colinérgicos na cognição3. Uma melhor compreensão dos receptores colinérgicos e circuitos nos Estados saudáveis e doentes pode levar a melhor abordagens terapêuticas para várias doenças/distúrbios neurológicos.
Receptores nicotínicos da ACh (nAChRs) são uma família de canais iônicos ligante que flux cações em resposta a ACh endógena ou exógena nicotina de produtos do tabaco. Dado o fato de que eles estavam entre os receptores de neurotransmissores primeiros ser descrito4, nAChR farmacologia e localização em fibras musculares é bem compreendida pelos receptores do tipo muscular. Por outro lado, comparativamente pouco é conhecido sobre a farmacologia e a distribuição subcellular de nativo nAChRs no cérebro. Esta lacuna no conhecimento recentemente foi abordada através do desenvolvimento de uma sonda de romance química que permite a ativação rápida e espacialmente restrita do nAChRs no tecido cerebral durante cellular imaging e gravação eletrofisiológicas5. Aqui, são descritas as etapas envolvidas nesta abordagem metodológicas, com o objectivo geral de reforçar a capacidade de conectar nAChR função com estrutura neuronal.
Photoactivatable nicotina (PA-Nic; nome químico: 1-[7-[bis(carboxymethyl)-amino] cumarina-4-yl] metil-nicotina) pode ser photolyzed com ~ 405 nm laser flashes eficientemente liberar a nicotina5,6. Antes da uncaging, PA-Nic é estável em solução e exibe sem características farmacológicas ou fotoquímicos desagradável5. Após a fotólise, nicotina liberada previsivelmente ativa nAChRs e os uncaging subprodutos são farmacologicamente inerte5. Um laser assemelhace é usado como a fonte luminosa fotólise com uma potência de saída > 1 mW medido na amostra. Quando localizado, alvo de foto-estimulação é combinada com a capacidade de localizar as membranas celulares com laser 2-fotão microscopia (2PLSM), e as duas principais vantagens desta abordagem são plenamente realizadas: fotólise velocidade e precisão espacial.
Em muitos aspectos, a fotólise do PA-Nic é superior aos outros métodos de entrega de nAChR ligantes aos receptores dentro de fatias de cérebro. Essas abordagens incluem banho aplicação7 e drogas local entrega através de uma pipeta de baiacu8. Considerando que a primeira abordagem tende a super enfatizar os efeitos a longo prazo da droga aplicada, a última abordagem pode sofrer de variabilidade na cinética de resposta entre ensaios e através de células. Nenhuma dessas abordagens alternativas adequadamente pode distinguir as atividades do receptor em locais diferentes de celulares do mesmo neurônio. Optogenetically-ativado a liberação de ACh tem sido utilizada para investigação de nativo nAChRs9,10,11, mas não tem sido útil para locais de mapeamento nAChR subcellular. Além disso, a maioria dos estudos utilizando esta abordagem têm invocado um ChR2-expressando cromossomo artificial bacteriano transgénico mouse com transmissão colinérgicas anormal12,13,14, 15 , 16 , 17.
PA-Nic fotólise não é a abordagem apenas ótica para estudar os receptores colinérgicos. Um enjaulado carbacol foi usado funcionalmente mapear atividades de receptores ACh em pilhas cultivadas18 e cérebro fatias19, mas não era comercialmente disponível para estudos comparativos durante o desenvolvimento do PA-NIC. Um bis de rutênio (bipiridina)-complexo de nicotina (RuBi-nicotina) foi relatada para permitir a nicotina uncaging20, mas estudo de preparações comerciais de RuBi-nicotina provou ser inferior ao PA-Nic em uma comparação Head-to-5. Pode ser útil repetir tais experimentos comparativos com não-comercial, altamente purified RuBi-nicotina, como sua absorção visível poderia elogiar características do PA-Nic para estudos colinérgicos. Finalmente, nAChRs têm também sido opticamente manipulados usando uma combinação de foto-comutável ligantes e receptores geneticamente modificados21. Esta abordagem é complementar a fotólise de PA-Nic no tecido cerebral, com a capacidade/exigência do alvo genético do nAChR modificado, visto como uma vantagem e uma desvantagem.
Devem notar-se vários requisitos chaves desta abordagem. Primeiro, um método de visualização adequada é necessária para localizar com precisão a membrana neuronal. Imagem com microscopia de fluorescência-epi convencional pode ser suficiente quando estudar culturas de células, mas para a gravação de neurônios em fatias de cérebro ou outras preparações de tecido grosso, 2PLSM ou a microscopia confocal é uma exigência. Em segundo lugar, um método adequado é necessário para posicionar o feixe de laser de fotólise. Esta abordagem utiliza uma cabeça de digitalização dual-galvanômetro com dois espelhos de independente x-y para a digitalização de varredura do feixe de imagem e ponto photoactivation usando o uncaging do laser feixe22,23,24. Outras soluções mais limitadas são possíveis, tais como (1) uma cabeça de varredura de single-galvanômetro que alternativamente raster faz a varredura do feixe de imagem e o feixe de uncaging ou (2) simplesmente dirigir o feixe de uncaging para o centro do campo de visão tal que a célula é trazida Esta posição por fotólise de flash. Em terceiro lugar, um sistema é necessário para simultânea eletrofisiológicos gravação se deseja coletar sinais fisiológicos durante as experiências. As condições acima mencionadas podem ser atendidas com uma técnica de imagem todos-óptico adequada, como recentemente descrito5. Abaixo, um protocolo detalhado está incluído que descreve as principais etapas desta abordagem.

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			<td>Instruments, Consumables, and Miscellaneous Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiclamp 700B</td>
			<td>Molecular Devices Corp.</td>
			<td></td>
			<td>Patch clamp amplifier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pneumatic Picopump</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>PV820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instrument Co</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature Controller</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>TC-324C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibrating blade microtome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>VT1200S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrafree-MC Centrifugal Filter</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>UFC30GV0S</td>
			<td>internal solution filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass Capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B150F-4</td>
			<td>patch and local application pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(-)-Nicotine hydrogen tartrate salt</td>
			<td>Glentham</td>
			<td>GL9693</td>
			<td>nicotine salt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7-carboxymethylamino-4-methyl coumarin</td>
			<td>Janelia Research Campus</td>
			<td></td>
			<td>PA-Nic by-product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-[7-[bis(carboxymethyl)- amino]coumarin-4-yl]methyl-nicotine</td>
			<td>Janelia Research Campus</td>
			<td></td>
			<td>PA-Nic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Euthasol (Pentobarbital Sodium and Phenytoin Sodium)</td>
			<td>Virbac</td>
			<td>ANADA #200-071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa FluorTM 488 Hydrazide</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A10436</td>
			<td>green fill dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa FluorTM 568 Hydrazide</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A10437</td>
			<td>red fill dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-carboxy-AF594 (Alexa Fluor 594)</td>
			<td>Janelia Research Campus</td>
			<td></td>
			<td>red fill dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX 314 chloride</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2313</td>
			<td>voltage-gated sodium channel blocker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power Meter&#160;</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>S120C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals for Solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Methyl-D-glucamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic monohydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(+)-Sodium L-ascorbate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiourea</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>230391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>223506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&#8242;,N&#8242;-tetraacetic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8242;-triphosphate magnesium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanosine 5&#8242;-triphosphate sodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Components of 2-Photon Microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Ultima Laser Scanner for Olympus BX51 Microscope</td>
			<td>Bruker Nano, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>imaging software and galvos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160; Imaging X-Y galvanometers</td>
			<td>Cambridge Technology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Mai Tai HP1040</td>
			<td>Spectra-Physics</td>
			<td></td>
			<td>Tuneable IR laser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; &#160;&#160;&#160;&#160;&#160;Pockels cell M350-80-02-BK with M302RM Driver</td>
			<td>Conoptics, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>for IR laser attenuation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Integrating Sphere Photodiode Power Sensor</td>
			<td>Thorlabs, Inc</td>
			<td></td>
			<td>laser power pick-off photodiode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160; Uncaging X-Y galvanometers</td>
			<td>Cambridge Technology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Helios 2-Line Laser Launch</td>
			<td>Bruker Nano, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>uncaging laser components</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; OBIS LX/LS 405 nm (100 mW)</td>
			<td>Coherent, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; OBIS LX/LS 473 nm (75 mW)</td>
			<td>Coherent, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; &#160;Point-Photoactivation / Fiber Input Module for Limo Sidecar - Uncaging</td>
			<td>Bruker Nano, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upright Microscope</td>
			<td>&#160;Olympus</td>
			<td>BX51WIF</td>
			<td>Upright microscope chasis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160; Objective: Olympus M Plan FL 10x; NA 0.3 WD 11 mm</td>
			<td>&#160;Olympus</td>
			<td></td>
			<td>10x objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160; Objective: Olympus M Plan Fluorite 60x/1.0 WD=2mm NIR</td>
			<td>&#160;Olympus</td>
			<td></td>
			<td>60x water-dipping objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160; X-Cite 110, four-LED LLG coupled epi-fluorescence light source</td>
			<td>Excelitas Technologies</td>
			<td></td>
			<td>LED Light Source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Epi-Fluorescence Filter: ET-GFP (FITC/CY2) for Epi-Turret</td>
			<td>Chroma Technologies</td>
			<td></td>
			<td>LED Filter for blue light excitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Epi-Fluorescence Filter: ET-DsRed (TRITC/CY3) for Epi-Turret</td>
			<td>Chroma Technologies</td>
			<td></td>
			<td>LED Filter for green light excitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160; B&#38;W CCD camera; Watec, 0.5in B/W CCD</td>
			<td>Watec Co., LTD.</td>
			<td></td>
			<td>CCD camera for patch clamp recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>External Detectors - Dual Reflected Emission - Olympus Upright (Multi-Alkali, GaAsP)</td>
			<td>Bruker Nano, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160; Multi-alkali side-on PMT</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>R3896</td>
			<td>red channel PMT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 595/50m</td>
			<td>Chroma Technologies</td>
			<td></td>
			<td>red channel emission filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 565lpxr</td>
			<td>Chroma Technologies</td>
			<td></td>
			<td>dichroic beam splitter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160; GaAsP end-on PMT</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>7422PA-40</td>
			<td>green channel PMT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 525/70m</td>
			<td>Chroma Technologies</td>
			<td></td>
			<td>green channel emission filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; High-Speed Shutter for Hamamatsu H7422 PMT</td>
			<td>Vincent Associates / Bruker</td>
			<td>517329</td>
			<td>PMT shutter mount</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dodt Gradient Contrast Transmission Detection Module</td>
			<td>Bruker Nano, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160; Multi-alkali side-on PMT</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>R3896</td>
			<td>Dodt PMT</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

probing nicotinic acetylcholine receptor function in mouse brain slices via laser flash photolysis of photoactivatable nicotine

A acetilcolina (ACh) age através de receptores para modular uma variedade de processos neuronais, mas isso tem sido desafiador para ligar a função de receptor de ACh com Localização subcellular dentro das células onde esta função é desempenhada. Para estudar a Localização subcellular de receptores nicotínicos da ACh (nAChRs) no tecido cerebral nativo, um método óptico foi desenvolvido para lançamento preciso de nicotina em locais discretos perto membranas neuronais durante gravações eletrofisiológicas. Patch-fixada neurônios no cérebro fatias são preenchidas com tingem para visualizar sua morfologia durante a microscopia do laser 2-fóton, e uncaging de nicotina é executado com um flash de luz, concentrando-se um feixe de laser 405 nm perto de uma ou mais membranas celulares. Celulares atuais deflexões são medidos, e uma imagem tridimensional de alta resolução de (3D) do neurônio gravado é feita para permitir a reconciliação do nAChR respostas com morfologia celular. Este método permite a análise detalhada da distribuição funcional nAChR em preparações de tecido complexo, prometendo para melhorar a compreensão da neurotransmissão colinérgico.

Por fotólise a estimulação, a dose de exposição (intensidade e tempo), local de exposição e geometria do feixe são variáveis-chave. O sistema descrito neste artigo é capaz de dois feixes diferentes photostimulation, ajustável através de mover uma lente em/fora do caminho luz photostimulation antes que o raio entra no sistema do galvanômetro. Sem essa lente, o feixe de photostimulation preenche a pupila de entrada do x 60 / 1,0 NA água-mergulho [60 x WD] objetivo, produzindo uma perto-difração-limitada, lugar de sub-µm no plano focal dentro da amostra. Isto é associado com photostimulation de luz com uma forma de ampulheta, estendendo-se acima e abaixo do ponto focal simétrico com o eixo óptico. Com a lente inserida o caminho, photostimulation de luz de laser está orientada para a pupila de entrada da lente objetiva e em seguida, sai como um feixe de lápis-como. Este feixe, o que é esperado para ser ~ 10 µm de diâmetro para atingir um objetivo de 60 x, estende-se uniformemente/verticalmente em toda a amostra. Neste modo, a intensidade da luz em qualquer local determinado dentro do ponto de estimulação será ~ 1% da intensidade local pequena perto-difração-limitada. Assim, maiores potências do laser são normalmente necessárias quando usando ~ 10 µm estimulação local. Para todas as experiências relatadas neste artigo, utilizou-se um feixe de ampulheta-tipo photostimulation.
O poder de amostra entregue pode ser plotado contra a configuração da tensão de entrada, depois de medir a potência do laser na amostra usando um medidor de energia. Estes estudos utilizam um 60 x objetivo WD com uma distância de trabalho de 2 mm, mas não está submersa na água para medições de potência evitar possíveis danos ao elemento detector. Quando os objectivos com listados NA > 0,95 são medidos no ar (sem líquido de imersão), pode haver perdas de reflexão interna total no elemento frontal lente devido o índice mais baixo (ar). Neste caso, para uma medição de energia de amostra mais precisa (para corrigir as perdas da reflexão interna total), aumentar a potência medida pela 1,0 NA objetiva (1.0/0.95)2 medida no ar. A Figura 1a mostra uma trama típica de entrada/saída para 405 nm e 473 lasers de nm visível que são incorporadas a laser lançam sistema neste estudo. Estes sistemas de laser são ideais para controle de dose de exposição de foto-estimulação pelas seguintes razões: (1) são previamente calibrados para fornecer potência diretamente linear em relação à tensão de entrada (0-5 V), (2) fornecem uma operação do obturador silencioso (com nenhum laser de saída), e (3) têm rápida, controle de duração do pulso de intensidade sub-ms (0,1 ms resposta). Ao usar o ponto de foto-estimulação com um sistema de laser/galvo, calibração de rotina dos pontos MarkPoints é uma tarefa essencial. Figura 1b (painel esquerdo) demonstra um sistema que está fora de calibração (ponto desejado para estimular a foto não resulta em estimulação exata desse ponto, conforme indicado pelo local queimadura-furo), com um retorno para o posicionamento exato do local depois da calibração ( Figura 1b, painel direito). 
PA-Nic é modestamente fluorescente (pico de emissão em ~ 510 nm), exibindo a excitação eficaz entre 350-450 nm (1 fóton excitação) ou 700-900 nm (2-fóton excitação)5. Para visualizar os PA-Nic durante aplicação local, PA-Nic (1 mM) foi aplicado perto de tecido cerebral seguido por imagem simultânea de contexto de transmissão óptica secionado de tecido (1) cérebro via Dodt contraste e (2) a fluorescência emitida de excitação (900 nm) de PA-NIC. PA-Nic 2PE fluorescência foi facilmente detectável durante a ejeção de pressão de uma pipeta de aplicação local (Figura 2a). Nicotina e um monoalkylcoumarin, 7-carboximetilamino-4-metil cumarina, são os principais produtos fotoquímicos do PA-Nic fotólise reação5. Usando as mesmas configurações/parâmetros que foram usados para PA-Nic de imagem de imagem, o tecido foi fotografado durante a entrega de nicotina (1 mM) ou 7-carboximetilamino-4-metil cumarina (1 mM). Não foi detectado nenhum sinal fluorescente (Figura 2a, painéis de médios e baixos), demonstrando a especificidade dos resultados PA-Nic. Finalmente, PA-Nic foi aplicado no tecido cerebral e emissão de fluorescência PA-Nic foi fotografada (Figura 2b). Esta abordagem confirma que PA-Nic está presente dentro de 100-200 µm da pipeta aplicação local. Juntos, esses dados confirmam que PA-Nic é efetivamente entregue ao cérebro tecido através do aplicativo local.
Gravações de eletrofisiologia com 2PLSM simultânea para visualização das estruturas celulares exige o investigador para considerações de equilíbrio para ambos os componentes do experimento, e muitas vezes uma janela de tempo estreita (~ 20 min) está disponível para válido aquisição de dados de amostra em uma célula de remendado. Sem considerar a visualização celular, é prática recomendada para começar a gravar logo que possível após a invasão porque gravação estabilidade tende a diminuir com o tempo. No entanto, quando a imagem é uma exigência, considerações eletrofisiológicas devem permitir um tempo adequado para aumentos de concentração de fluorescência em estruturas pequenas/remoto. Isto é exemplificado, examinando uma concentração de corante de enchimento curva28, que às vezes é útil para derivar quando um novo tipo de célula de imagem. A Figura 3 mostra vários neurónios de exemplo como Z-pilhas através de 2PLSM e foi recolhido em uma projeção de intensidade máxima para fins de apresentação. A figura 3a mostra imagens de alta qualidade onde morfologia neuronal parece estar completa, ruído é minimizado e detritos não interfere com a interpretação da morfologia celular. Figura 3b mostra imagens de baixa qualidade, devido a uma menor taxa de sinal-para-fundo e detritos substancial. Este detritos frequentemente aparece como bolsos esféricos de fluorescência intensa, decorrentes da ejeção da tintura da pipeta remendo de imagem enquanto se aproximava da célula. Notavelmente, inclusão de 100 µM PA-Nic no banho (ao executar a aplicação de banho) tende a reduzir a taxa de sinal-para-fundo e leva ao contraste da imagem abaixo do ideal. Alexa Fluor 568 ou 594 costuma ser bastante útil em experimentos de aplicação local como um corante de localizador ou como um sinal de referência/normalização 2PE normalizando. Um comprimento de onda efetivo para a excitação de dois fotões destes corantes é ~ 780 nm27, que permite a visualização simultânea de PA-Nic e identificação dos compartimentos celulares. Este comprimento de onda, no entanto, não totalmente evita dois fotões fotólise de PA-Nic5. Alexa Fluor 488 é vantajosa em experimentos de banho-aplicativo PA-Nic; Quando animado com um comprimento de onda apropriado ≥900 nm, dois fotões fotólise de PA-Nic5 pode ser evitado mantendo ainda a visualização adequada dos compartimentos celulares.
A Figura 4 mostra os dados de exemplo para PA-Nic localizadas do laser flash fotólise MHb neurônios em fatias de cérebro. Figura 4a (painéis superior) mostra um exemplo de uma imagem de "referência", que é uma captura de tela da última 2PLSM imagem tirada antes do protocolo de MarkPoints foi executado, sobreposto com o local de ponto de foto-estimulação. Figura 4a (inferior a painéis de imagem) mostra uma visão ampliada da foto-estimulação ponto sobreposto na morfologia celular. A resposta eletrofisiológica correspondente tempo-correlacionados a fotólise de PA-Nic é mostrada nos painéis inferiores da figura 4a. Trabalhos anteriores demonstraram que estas correntes são sensíveis à nAChR antagonistas5. Figura 4b mostra dados representativos de diferentes células onde fotólise de ponto único foi realizada em um intervalo de 1 s ou 10 s. Considerando que um intervalo de 10 s permitido tempo suficiente de recuperação para a linha de base segurando atual, um intervalo mais curto de s 1 levou a uma aumento gradual da posição atual como o protocolo prosseguiu. O aumento da atual sugere que a nicotina não teve tempo suficiente para difundir longe do sistema com o intervalo de 1 Hz29. Tal resposta temporal análises devem ser realizada de novo em qualquer novo tipo de célula, sendo estudado, como a Neurofarmacologia de nAChRs pode diferir entre tipos de células.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58873/58873fig1.jpg"> Figura 1: calibração do laser de Photostimulation. (uma) saída de poder do laser foto-estimulação. Poder no plano da amostra (através de um x 60 / 1.0 objetivo de água-mergulho at) foi medido para 405 nm e 473 lasers de foto-estimulação de nm no ajuste de saída indicado. (b) calibração do laser de foto-estimulação. Imagens de captura de tela mostram a relação espacial entre o ponto de foto-estimulação pretendido e o local correspondente onde foto-estimulação ocorreu (queimadura-buraco) antes (esquerda) e depois (direita) executando calibração em MarkPoints. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58873/58873fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58873/58873fig2.jpg"> Figura 2: aplicação local PA-Nic. (um) deteção de PA-Nic de um local aplicativo pipeta. 1 mM PA-Nic, subproduto de fotólise ou nicotina foram dissolvidos em ACSF, carregado em uma pipeta de aplicação local e dispensada no tecido cerebral durante 2PLSM (excitação de 900 nm) de imagem usando as mesmas configurações de imagem para cada droga. Imagem de transmissão Dodt contraste de exploração do laser mostra a tecido/pipeta enquanto um cátodo GaAsP PGTO foi usado para capturar a emissão de fluorescência. (b), PA-Nic (1 mM) foi perfundido em tecido cerebral e fotografada através de 2PLSM como em (um) para mostrar a propagação lateral do PA-Nic usando sua fluorescência intrínseca. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58873/58873fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58873/58873fig3.jpg"> Figura 3: aquisição de imagens de microscopia de varredura a laser 2-fóton. (a) Z-pilhas de 2PLSM ideal. Dois exemplos de projeções de intensidade máxima do 2PLSM Z-pilha são exibido por neurônios MHb com dendritos bem resolvidos e pouca ou nenhuma interferência detritos. (b) 2PLSM sub-ótimo Z-pilhas. Dois exemplos de projeções de intensidade máxima do 2PLSM Z-pilha são mostrados para os neurônios de MHb rodeados por detritos (tintura expelido da pipeta durante a aproximação da célula). Tais imagens são mais difíceis de interpretar do que imagens como as mostradas em (um). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58873/58873fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58873/58873fig4.jpg"> Figura 4: Laser flash fotólise do PA-NIC. (uma) referência MarkPoints imagens e correntes para dentro, evocadas por fotólise PA-Nic. Para um neurônio de MHb, imagens de referência crus são mostradas para ensaios de foto-estimulação MarkPoints em um único local de celular (indicado). Note que para alguns locais de foto-estimulação (a imagem de extrema direita nesta série), a estrutura dendrítica está em foco, mas a soma e o dendrito proximal não são. Abaixo de cada imagem de referência, nicotina uncaging-evocada aperfeiçoamento activo corrente é plotado. (b) estímulo inter intervalos para PA-Nic fotólise. Gravações de exemplar são mostradas para os neurônios de MHb onde a nicotina foi uncaged repetidamente no mesmo local perisomatic com um intervalo de estímulo Inter de 1 s ou 10 s. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58873/58873fig4large.jpg" target="_blank">, por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Probing Nicotinic Acetylcholine Receptor Function in Mouse Brain Slices via Laser Flash Photolysis of Photoactivatable Nicotine

Este artigo apresenta um método para estudar os receptores nicotínicos de acetilcolina (nAChRs) em fatias de cérebro de rato por nicotina uncaging. Quando acoplado com gravação de braçadeira do remendo simultânea e 2-fóton laser, microscopia eletrônica de varredura, nicotina uncaging conecta a função do receptor nicotínico com morfologia celular, proporcionando uma compreensão mais profunda da neurobiologia colinérgico.

Função de receptores nicotínicos de acetilcolina em fatias de cérebro de rato através de Laser Flash fotólise de nicotina Photoactivatable de sondagem

Acetylcholine (ACh) acts through receptors to modulate a variety of neuronal processes, but it has been challenging to link ACh receptor function with ...

Esta técnica aproveita a microscopia de varredura a laser multi-fóton em conjunto com fotolise laser-flash de uma molécula de nicotina fotoativat. Permitindo ativação precisa de receptores colinérgicos nicotínicos. Esta técnica permite um controle espástico fino sobre a aplicação agonista do receptor nicotínico, fornecendo uma ferramenta poderosa para o estudo de padrões de expressão funcional receptor e transmissão sináptica ou de volume colinérgico.Antes de iniciar o procedimento, use um puxador de pipeta programável para puxar uma micropipette de vidro com um diâmetro de abertura de 20 a 40 micrômetros. Coe aproximadamente um mililitro da solução de gravação através de um filtro de 0,22 mícron. E resuspenque nicotina fotoativat suficiente na solução de gravação filtrada para produzir uma concentração final de dois milimiliar.Enchimento do micropipette de aplicação local puxado com 50 microliters da droga fotoativa, e fixar a pipeta em um suporte de pipeta montado em um micromanipulador. Conecte o suporte de pipeta através de um comprimento apropriado de tubulação a um sistema de ejeção de pressão capaz de aplicação sustentada de baixa pressão. E use o micromanipulador para manobrar a pipeta de aplicação local na solução de gravação extracelular.Posicione a ponta da pipeta ligeiramente acima de uma amostra de tecido cerebral do rato, aproximadamente 50 micrômetros da célula de interesse. E aplique brevemente de um a dois quilos por polegada quadrada de pressão na pipeta. Deve haver mínimo a nenhum deslocamento da célula de interesse.Depois de alcançar um grampo de remendo de células inteiras estáveis, ligue a aplicação baixa no dispositivo de ejeção de pressão e satura o tecido ao redor da célula com nicotina fotoativadora por um a dois minutos. A aplicação local introduz complexidade adicional ao experimento. Mas poupa compostos e permite que maiores concentrações de PA-Nic sejam utilizadas.Para a aplicação do banho da nicotina fotoativa, primeiro dissolva o suficiente da droga liofilizada em um volume de solução de gravação apropriada para recirculação contínua a uma concentração final de 100 micromolar. E carregue a mistura resultante em um sistema de perfusão. Em seguida, inicie a recirculação da solução fotoativa de nicotina a uma taxa de 1,5 a 2 milímetros por minuto, usando tubos com um diâmetro interno mínimo e comprimento geral para minimizar o volume de recirculação necessário.Durante a recirculação, bolha continuamente a solução com carbogen, e manter a temperatura do banho em 32 graus Celsius sob condições de baixa luz. A aplicação do banho beneficia-se da simplicidade e uniformidade da permeação pa-nic do tecido. Mas ele necessariamente utiliza concentrações de PA-Nic de micromolar mais baixas, e gasta maiores quantidades totais de compostos.Para visualização ao vivo de um neurônio habenula medial, use luz transmitida ou câmera diferencial infravermelha e uma câmera de vídeo para estabelecer uma gravação estável de grampo de remendo de células inteiras. Depois de estabelecer a configuração de alta resistência anexada por células, mas antes da invasão, mude a configuração e o software para o modo de varredura a laser. Após a invasão, use escaneamento a laser para verificar se o corante de imagem de interesse está preenchendo passivamente o neurônio por difusão.Deixe que o corante preencha os compartimentos celulares por pelo menos 20 a 30 minutos antes de usar a função de varredura ao vivo para visualizar o neurônio e o compartimento subcelular de interesse. Selecione parâmetros de imagem que permitam uma visualização ao vivo precisa dos recursos neuronais, manipulando as configurações apropriadas para afetar ou alterar a visualização do display, resolução, relação sinal-ruído e tempo de aquisição do quadro de imagem, conforme necessário. Para melhorar o contraste do sinal, abra a janela da tabela de procuração e ajuste as configurações do piso e do teto da mesa de parece.Para localizar uma área de interesse dentro do tecido, selecione o zoom óptico de 1X e use os controles de panorâmica. Use a ferramenta série Z para selecionar uma posição de início e parada que contenha a célula de interesse. Defina um tamanho de passo de um micrômetro e selecione um tamanho de imagem que renderá uma imagem de maior resolução.Muitas vezes 1.024 por 1.024 pixels por linha. Em seguida, imagem consecutiva do neurônio em cada plano Z que contém a célula. Para calibrar a estimulação do laser, inicie a varredura do sistema com uma potência laser de imagem maior que o mínimo, e ajuste o foco objetivo na fina camada de fluorescência do marcador vermelho.Selecione uma área dentro do campo de fluorescência livre de detritos e revestida uniformemente com marcador, e abra o menu de ferramentas, calibração e alinhamento para selecionar a função de galvanização desacentada. Siga o tutorial de pontos de queimadura para a calibração espacial do segundo par de espelhos galvanômetros, selecionando o laser de 405 nanômetros, um poder de estimulação a laser de 400 e uma duração de estimulação de 20 milissegundos. Para produzir furos de um a cinco centímetros de diâmetro no marcador vermelho.Selecione a atualização para estimular e atualizar a imagem após a queima do ponto central e mova o indicador vermelho redondo para a localização real dos pontos central, centro-direito e centro inferior para obter uma grade de nove pontos. Para testar a calibração, abra a janela de pontos de marca e ative manualmente os parâmetros de estimulação dos pontos definidos em uma nova área da amostra, tomando cuidado para que o arquivo de calibração mais recente correto seja carregado na janela de pontos de marca. Em seguida, aplique um pulso de teste para verificar a calibração correta.Para visualizar brevemente e localizar a área subcelular de interesse, selecione digitalização ao vivo e use o zoom óptico para visualizar quaisquer pequenas estruturas conforme necessário. Coloque a mira de ponto de marca imediatamente adjacente à membrana celular, e defina os parâmetros de fotostimulação para uma duração de um a 50 milissegundos, uma potência laser de um a quatro miliwatts e pelo menos um teste. Em seguida, selecione pontos de marca de execução para iniciar o protocolo de pontos de marca e observe a aquisição de dados de eletrofisiologia em tempo real.Fluorescência de nicotina 2PE fotoativante de pa-nic de um mililitro é facilmente detectada durante a ejeção de pressão de uma pipeta de aplicação local como demonstrado. Considerando que a entrega dos principais produtos fotoquímicos da fotolise fotoativatável da reação de fotolise de nicotina não gera nenhum sinal fluorescente na mesma concentração e poder de excitação e comprimento de onda. Demonstrando a especificidade dos resultados fotoativados da nicotina.A imagem da nicotina fotoativat aplicada ao tecido cerebral como demonstrado revela a presença da droga dentro de 100 a 200 micrômetros da pipeta de aplicação local. Confirmando que a nicotina fotoativa pode ser efetivamente entregue ao tecido cerebral através da aplicação local. Aqui, imagens de alta qualidade dentro das quais a morfologia neuronal parece estar completa, o ruído é minimizado, e os detritos não interferem na interpretação da morfologia celular, são mostrados.Essas imagens, no entanto, são de menor qualidade. Devido a uma menor relação sinal-fundo e detritos substanciais. Emparelhar microscopia de escaneamento a laser de dois fótons de neurônios de habenula medial em fatias cerebrais com fotolise flash laser de PA-Nic como demonstrado, permite a reconciliação das respostas eletrofisiológicas com morfologia celular.A fotolise de ponto único realizada em intervalos de 10 segundos permite um tempo de recuperação suficiente para a corrente de retenção da linha de base. Enquanto um intervalo mais curto de um segundo leva a um aumento gradual da corrente de espera à medida que o protocolo prossegue. Sugerindo que a nicotina não tem tempo suficiente para difundir para longe do sistema com os intervalos mais curtos.Ao projetar experimentos que utilizem moléculas fotoativas, é importante lembrar de selecionar indicadores fluorescentes e relatar fluoroforos com espectros de emissão de excitação compatíveis. Pa-Nic é compatível com fluoroforos mais comuns devido ao seu curto pico de fotolise de comprimento de onda. Ao escolher a técnica de aplicação pa-nic mais adequada, é importante considerar cuidadosamente a expressão funcional, atividade fisiológica dos receptores nicotínicos nos neurônios de interesse.A utilização qualificada desta técnica permite um bom controle espostetemporal da aplicação da nicotina, o que permite novas possibilidades interessantes para estudar a cinética do engajamento do receptor nicotínico nativo, localização subcelular e modulação da atividade neuronal pela ativação do receptor nicotínico.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Flash Photolysis of Caged Compounds in the Cilia of Olfactory Sensory  Neurons

Flash Fotólise de Compostos Caged no Cilia de Olfactory neurônios sensoriais

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. ...

Neurociência

Spectral Confocal Imaging of Fluorescently tagged Nicotinic Receptors in Knock-in Mice with Chronic Nicotine Administration

Imagem Confocal Espectral de fluorescência com a tag receptores nicotínicos na Knock-em camundongos com a administração de nicotina crônica

Ligand-gated ion channels in the central nervous system (CNS) are implicated in numerous conditions with serious medical and social consequences.  For ...

Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

Respostas de imagem de cálcio nos neurônios GFP-tagged fatias de cérebro de rato Hipotalâmicos

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the ...

Local Application of Drugs to Study Nicotinic Acetylcholine Receptor Function in Mouse Brain Slices

Aplicação local de Drogas para estudar a função do receptor nicotínico de acetilcolina no cérebro do rato Fatias

Tobacco use leads to numerous health problems, including cancer, heart disease, emphysema, and stroke. Addiction to cigarette smoking is a prevalent ...

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

In vivo Eletroporação pós-natal e tempo-lapso de neuroblasto Migração na aguda fatias do cérebro do rato

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to ...

Laser-guided Neuronal Tracing In Brain Explants

Neuronal Tracing em explantes cérebro guiadas a laser

We present a technique which combines an in vitro tracer injection protocol, which uses a series of electrical and pressure pulses to increase dye uptake ...

Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique

Imagiologia Fibras Serotoninérgicos na medula espinhal mouse usando o CLARIDADE / Técnica CUBIC

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal ...

Studying Brain Function in Children Using Magnetoencephalography

Estudando a função cerebral em crianças usando magnetoencefalografia

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Chronic Implantation of Whole-cortical Electrocorticographic Array in the Common Marmoset

Crônica implantação de matriz Electrocorticographic todo-cortical no sagui comum

Electrocorticography (ECoG) allows the monitoring of electrical field potentials from the cerebral cortex with high spatiotemporal resolution. Recent ...