Name: probing nicotinic acetylcholine receptor function in mouse brain slices via laser flash photolysis of photoactivatable nicotine
Uploaded: 2019-01-25T13:00:00
Duration: 10 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Probing Nicotinic Acetylcholine Receptor Function in Mouse Brain Slices via Laser Flash Photolysis of Photoactivatable Nicotine at JoVE.com

Авторы благодарят лаборатории членов следующих северо-Главные исследователи: Райан Drenan, D. Джеймс Surmeier, Евгения Kozorovitskiy и Анис подрядчика. Эта работа была поддержана нас национальных институтов здравоохранения (НИЗ) (гранты DA035942 и DA040626 к Р.М.Д.БРИДСОН**), PhRMA Foundation (стипендии M.C.A.) и HHMI.

<ol>
	<li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholinergic+tone+in+ventral+tegmental+area:+Functional+organization+and+behavioral+implications.">Cholinergic tone in ventral tegmental area: Functional organization and behavioral implications.</a> Neurochemistry International. 114, 127-133 (2018).</li><li>Sarter, M., Parikh, V., Howe, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phasic+acetylcholine+release+and+the+volume+transmission+hypothesis:+time+to+move+on.">Phasic acetylcholine release and the volume transmission hypothesis: time to move on.</a> Nature Reviews Neuroscience. 10 (5), 383-390 (2009).</li><li>Coyle, J. T., Price, D. L., DeLong, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's+disease:+a+disorder+of+cortical+cholinergic+innervation.">Alzheimer's disease: a disorder of cortical cholinergic innervation.</a> Science. 219 (4589), 1184-1190 (1983).</li><li>Katz, B., Thesleff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+study+of+the+desensitization+produced+by+acetylcholine+at+the+motor+end-plate.">A study of the desensitization produced by acetylcholine at the motor end-plate.</a> Journal of Physiology. 138 (1), 63-80 (1957).</li><li>Banala, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoactivatable+drugs+for+nicotinic+optopharmacology.">Photoactivatable drugs for nicotinic optopharmacology.</a> Nature Methods. 15 (5), 347-350 (2018).</li><li>Yan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotinic+Cholinergic+Receptors+in+VTA+Glutamate+Neurons+Modulate+Excitatory+Transmission.">Nicotinic Cholinergic Receptors in VTA Glutamate Neurons Modulate Excitatory Transmission.</a> Cell Reports. 23 (8), 2236-2244 (2018).</li><li>Engle, S. E., Shih, P. Y., McIntosh, J. M., Drenan, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#945;4&#945;6&#946;2*+nicotinic+acetylcholine+receptor+activation+on+ventral+tegmental+area+dopamine+neurons+is+sufficient+to+stimulate+a+depolarizing+conductance+and+enhance+surface+AMPA+receptor+function.">&#945;4&#945;6&#946;2* nicotinic acetylcholine receptor activation on ventral tegmental area dopamine neurons is sufficient to stimulate a depolarizing conductance and enhance surface AMPA receptor function.</a> Molecular Pharmacology. 84 (3), 393-406 (2013).</li><li>Engle, S. E., Broderick, H. J., Drenan, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+application+of+drugs+to+study+nicotinic+acetylcholine+receptor+function+in+mouse+brain+slices.">Local application of drugs to study nicotinic acetylcholine receptor function in mouse brain slices.</a> Journal of Visualized Experiments. (68), (2012).</li><li>Ren, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Habenula+&amp;#34;cholinergic&amp;#34;+neurons+co-release+glutamate+and+acetylcholine+and+activate+postsynaptic+neurons+via+distinct+transmission+modes.">Habenula &amp;#34;cholinergic&amp;#34; neurons co-release glutamate and acetylcholine and activate postsynaptic neurons via distinct transmission modes.</a> Neuron. 69 (3), 445-452 (2011).</li><li>Koppensteiner, P., Melani, R., Ninan, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Cooperative+Mechanism+Involving+Ca(2+)-Permeable+AMPA+Receptors+and+Retrograde+Activation+of+GABAB+Receptors+in+Interpeduncular+Nucleus+Plasticity.">A Cooperative Mechanism Involving Ca(2+)-Permeable AMPA Receptors and Retrograde Activation of GABAB Receptors in Interpeduncular Nucleus Plasticity.</a> Cell Reports. 20 (5), 1111-1122 (2017).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+Excitation+via+GABAB+Receptors+in+Habenula+Cholinergic+Neurons+Regulates+Fear+Memory+Expression.">Presynaptic Excitation via GABAB Receptors in Habenula Cholinergic Neurons Regulates Fear Memory Expression.</a> Cell. 166 (3), 716-728 (2016).</li><li>Chen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+Baseline+and+Nicotine-Mediated+Behavioral+and+Cholinergic+Profiles+in+ChAT-Cre+Mouse+Lines.">Altered Baseline and Nicotine-Mediated Behavioral and Cholinergic Profiles in ChAT-Cre Mouse Lines.</a> The Journal of Neuroscience. 38 (9), 2177-2188 (2018).</li><li>Nagy, P. M., Aubert, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+the+vesicular+acetylcholine+transporter+increased+acetylcholine+release+in+the+hippocampus.">Overexpression of the vesicular acetylcholine transporter increased acetylcholine release in the hippocampus.</a> Neuroscience. 218, 1-11 (2012).</li><li>Ting, J. T., Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombineering+strategies+for+developing+next+generation+BAC+transgenic+tools+for+optogenetics+and+beyond.">Recombineering strategies for developing next generation BAC transgenic tools for optogenetics and beyond.</a> Frontiers in Behavioral Neuroscience. 8, 111 (2014).</li><li>Crittenden, J. R., Lacey, C. J., Lee, T., Bowden, H. A., Graybiel, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severe+drug-induced+repetitive+behaviors+and+striatal+overexpression+of+VAChT+in+ChAT-ChR2-EYFP+BAC+transgenic+mice.">Severe drug-induced repetitive behaviors and striatal overexpression of VAChT in ChAT-ChR2-EYFP BAC transgenic mice.</a> Frontiers in Neural Circuits. 8, 57 (2014).</li><li>Kolisnyk, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChAT-ChR2-EYFP+mice+have+enhanced+motor+endurance+but+show+deficits+in+attention+and+several+additional+cognitive+domains.">ChAT-ChR2-EYFP mice have enhanced motor endurance but show deficits in attention and several additional cognitive domains.</a> The Journal of Neuroscience. 33 (25), 10427-10438 (2013).</li><li>Nagy, P. M., Aubert, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+the+vesicular+acetylcholine+transporter+enhances+dendritic+complexity+of+adult-born+hippocampal+neurons+and+improves+acquisition+of+spatial+memory+during+aging.">Overexpression of the vesicular acetylcholine transporter enhances dendritic complexity of adult-born hippocampal neurons and improves acquisition of spatial memory during aging.</a> Neurobiology of Aging. 36 (5), 1881-1889 (2015).</li><li>Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+scanning+photochemical+microscopy:+mapping+ligand-gated+ion+channel+distributions.">Two-photon scanning photochemical microscopy: mapping ligand-gated ion channel distributions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (14), 6629-6633 (1994).</li><li>Khiroug, L., Giniatullin, R., Klein, R. C., Fayuk, D., Yakel, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+mapping+and+Ca2++regulation+of+nicotinic+acetylcholine+receptor+channels+in+rat+hippocampal+CA1+neurons.">Functional mapping and Ca2+ regulation of nicotinic acetylcholine receptor channels in rat hippocampal CA1 neurons.</a> The Journal of Neuroscience. 23 (27), 9024-9031 (2003).</li><li>Filevich, O., Salierno, M., Etchenique, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+caged+nicotine+with+nanosecond+range+kinetics+and+visible+light+sensitivity.">A caged nicotine with nanosecond range kinetics and visible light sensitivity.</a> Journal of Inorganic Biochemistry. 104 (12), 1248-1251 (2010).</li><li>Tochitsky, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optochemical+control+of+genetically+engineered+neuronal+nicotinic+acetylcholine+receptors.">Optochemical control of genetically engineered neuronal nicotinic acetylcholine receptors.</a> Nature Chemistry. 4 (2), 105-111 (2012).</li><li>Wokosin, D. L., Squirrell, J. M., Eliceiri, K. W., White, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+workstation+with+concurrent,+independent+multiphoton+imaging+and+experimental+laser+microbeam+capabilities.">Optical workstation with concurrent, independent multiphoton imaging and experimental laser microbeam capabilities.</a> Review of Scientific Instruments. 74 (1), 193-201 (2003).</li><li>Plotkin, J. L., Day, M., Surmeier, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptically+driven+state+transitions+in+distal+dendrites+of+striatal+spiny+neurons.">Synaptically driven state transitions in distal dendrites of striatal spiny neurons.</a> Nature Neuroscience. 14 (7), 881-888 (2011).</li><li>Galtieri, D. J., Estep, C. M., Wokosin, D. L., Traynelis, S., Surmeier, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pedunculopontine+glutamatergic+neurons+control+spike+patterning+in+substantia+nigra+dopaminergic+neurons.">Pedunculopontine glutamatergic neurons control spike patterning in substantia nigra dopaminergic neurons.</a> Elife. 6, (2017).</li><li>Yasuda, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+calcium+concentration+dynamics+in+small+neuronal+compartments.">Imaging calcium concentration dynamics in small neuronal compartments.</a> Science STKE. (219), pl5 (2004).</li><li>Inoue, S., Spring, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Video microscopy: The fundamentals. , 163-186 (1997).</li><li>Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonlinear+magic:+multiphoton+microscopy+in+the+biosciences.">Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences.</a> Nature Biotechnology. 21 (11), 1369-1377 (2003).</li><li>Maravall, M., Mainen, Z. F., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimating+intracellular+calcium+concentrations+and+buffering+without+wavelength+ratioing.">Estimating intracellular calcium concentrations and buffering without wavelength ratioing.</a> Biophysical Journal. 78 (5), 2655-2667 (2000).</li><li>Wathey, J. C., Nass, M. M., Lester, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Numerical+reconstruction+of+the+quantal+event+at+nicotinic+synapses.">Numerical reconstruction of the quantal event at nicotinic synapses.</a> Biophysical Journal. 27 (1), 145-164 (1979).</li><li>Shih, P. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+and+function+of+nicotinic+acetylcholine+receptors+in+subdivisions+of+medial+habenula.">Differential expression and function of nicotinic acetylcholine receptors in subdivisions of medial habenula.</a> The Journal of Neuroscience. 34 (29), 9789-9802 (2014).</li><li>Verhoog, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Layer-specific+cholinergic+control+of+human+and+mouse+cortical+synaptic+plasticity.">Layer-specific cholinergic control of human and mouse cortical synaptic plasticity.</a> Nature Communications. 7, 12826 (2016).</li><li>Koukouli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotine+reverses+hypofrontality+in+animal+models+of+addiction+and+schizophrenia.">Nicotine reverses hypofrontality in animal models of addiction and schizophrenia.</a> Nature Medicine. 23 (3), 347-354 (2017).</li><li>Xiao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+nicotine+selectively+enhances+&#945;4&#946;2*+nicotinic+acetylcholine+receptors+in+the+nigrostriatal+dopamine+pathway.">Chronic nicotine selectively enhances &#945;4&#946;2* nicotinic acetylcholine receptors in the nigrostriatal dopamine pathway.</a> The Journal of Neuroscience. 29 (40), 12428-12439 (2009).</li><li>Peng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Editing+Vectors+for+Studying+Nicotinic+Acetylcholine+Receptors+in+Cholinergic+Transmission.">Gene Editing Vectors for Studying Nicotinic Acetylcholine Receptors in Cholinergic Transmission.</a> European Journal of Neuroscience. , (2018).</li></ol>

D.L.W. служит платных консультанта для микроскопии флуоресцирования Bruker Nano.

Выбор способа доставки приложений ПА-Nic является наиболее важным этапом в этой технике локализованных фото стимуляции. Два метода, Ванна приложения и местные перфузии, каждый предлагают преимущества и ограничения. Выбор во многом повлияли nAChR уровня функциональные выражения в тип ячейки интереса. Часто бывает предпочтительнее использовать Ванна приложения при функциональных выражение уровни высоки, как ванна приложение позволяет для единообразного зонд концентрации, окружающих записанные ячейки, облегчения интерпретации данных. Ванна приложения также устраняет необходимость второго перфузии пипетки в ткани, что делает весь процесс легче. Однако Ванна применения дорогих соединений стоит больше за эксперимент.
Обычно устранение неполадок включает пытается понять, почему не nAChR активации видны следующие flash фотолиза. При работе с типом ячеек, который ранее не изучена с PA-Nic, следователь должен выполнять местные слоеного применение ACh или никотина, чтобы определить, являются ли достаточными рецепторов функционально выразил5. Чтобы проверить, что система способна обнаруживать фотолиз ответы, эксперименты контроля должно быть сделано в медиальной habenula нейронов, которые выражают большое количество рецепторов30. В этой области мозга ПА-Nic Ванна применение возможно, который является предпочтительным для проверки экспериментов. Только после выполнения этих экспериментов проверки следует один перейти к тип неизученный ячейки. Если экспериментальная система протестирована и ответы остаются очень малых или обнаружить, оно может быть оправдано увеличивают концентрацию PA-Nic, увеличение интенсивности вспышки или длительность импульса, добавьте nAChR положительные аллостерический модулятор для повышения nAChR деятельность6, или некоторое сочетание этих.
Иногда uncaging ответы являются слишком большими, с значительным nAChR активацию, приводящую к косвенным напряжения закрытом Na+ активации и unclamped внутрь течений из-за плохой пространства зажим. Эти артефакты, которые полностью скрывать внутрь токов nAChR и сделать невозможным интерпретации данных, могут быть устранены путем включения QX-314 (2 мм) в записи пипеткой. Они также могут быть устранены путем уменьшения концентрации PA-Nic или путем снижения интенсивности вспышки или длительность импульса. В всех видимый свет фото стимуляции экспериментах необходимо проявлять осторожность при выборе стимуляции сайты, чтобы избежать непреднамеренного стимуляции/фотолиз выше или ниже желаемого фокальной плоскости. Кроме того и когда применимо, мощность лазера должен всегда титруют воспроизвести физиологические реакции. Это особенно важно, необходимо знать о z-axis фотостимуляции при работе с клетке лигандов, как лиганды, которые активируются выше/ниже фокуса месте могут по-прежнему диффузный и взаимодействовать с биологической системы (т.е., рецепторов) изучается.
PA-Nic лазерной вспышки фотолиз может не подходить для всех следователей, как существуют некоторые ограничения. Во-первых, относительно высокая стоимость подходящие настройки. При работе с фрагментами нетронутыми мозга, uncaging вблизи малого диаметра структур как дендриты требует сложной визуализации системы как 2-Фотон микроскопа. Помимо высокой стоимости Ti: Sapphire, Перестраиваемый лазер импульсной IR для выполнения 2-Фотон микроскопии, двойной гальванометра системы, способной самостоятельно позиционирования двух лазерных пучков далее увеличивает стоимость системы. Расходы всего системы может быть уменьшена с помощью системы, дом построен, если следователь имеет достаточно опыта и времени для конструирования, устранения неполадок и поддержания такой системы. Второе ограничение часто предполагает низкий nAChR функциональных выражение, которое можно частично избежать, шаги, как упоминалось выше, но это не может гарантировать успеха. Как правило если одно не может измерить лиганд активированный течений после слоеного применение агонистов, ПА-Nic flash фотолиза под мембраной может не дать приемлемые результаты. Третье ограничение включает внутреннюю флуоресценции ПА-Nic. ПА-Nic поглощает свет ~ 405 нм и излучает в ряду аналогичных как Зеленый флуоресцентный белок (ГПУП) или Alexa 4885. Когда па-Nic концентрации превышают ~ 1 мм, это свойство флуоресцирования можно сделать это сложно одновременно визуализировать нейрональных структур. Чтобы избежать этого, важно иметь возможность легко управлять потоком PA-Nic из пипетки перфузии. Периодически ПА-Nic поток был остановлен разрешить флуоресцентных молекул для диффузного прочь. Это разрешается повторно изображений нейрона для проверки позиции месте uncaging луча. Четвертый потенциальным ограничением упоминать предполагает использование 405 нм света для фотолиза. Более короткие длины волн например 405 нм более подвержены рассеяния в сложные ткани, такие, как кусок мозга. Таким образом в данной флеш интенсивности и продолжительности, uncaging ответ амплитуд и Кинетика распада могут быть различной степени затронуты глубины uncaging фокуса внутри фрагмента. Выводы о биологических аспектах nAChRs следует учитывать этот важный нюанс.
Эта техника flash фотолиз локализованных лазерной недавно был использован раскрыть новые подробности о nAChR нейробиологии. Например хронический никотина воздействия повышает perisomatic и дендритных nAChR функции в медиальной habenula нейронов5. Он также использовался для помочь продемонстрировать, в первый раз, вентральной вентральная область глутамата нейронов Экспресс функциональных nAChRs в их perisomatic и дендритных сотовой отсеков6. Есть много потенциал будущего использования этой техники, и подход может быть применен к другим типам ключевых нейрон, которые известны Экспресс nAChRs, таких как корковых нейронов пирамидальный31 или интернейронов в коре32, стриатума33 и гиппокампа19. Этот метод может также сочетаться с фармакологии и/или nAChR гена, редактирование34 локализовать специфическим рецептором подтипы для различных нейрональных отсеков. Этот подход может быть легко адаптирована для других соединений, кумарина в клетке, включая, но не ограничиваясь, разработанные параллельно с PA-Nic5. Наконец ПА-Nic flash фотолиз может один день использоваться в Пробудитесь ведет себя животное для изучения действия никотина в Роман поведенческой фармакологии парадигм.

Холинергических сигнализации модулирует многочисленные процессы мозга, включая внимания управления, волевые движения и вознаграждение1,2. Препаратов, улучшающих передачи ацетилхолина (ACh) используются для лечения когнитивных нарушений, связанных с болезнью Альцгеймера, подразумевая важную роль для холинергических систем в познании3. Улучшение понимания холинергических рецепторов и схем в государствах, здорового и больного может привести к более терапевтические подходы для нескольких неврологических заболеваний/расстройств.
Никотиновых рецепторов ACh (nAChRs) — семейство лиганд закрытый ионных каналов, которые поток катионы в ответ ACh эндогенных или экзогенных никотина от табачных изделий. Учитывая тот факт, что они были среди первых нейромедиатора рецепторов к быть описано4, nAChR фармакологии и расположение в мышечных волокон понятных для мышц типа рецепторов. Напротив сравнительно мало что известно о фармакологии и внутриклеточных распределение родной nAChRs в мозге. Этот пробел в знаниях выступил недавно развивающихся роман химической зонд, который позволяет пространственно ограниченных и быстрой активации nAChRs в ткани мозга во время сотовой изображений и электрофизиологические записи5. Здесь описаны ключевые методологические этапы такой подход, с учетом общей цели укрепления способности для подключения nAChR функция с нейронные структуры.
Photoactivatable никотина (ПА-Nic; химическое название: 1-[7-[bis(carboxymethyl)-амино] кумарина-4-ил] метил никотин) могут быть photolyzed с ~ 405 нм лазер вспышки эффективно выпустить никотина5,6. До uncaging, ПА-Nic стабилен в растворе и экспонаты не неприятных фармакологических или фотохимического особенности5. После фотолиз выпущенный никотина предсказуемо активирует nAChRs и uncaging побочные продукты являются фармакологически инертных5. Непрерывном лазер используется в качестве источника света фотолиза с выходной мощностью > 1 МВт измеряется на образце. При локализации, целенаправленных фото стимуляции сочетается с возможность обнаружения клеточных мембран с 2-Фотон лазерной сканирующей микроскопии (2PLSM), и два ключевых преимущества этого подхода будут полностью реализованы: скорость фотолиз и пространственной точностью.
Во многих отношениях фотолиз PA-Nic превосходит другие методы доставки nAChR лиганды рецепторов в пределах срезы мозга. Такие подходы включают ванна приложения7 и локальных доставки через фугу дозатор8. Первый подход, как правило, переоценить долгосрочные эффекты препарата прикладной, в то время как последний подход может страдать от изменчивости в ответ кинетики между испытаниями и ячейках. Ни один из этих альтернативных подходов адекватно могут различать рецептор деятельность в разных местах сотовой от же нейрона. Optogenetically активированный выпуска ACh был использован для исследования родной nAChRs9,10,11, но не оказалось полезным для сопоставления внутриклеточных nAChR мест. Кроме того большинство исследований с использованием этого подхода основывались на ChR2-выражая бактериальных искусственных хромосом трансгенные мыши с ненормальным холинергических передачи12,13,14, 15 , 16 , 17.
PA-Nic фотолиз является не только оптические подход для изучения холинергических рецепторов. Клетке Карбахол использовался для функционально сопоставления ACh рецептор мероприятия в культивируемых клеток мозга и18 ломтики19, но не был коммерчески доступных для сравнительных исследований в ходе разработки PA-Nic. Рутений бис (бипиридин)-никотин комплекс (RuBi никотин) было сообщено для никотина uncaging20, но коммерческие препараты Руби никотин оказались хуже ПА-Nic в прямом сравнении исследование5. Это может быть полезно повторить такие сравнительные эксперименты с не коммерческих, высоко очищенный Руби никотин, как его видимым поглощения могут комплимент функций ПА-Nic для холинергических исследований. Наконец nAChRs также оптически манипулируют с помощью комбинации фото переключаемый лигандов и генетически модифицированные рецепторов21. Этот подход дополняет ПА-Nic фотолиз в ткани мозга, способность/требование генетических ориентации на изменение nAChR, рассматривается как преимущество и недостаток.
Следует отметить несколько ключевых требований этого подхода. Во-первых соответствующие визуализации метод необходим для точного поиска нейрональных мембран. Томограф с обычными epi флуоресцентной микроскопии может быть достаточно при изучении культивируемых клеток, но для записи от нейронов мозга ломтиками или других препаратов толстые ткани, 2PLSM или confocal микроскопии является требованием. Во-вторых подходящий метод необходим для позиции фотолиз лазерного луча. Этот подход использует двойной гальванометра сканирования головы с двумя независимыми x-y зеркала для сканирования растровых изображений луча и photoactivation точки, с помощью uncaging лазерный луч22,,23-24. Возможны другие, более ограниченные решения, например (1 один гальванометра сканирования головы, что альтернативно растровых сканирование изображений луча и uncaging пучка или (2) просто направляя uncaging луч в центре поля зрения, таким образом, что ячейка доводится до Эта позиция для flash фотолиза. В-третьих система необходима для одновременного электрофизиологических записи, если один хочет, чтобы собрать физиологических сигналов во время экспериментов. Вышеуказанные требования можно встретился с подходящей все оптических изображений техники, как недавно описан5. Ниже, подробный протокол включен, описываются ключевые шаги этого подхода.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Instruments, Consumables, and Miscellaneous Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiclamp 700B</td>
			<td>Molecular Devices Corp.</td>
			<td></td>
			<td>Patch clamp amplifier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pneumatic Picopump</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>PV820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instrument Co</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature Controller</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>TC-324C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibrating blade microtome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>VT1200S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrafree-MC Centrifugal Filter</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>UFC30GV0S</td>
			<td>internal solution filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass Capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B150F-4</td>
			<td>patch and local application pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(-)-Nicotine hydrogen tartrate salt</td>
			<td>Glentham</td>
			<td>GL9693</td>
			<td>nicotine salt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7-carboxymethylamino-4-methyl coumarin</td>
			<td>Janelia Research Campus</td>
			<td></td>
			<td>PA-Nic by-product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-[7-[bis(carboxymethyl)- amino]coumarin-4-yl]methyl-nicotine</td>
			<td>Janelia Research Campus</td>
			<td></td>
			<td>PA-Nic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Euthasol (Pentobarbital Sodium and Phenytoin Sodium)</td>
			<td>Virbac</td>
			<td>ANADA #200-071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa FluorTM 488 Hydrazide</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A10436</td>
			<td>green fill dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa FluorTM 568 Hydrazide</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A10437</td>
			<td>red fill dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-carboxy-AF594 (Alexa Fluor 594)</td>
			<td>Janelia Research Campus</td>
			<td></td>
			<td>red fill dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX 314 chloride</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2313</td>
			<td>voltage-gated sodium channel blocker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power Meter&#160;</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>S120C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals for Solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Methyl-D-glucamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic monohydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(+)-Sodium L-ascorbate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiourea</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>230391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>223506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&#8242;,N&#8242;-tetraacetic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8242;-triphosphate magnesium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanosine 5&#8242;-triphosphate sodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Components of 2-Photon Microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Ultima Laser Scanner for Olympus BX51 Microscope</td>
			<td>Bruker Nano, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>imaging software and galvos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160; Imaging X-Y galvanometers</td>
			<td>Cambridge Technology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Mai Tai HP1040</td>
			<td>Spectra-Physics</td>
			<td></td>
			<td>Tuneable IR laser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; &#160;&#160;&#160;&#160;&#160;Pockels cell M350-80-02-BK with M302RM Driver</td>
			<td>Conoptics, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>for IR laser attenuation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Integrating Sphere Photodiode Power Sensor</td>
			<td>Thorlabs, Inc</td>
			<td></td>
			<td>laser power pick-off photodiode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160; Uncaging X-Y galvanometers</td>
			<td>Cambridge Technology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Helios 2-Line Laser Launch</td>
			<td>Bruker Nano, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>uncaging laser components</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; OBIS LX/LS 405 nm (100 mW)</td>
			<td>Coherent, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; OBIS LX/LS 473 nm (75 mW)</td>
			<td>Coherent, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; &#160;Point-Photoactivation / Fiber Input Module for Limo Sidecar - Uncaging</td>
			<td>Bruker Nano, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upright Microscope</td>
			<td>&#160;Olympus</td>
			<td>BX51WIF</td>
			<td>Upright microscope chasis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160; Objective: Olympus M Plan FL 10x; NA 0.3 WD 11 mm</td>
			<td>&#160;Olympus</td>
			<td></td>
			<td>10x objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160; Objective: Olympus M Plan Fluorite 60x/1.0 WD=2mm NIR</td>
			<td>&#160;Olympus</td>
			<td></td>
			<td>60x water-dipping objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160; X-Cite 110, four-LED LLG coupled epi-fluorescence light source</td>
			<td>Excelitas Technologies</td>
			<td></td>
			<td>LED Light Source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Epi-Fluorescence Filter: ET-GFP (FITC/CY2) for Epi-Turret</td>
			<td>Chroma Technologies</td>
			<td></td>
			<td>LED Filter for blue light excitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Epi-Fluorescence Filter: ET-DsRed (TRITC/CY3) for Epi-Turret</td>
			<td>Chroma Technologies</td>
			<td></td>
			<td>LED Filter for green light excitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160; B&#38;W CCD camera; Watec, 0.5in B/W CCD</td>
			<td>Watec Co., LTD.</td>
			<td></td>
			<td>CCD camera for patch clamp recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>External Detectors - Dual Reflected Emission - Olympus Upright (Multi-Alkali, GaAsP)</td>
			<td>Bruker Nano, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160; Multi-alkali side-on PMT</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>R3896</td>
			<td>red channel PMT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 595/50m</td>
			<td>Chroma Technologies</td>
			<td></td>
			<td>red channel emission filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 565lpxr</td>
			<td>Chroma Technologies</td>
			<td></td>
			<td>dichroic beam splitter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160; GaAsP end-on PMT</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>7422PA-40</td>
			<td>green channel PMT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 525/70m</td>
			<td>Chroma Technologies</td>
			<td></td>
			<td>green channel emission filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; High-Speed Shutter for Hamamatsu H7422 PMT</td>
			<td>Vincent Associates / Bruker</td>
			<td>517329</td>
			<td>PMT shutter mount</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dodt Gradient Contrast Transmission Detection Module</td>
			<td>Bruker Nano, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160; Multi-alkali side-on PMT</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>R3896</td>
			<td>Dodt PMT</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

probing nicotinic acetylcholine receptor function in mouse brain slices via laser flash photolysis of photoactivatable nicotine

Ацетилхолин (ACh) действует через рецепторов модулируют разнообразные нейронные процессы, но она была сложной связать функции рецепторов ACh с субцеллюлярные расположение внутри клетки, где эта функция осуществляется. Для изучения субцеллюлярные расположение никотиновых рецепторов ACh (nAChRs) в родной мозговой ткани, оптический метод был разработан для точного выхода никотина в отдельных местах вблизи нейрональных мембран во время электрофизиологических записи. Патч зажат нейронов в мозге, ломтики заполнены с красителя визуализировать их морфология во время 2-Фотон лазерная сканирующая микроскопия, и никотин uncaging выполняется с вспышка, сосредоточив внимание луч лазера 405 нм у одного или нескольких клеточных мембран. Сотовый текущего отклонения измеряются, и трехмерные (3D) изображения с высоким разрешением записанные нейрона производится чтобы примирение nAChR ответы с клеточной морфологии. Этот метод позволяет для детального анализа функционального распределения nAChR в сложных ткани препаратов, перспективных для расширения понимания холинергических синапсах.

Watch this Scientific Journal Video about Probing Nicotinic Acetylcholine Receptor Function in Mouse Brain Slices via Laser Flash Photolysis of Photoactivatable Nicotine at JoVE.com

Probing Nicotinic Acetylcholine Receptor Function in Mouse Brain Slices via Laser Flash Photolysis of Photoactivatable Nicotine

Эта статья представляет метод для изучения никотиновых ацетилхолиновых рецепторов (nAChRs) в срезы мозга мыши, никотин uncaging. При сочетании с одновременным патч зажим записи и 2-Фотон лазерной сканирующей микроскопии, никотин uncaging соединяет никотиновых рецепторов функция с клеточной морфологии, обеспечивая более глубокое понимание холинергических нейробиологии.

Зондирование никотиновых ацетилхолиновых рецепторов функции срезы мозга мыши через лазерной вспышки фотолиза Photoactivatable никотина

Acetylcholine (ACh) acts through receptors to modulate a variety of neuronal processes, but it has been challenging to link ACh receptor function with ...

Этот метод использует мульти-фотон лазерного сканирования микроскопии в сочетании с лазерной вспышки фотолиза фотоактивируемой молекулы никотина. Позволяет точно активации никотиновых холинергических рецепторов. Этот метод позволяет тонкой spatiotemporal контроль над никотиновых рецепторов агонист применения, обеспечивая мощный инструмент для изучения рецепторов функциональных моделей выражения и холинергической синаптической или передачи объема.Перед началом процедуры используйте программируемый шкив пипетки, чтобы вытащить стеклянный микропипец диаметром от 20 до 40 микрометров. Процедите примерно один миллилитр записывающего раствора через фильтр 0,22 микрона. И повторного использования достаточно лиофилинизированного фотоактивируемого никотина в фильтрованном растворе записи, чтобы дать двухмилимоляльную окончательную концентрацию.Заполнюте вытащил местного применения micropipette с 50 микролитров фотоактивируемого препарата, и обеспечить пипетку в держатель пипетки установлен на микроманипулятор. Подключите держатель пипетки через соответствующую длину труб с системой выброса давления, способной поддерживать применение низкого давления. И использовать микроманипулятор для маневра локального применения пипетки во внеклеточный раствор записи.Распоитите наконечник пипетки чуть выше образца ткани мозга мыши, примерно в 50 микрометрах от клетки интереса. И кратко применить один-два фунта на квадратный дюйм давления на пипетки. Перемещение ячейки интересов должно быть минимальным и не должно быть.После достижения стабильной цельноклеточный зажим патч, включите низкое применение на устройство выброса давления, и насытить ткани, окружающие клетку с фотоактивируемым никотином в течение одной-двух минут. Локальное приложение вводит дополнительную сложность эксперимента. Но он щадит соединения и позволяет более высокие концентрации PA-Nic, которые будут использоваться.Для применения в ванне фотоактивируемого никотина сначала растворяют достаточно лиофилизированный препарат в объеме записывающего раствора, подходящего для непрерывной рециркуляции до 100-микромоляльной конечной концентрации. И загрузите полученную смесь в перфузионную систему. Затем начните рециркуляцию фотоактивируемого никотинового раствора со скоростью от 1,5 до 2 миллиметров в минуту, используя трубки с минимальным внутренним диаметром и общей длиной, чтобы свести к минимуму необходимый объем рециркуляции.Во время рециркуляции, непрерывно пузырь раствор карбогена, и поддерживать температуру ванны на 32 градусов по Цельсию в условиях низкой освещенности. Ванна приложение выгоды от простоты и единообразия PA-Nic пронизывания ткани. Но он обязательно использует более низкие концентрации микромолара PA-Nic, и расходует более высокое общее количество соединений.Для живой визуализации медиальной нейрона хабенула используйте передаваемую световую или инфракрасную дифференциальную контрастную оптику и видеокамеру для создания стабильной, цельноклеточной записи зажима. После создания конфигурации, прикрепленной к ячейкам высокого сопротивления, но перед взломом переключитесь на настройку и программное обеспечение в режим лазерного сканирования. После взлома используйте лазерное сканирование, чтобы убедиться, что представляющий интерес краситель для визуализации пассивно заполняет нейрон путем диффузии.Позвольте красителю заполнить клеточные отсеки, по крайней мере от 20 до 30 минут, прежде чем использовать функцию живого сканирования для визуализации нейрона и подклеточного отсека интереса. Выберите параметры изображения, которые позволяют точно визуализировать функции нейронов в реальном времени, манипулируя соответствующими настройками, чтобы повлиять или изменить визуализацию дисплея, разрешение, соотношение сигнала к шуму и время приобретения изображений по мере необходимости. Для усиления контрастности сигнала откройте окно таблицы осмотра и отрегулируйте настройки пола стола и потолка.Чтобы найти область, интересную в ткани, выберите 1X оптический зум и используйте элементы управления панорамированием. Используйте инструмент серии «Я», чтобы выбрать позицию начала и остановки, которая содержит ячейку интереса. Установите размер шага в один микрометр и выберите размер изображения, который даст изображение с высоким разрешением.Часто 1 024 на 1024 пикселя на линию. Затем последовательно изображение нейрона в каждой плоскости, которая содержит клетку. Чтобы откалибровать лазерную стимуляцию, начните сканирование системы с помощью лазерной мощности изображения, больше минимальной, и настройте объективную направленность на тонкий слой флуоресценции красного маркера.Выберите область в поле флуоресценции, очищенную от мусора и равномерно покрытую маркером, и откройте инструменты, калибровку и меню выравнивания, чтобы выбрать функцию неукозывной гальвокалибрации. Следуйте учебнику по ожоговым пятнам для пространственной калибровки второй пары зеркал гальванометра, выбрав 405-нанометровый лазер, мощность лазерной стимуляции 400 и продолжительность стимуляции 20 миллисекунд. Для того чтобы дать отверстия диаметром от одного до пяти микрометров в красном маркере.Выберите обновление, чтобы стимулировать и обновить изображение после сжигания в центре пятна, и переместите круглый красный индикатор в фактическое расположение места в центре, правом центре и нижнем центре пятна, чтобы получить сетку из девяти пятен. Чтобы проверить калибровку, откройте окно точек отметки и вручную активируйте параметры стимуляции определенных пятен в новой области образца, заботясь о том, чтобы правильный файл последней калибровки был загружен в окно точек отметки. Затем нанесите тестовый импульс для проверки правильной калибровки.Чтобы кратко изображение и найти подклеточную область интереса, выберите живое сканирование и использовать увеличить оптический зум, чтобы визуализировать любые небольшие структуры по мере необходимости. Поместите точку отметки одно пятно перекрестие непосредственно рядом с клеточной мембраны, и установить параметры фотостимуляции от одного до 50-миллисекундной продолжительности, от одного до четырех милливатт лазерной мощности, и по крайней мере одно испытание. Затем выберите точки отметки запуска, чтобы инициировать протокол точек отметки, и наблюдать за получением данных электрофизиологии в режиме реального времени.Фотоактивируемый никотин 2PE флуоресценция одномимилолярного PA-Nic легко обнаруживается во время выброса давления из местного пипетки приложения, как попродемонстрировано. В то время как доставка основных фотохимических продуктов фотоактивируемой реакции фотолиза никотина не генерирует флуоресцентного сигнала при той же концентрации и возбудительной силе и длине волны. Демонстрация специфики результатов фотоактивируемого никотина.Изображение фотоактивируемого никотина, применяемого к тканям мозга, как попродемонстрировано, показывает наличие препарата в пределах от 100 до 200 микрометров от местного применения пипетки. Подтверждение того, что фотоактивируемый никотин может быть эффективно доставлен в ткани мозга с помощью местного применения. Здесь показаны высококачественные изображения, в которых нейрональная морфология кажется полной, шум сведен к минимуму, а мусор не мешает интерпретации клеточной морфологии.Эти изображения, однако, имеют более низкое качество. Из-за более низкого соотношения сигнала к фону и существенного мусора. Сопряжение двухкотонной лазерной сканирующей микроскопии медиальной хабенулы в срезах мозга с лазерным флэш-фотолизом PA-Nic, как попродемонстрировано, позволяет сверкой электрофизиологических реакций с клеточной морфологией.Однотомный фотолиз, выполняемый с интервалом в 10 секунд, позволяет достаточное время восстановления базового тока. В то время как более короткий интервал в одну секунду приводит к постепенному увеличению текущего удерживаемого по мере поступления протокола. Предполагая, что никотин не имеет достаточно времени, чтобы рассеять от системы с более короткими интервалами.При разработке экспериментов, использующих фотоактивируемые молекулы, важно помнить о выборе флуоресцентных индикаторов и сообщать о флуорофорах с совместимыми спектрами выбросов возбуждения. PA-Nic совместим с наиболее распространенными флюорофорами из-за своего короткого пика фотолиза длины волны. При выборе наиболее подходящего метода применения PA-Nic важно тщательно рассмотреть функциональное выражение, физиологическую активность никотиновых рецепторов в нейронах, представляющих интерес.Квалифицированное использование этого метода позволяет тонкой spatiotemporal контроль никотина применения, что позволяет захватывающие новые возможности для изучения кинетики родной никотиновых рецепторов участия, субклеточной локализации и модуляции нейронной активности никотиновых рецепторов активации.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Flash Photolysis of Caged Compounds in the Cilia of Olfactory Sensory  Neurons

Флэш Фотолиз клетке соединений в ресничек Обонятельные сенсорные нейроны

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. ...

Spectral Confocal Imaging of Fluorescently tagged Nicotinic Receptors in Knock-in Mice with Chronic Nicotine Administration

Спектральный конфокальной микроскопии флуоресцентно помеченный никотиновые рецепторы в плей-офф у мышей с хроническим Никотин администрации

Ligand-gated ion channels in the central nervous system (CNS) are implicated in numerous conditions with serious medical and social consequences.  For ...

Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

Изображениями кальция Ответы на GFP с метками нейроны гипоталамуса фрагменты мозга мыши

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the ...

Local Application of Drugs to Study Nicotinic Acetylcholine Receptor Function in Mouse Brain Slices

Местное применение наркотиков по изучению никотиновых рецепторов ацетилхолина функции в срезах мозга мыши

Tobacco use leads to numerous health problems, including cancer, heart disease, emphysema, and stroke. Addiction to cigarette smoking is a prevalent ...

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

В естественных послеродовой электропорации и Покадровый Визуализация из нейробласта миграции в Mouse острой мозга Ломтики

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to ...

Laser-guided Neuronal Tracing In Brain Explants

Лазерным наведением нейронов в головном мозге Трассировка Экспланты

We present a technique which combines an in vitro tracer injection protocol, which uses a series of electrical and pressure pulses to increase dye uptake ...

Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique

Визуализация Серотонинергической волокон в спинном мозге мышей Использование Четкость / КУБИЧЕСКИЙ Техника

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal ...

Studying Brain Function in Children Using Magnetoencephalography

Изучение функций мозга у детей с помощью Магнитоэнцефалография

Magnetoencephalography (MEG) is a non-invasive neuroimaging technique which directly measures magnetic fields produced by the electrical activity of the ...

Chronic Implantation of Whole-cortical Electrocorticographic Array in the Common Marmoset

Хронический имплантации целом корковых Electrocorticographic массива в общей игрунка

Electrocorticography (ECoG) allows the monitoring of electrical field potentials from the cerebral cortex with high spatiotemporal resolution. Recent ...