Name: probing nicotinic acetylcholine receptor function in mouse brain slices via laser flash photolysis of photoactivatable nicotine
Uploaded: 2019-01-25T13:00:00
Duration: 10 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Probing Nicotinic Acetylcholine Receptor Function in Mouse Brain Slices via Laser Flash Photolysis of Photoactivatable Nicotine at JoVE.com

Författarna tackar laboratorium medlemmar av de följande nordvästra Forskargruppsledare: Ryan Drenan, D. James Surmeier, Yevgenia Kozorovitskiy och Anis entreprenör. Detta arbete stöddes av oss National Institutes of Health (NIH) (bidrag DA035942 och DA040626 till R.M.D.), PhRMA Foundation (gemenskap till M.C.A.) och HHMI.

<ol>
	<li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholinergic+tone+in+ventral+tegmental+area:+Functional+organization+and+behavioral+implications.">Cholinergic tone in ventral tegmental area: Functional organization and behavioral implications.</a> Neurochemistry International. 114, 127-133 (2018).</li><li>Sarter, M., Parikh, V., Howe, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phasic+acetylcholine+release+and+the+volume+transmission+hypothesis:+time+to+move+on.">Phasic acetylcholine release and the volume transmission hypothesis: time to move on.</a> Nature Reviews Neuroscience. 10 (5), 383-390 (2009).</li><li>Coyle, J. T., Price, D. L., DeLong, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's+disease:+a+disorder+of+cortical+cholinergic+innervation.">Alzheimer's disease: a disorder of cortical cholinergic innervation.</a> Science. 219 (4589), 1184-1190 (1983).</li><li>Katz, B., Thesleff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+study+of+the+desensitization+produced+by+acetylcholine+at+the+motor+end-plate.">A study of the desensitization produced by acetylcholine at the motor end-plate.</a> Journal of Physiology. 138 (1), 63-80 (1957).</li><li>Banala, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoactivatable+drugs+for+nicotinic+optopharmacology.">Photoactivatable drugs for nicotinic optopharmacology.</a> Nature Methods. 15 (5), 347-350 (2018).</li><li>Yan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotinic+Cholinergic+Receptors+in+VTA+Glutamate+Neurons+Modulate+Excitatory+Transmission.">Nicotinic Cholinergic Receptors in VTA Glutamate Neurons Modulate Excitatory Transmission.</a> Cell Reports. 23 (8), 2236-2244 (2018).</li><li>Engle, S. E., Shih, P. Y., McIntosh, J. M., Drenan, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#945;4&#945;6&#946;2*+nicotinic+acetylcholine+receptor+activation+on+ventral+tegmental+area+dopamine+neurons+is+sufficient+to+stimulate+a+depolarizing+conductance+and+enhance+surface+AMPA+receptor+function.">&#945;4&#945;6&#946;2* nicotinic acetylcholine receptor activation on ventral tegmental area dopamine neurons is sufficient to stimulate a depolarizing conductance and enhance surface AMPA receptor function.</a> Molecular Pharmacology. 84 (3), 393-406 (2013).</li><li>Engle, S. E., Broderick, H. J., Drenan, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+application+of+drugs+to+study+nicotinic+acetylcholine+receptor+function+in+mouse+brain+slices.">Local application of drugs to study nicotinic acetylcholine receptor function in mouse brain slices.</a> Journal of Visualized Experiments. (68), (2012).</li><li>Ren, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Habenula+&amp;#34;cholinergic&amp;#34;+neurons+co-release+glutamate+and+acetylcholine+and+activate+postsynaptic+neurons+via+distinct+transmission+modes.">Habenula &amp;#34;cholinergic&amp;#34; neurons co-release glutamate and acetylcholine and activate postsynaptic neurons via distinct transmission modes.</a> Neuron. 69 (3), 445-452 (2011).</li><li>Koppensteiner, P., Melani, R., Ninan, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Cooperative+Mechanism+Involving+Ca(2+)-Permeable+AMPA+Receptors+and+Retrograde+Activation+of+GABAB+Receptors+in+Interpeduncular+Nucleus+Plasticity.">A Cooperative Mechanism Involving Ca(2+)-Permeable AMPA Receptors and Retrograde Activation of GABAB Receptors in Interpeduncular Nucleus Plasticity.</a> Cell Reports. 20 (5), 1111-1122 (2017).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+Excitation+via+GABAB+Receptors+in+Habenula+Cholinergic+Neurons+Regulates+Fear+Memory+Expression.">Presynaptic Excitation via GABAB Receptors in Habenula Cholinergic Neurons Regulates Fear Memory Expression.</a> Cell. 166 (3), 716-728 (2016).</li><li>Chen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+Baseline+and+Nicotine-Mediated+Behavioral+and+Cholinergic+Profiles+in+ChAT-Cre+Mouse+Lines.">Altered Baseline and Nicotine-Mediated Behavioral and Cholinergic Profiles in ChAT-Cre Mouse Lines.</a> The Journal of Neuroscience. 38 (9), 2177-2188 (2018).</li><li>Nagy, P. M., Aubert, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+the+vesicular+acetylcholine+transporter+increased+acetylcholine+release+in+the+hippocampus.">Overexpression of the vesicular acetylcholine transporter increased acetylcholine release in the hippocampus.</a> Neuroscience. 218, 1-11 (2012).</li><li>Ting, J. T., Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombineering+strategies+for+developing+next+generation+BAC+transgenic+tools+for+optogenetics+and+beyond.">Recombineering strategies for developing next generation BAC transgenic tools for optogenetics and beyond.</a> Frontiers in Behavioral Neuroscience. 8, 111 (2014).</li><li>Crittenden, J. R., Lacey, C. J., Lee, T., Bowden, H. A., Graybiel, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severe+drug-induced+repetitive+behaviors+and+striatal+overexpression+of+VAChT+in+ChAT-ChR2-EYFP+BAC+transgenic+mice.">Severe drug-induced repetitive behaviors and striatal overexpression of VAChT in ChAT-ChR2-EYFP BAC transgenic mice.</a> Frontiers in Neural Circuits. 8, 57 (2014).</li><li>Kolisnyk, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChAT-ChR2-EYFP+mice+have+enhanced+motor+endurance+but+show+deficits+in+attention+and+several+additional+cognitive+domains.">ChAT-ChR2-EYFP mice have enhanced motor endurance but show deficits in attention and several additional cognitive domains.</a> The Journal of Neuroscience. 33 (25), 10427-10438 (2013).</li><li>Nagy, P. M., Aubert, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+the+vesicular+acetylcholine+transporter+enhances+dendritic+complexity+of+adult-born+hippocampal+neurons+and+improves+acquisition+of+spatial+memory+during+aging.">Overexpression of the vesicular acetylcholine transporter enhances dendritic complexity of adult-born hippocampal neurons and improves acquisition of spatial memory during aging.</a> Neurobiology of Aging. 36 (5), 1881-1889 (2015).</li><li>Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+scanning+photochemical+microscopy:+mapping+ligand-gated+ion+channel+distributions.">Two-photon scanning photochemical microscopy: mapping ligand-gated ion channel distributions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (14), 6629-6633 (1994).</li><li>Khiroug, L., Giniatullin, R., Klein, R. C., Fayuk, D., Yakel, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+mapping+and+Ca2++regulation+of+nicotinic+acetylcholine+receptor+channels+in+rat+hippocampal+CA1+neurons.">Functional mapping and Ca2+ regulation of nicotinic acetylcholine receptor channels in rat hippocampal CA1 neurons.</a> The Journal of Neuroscience. 23 (27), 9024-9031 (2003).</li><li>Filevich, O., Salierno, M., Etchenique, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+caged+nicotine+with+nanosecond+range+kinetics+and+visible+light+sensitivity.">A caged nicotine with nanosecond range kinetics and visible light sensitivity.</a> Journal of Inorganic Biochemistry. 104 (12), 1248-1251 (2010).</li><li>Tochitsky, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optochemical+control+of+genetically+engineered+neuronal+nicotinic+acetylcholine+receptors.">Optochemical control of genetically engineered neuronal nicotinic acetylcholine receptors.</a> Nature Chemistry. 4 (2), 105-111 (2012).</li><li>Wokosin, D. L., Squirrell, J. M., Eliceiri, K. W., White, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+workstation+with+concurrent,+independent+multiphoton+imaging+and+experimental+laser+microbeam+capabilities.">Optical workstation with concurrent, independent multiphoton imaging and experimental laser microbeam capabilities.</a> Review of Scientific Instruments. 74 (1), 193-201 (2003).</li><li>Plotkin, J. L., Day, M., Surmeier, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptically+driven+state+transitions+in+distal+dendrites+of+striatal+spiny+neurons.">Synaptically driven state transitions in distal dendrites of striatal spiny neurons.</a> Nature Neuroscience. 14 (7), 881-888 (2011).</li><li>Galtieri, D. J., Estep, C. M., Wokosin, D. L., Traynelis, S., Surmeier, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pedunculopontine+glutamatergic+neurons+control+spike+patterning+in+substantia+nigra+dopaminergic+neurons.">Pedunculopontine glutamatergic neurons control spike patterning in substantia nigra dopaminergic neurons.</a> Elife. 6, (2017).</li><li>Yasuda, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+calcium+concentration+dynamics+in+small+neuronal+compartments.">Imaging calcium concentration dynamics in small neuronal compartments.</a> Science STKE. (219), pl5 (2004).</li><li>Inoue, S., Spring, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Video microscopy: The fundamentals. , 163-186 (1997).</li><li>Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonlinear+magic:+multiphoton+microscopy+in+the+biosciences.">Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences.</a> Nature Biotechnology. 21 (11), 1369-1377 (2003).</li><li>Maravall, M., Mainen, Z. F., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimating+intracellular+calcium+concentrations+and+buffering+without+wavelength+ratioing.">Estimating intracellular calcium concentrations and buffering without wavelength ratioing.</a> Biophysical Journal. 78 (5), 2655-2667 (2000).</li><li>Wathey, J. C., Nass, M. M., Lester, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Numerical+reconstruction+of+the+quantal+event+at+nicotinic+synapses.">Numerical reconstruction of the quantal event at nicotinic synapses.</a> Biophysical Journal. 27 (1), 145-164 (1979).</li><li>Shih, P. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+and+function+of+nicotinic+acetylcholine+receptors+in+subdivisions+of+medial+habenula.">Differential expression and function of nicotinic acetylcholine receptors in subdivisions of medial habenula.</a> The Journal of Neuroscience. 34 (29), 9789-9802 (2014).</li><li>Verhoog, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Layer-specific+cholinergic+control+of+human+and+mouse+cortical+synaptic+plasticity.">Layer-specific cholinergic control of human and mouse cortical synaptic plasticity.</a> Nature Communications. 7, 12826 (2016).</li><li>Koukouli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotine+reverses+hypofrontality+in+animal+models+of+addiction+and+schizophrenia.">Nicotine reverses hypofrontality in animal models of addiction and schizophrenia.</a> Nature Medicine. 23 (3), 347-354 (2017).</li><li>Xiao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+nicotine+selectively+enhances+&#945;4&#946;2*+nicotinic+acetylcholine+receptors+in+the+nigrostriatal+dopamine+pathway.">Chronic nicotine selectively enhances &#945;4&#946;2* nicotinic acetylcholine receptors in the nigrostriatal dopamine pathway.</a> The Journal of Neuroscience. 29 (40), 12428-12439 (2009).</li><li>Peng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Editing+Vectors+for+Studying+Nicotinic+Acetylcholine+Receptors+in+Cholinergic+Transmission.">Gene Editing Vectors for Studying Nicotinic Acetylcholine Receptors in Cholinergic Transmission.</a> European Journal of Neuroscience. , (2018).</li></ol>

D.L.W. fungerar som en betald konsult för Bruker Nano fluorescensmikroskopi.

Valet av PA-Nic ansökan/leverans metod är det mest kritiska steget i denna lokaliserade foto-stimulering teknik. Två metoder, bad ansökan och lokala perfusion, erbjuder varje olika fördelar och begränsningar. Valet påverkas till stor del av nivån nAChR funktionella uttryck i celltyp av intresse. Det är ofta bättre att använda bad ansökan när funktionella uttryck är höga, som bad ansökan gör för en enhetlig sonden koncentration kring inspelade cellen, att underlätta tolkning av data. Bad ansökan eliminerar också behovet av en andra perfusion pipett i vävnaden, vilket gör hela processen enklare. Dock föreningar bad tillämpningen av dyra kostar mer per experiment.
Felsökning innebär vanligen, försöker förstå varför ingen nAChR aktivering är sett följande flash fotolys. När du arbetar med en celltyp som inte har tidigare studerats med PA-Nic, utredaren bör utföra lokala puff-tillämpningen av ACh eller nikotin att avgöra huruvida tillräcklig receptorer är funktionellt uttryckt5. För att verifiera att systemet är kan upptäcka fotolys svaren, bör kontroll experiment göras i mediala habenula nervceller som uttrycker stora mängder receptor30. I detta hjärnområde är PA-Nic bad program möjligt, vilket är att föredra för validering experiment. Endast efter att ha utfört dessa validering experiment bör man gå vidare till ett outforskat celltyp. Om det experimentella systemet har validerats och svaren förblir mycket små eller omätbara, det kan vara befogat att öka koncentrationen av PA-Nic, öka blixtintensitet eller pulslängd, lägga till en nAChR positiv Alloster modulator att förbättra nAChR verksamhet6, eller någon kombination av dessa.
Ibland, uncaging svaren är alltför stora, med betydande nAChR aktivering resulterar i indirekta spänning gated Na+ kanal aktivering och unclamped inåtgående strömmar på grund av dålig utrymme klämman. Dessa artefakter, som helt skymmer nAChR inåtgående strömmar och omöjliggöra tolkning av data, kan elimineras genom införandet av QX-314 (2 mM) i inspelning pipetten. De kan också elimineras genom att minska koncentrationen av PA-Nic eller att minska blixtintensitet eller pulslängd. I alla synliga ljus foto-stimulering experiment, måste försiktighet iakttas när man väljer stimulering platser att undvika oavsiktlig stimulering/fotolys ovanför eller under önskad fokalplanet. Dessutom och när tillämpligt, laser makt måste alltid titreras för att reproducera fysiologiska reaktioner. Det är särskilt viktigt att vara medveten om z-photostimulation när du arbetar med bur ligander, som ligander som aktiveras ovanför/nedanför fokal plats kan fortfarande diffusa och interagera med det biologiska systemet (dvs., -receptorer) under studien.
PA-Nic laser flash fotolys kanske inte lämpliga för alla utredare, som flera begränsningar finns. Först är de relativt höga kostnaderna för en lämplig set-up. När du arbetar med intakt hjärnan skivor, uncaging nära liten diameter strukturer som dendriter kräver en sofistikerad visualiseringssystem såsom 2-photon Mikroskop. Bortsett från de höga kostnaderna för en Ti:sapphire, avstämbara IR pulsad laser för presterande 2-foton mikroskopi, ökar ett dual-galvanometer system kan självständigt positionering två laserstrålar ytterligare system kostnaden. Systemets totala kostnader kan minskas genom att använda en hembyggda system om Utredaren har tillräcklig kompetens och tid att konstruera, felsöka och underhålla ett sådant system. En andra begränsning ofta innebär låg nAChR funktionella uttryck, som kan mildras delvis genom att vidta åtgärder som nämnts ovan, men detta kan inte garantera framgång. Vanligtvis, om man inte kan mäta ligand-aktiverat strömmar efter puff-applicering av agonister, PA-Nic flash fotolys under spänningen klämman kan inte ge acceptabla resultat. En tredje begränsning innebär den inneboende fluorescens av PA-Nic. PA-Nic absorberar ~ 405 nm ljus och avger i ett liknande utbud som grönt fluorescerande protein (GFP) eller Alexa 4885. När PA-Nic koncentrationerna överskrider ~ 1 mM, kan detta fluorescens boende göra det utmanande att samtidigt visualisera neuronala strukturer. För att minska detta, är det viktigt att kunna enkelt styra flödet av PA-Nic från perfusion pipetten. Regelbundet, stoppades PA-Nic flödet för att tillåta fluorescerande molekyler för att diffundera bort. Detta tillåtet ny avbildning av neuron för att kontrollera avistapositionen i uncaging balken. En fjärde potentiella begränsning att nämna innebär användning av 405 nm ljus för fotolys. Kortare våglängder såsom 405 nm är mer benägna att spridningen i komplexa vävnad såsom ett hjärnan segment. Således, vid en given blixt intensitet och varaktighet, uncaging svar amplituder och decay kinetik differentially påverkas av djupet av uncaging fokus inom segmentet. Slutsatser om biologiska aspekter av nAChRs bör beakta denna viktig varning.
Denna lokaliserade laser flash fotolys teknik har använts nyligen att avslöja nya detaljer om nAChR neurobiologi. Exempelvis förbättrar kronisk nikotin exponering perisomatic och dendritiska nAChR funktion i mediala habenula nervceller5. Det användes också för att visa, för första gången att ventral tegmental area glutamat nervceller uttrycka funktionella nAChRs i sin perisomatic och dendritiska cellulära fack6. Det finns många potentiella framtida använder denna teknik, och metoden skulle kunna tillämpas på andra typer av nyckel neuron som är kända för att uttryckliga nAChRs, såsom kortikala pyramidala nervceller31 eller interneuroner i hjärnbarken32, striatum33 , och hippocampus19. Denna teknik kan också kombineras med farmakologi eller nAChR gen redigering34 för att lokalisera specifik receptor undertyper till olika neuronala fack. Metoden kan lätt anpassas till andra kumarin-bur föreningar, inklusive men inte begränsat till, de utvecklas parallellt med PA-Nic5. Slutligen, PA-Nic flash fotolys kan en dag användas i ett vaket/beter sig djur för att studera nikotins action i romanen beteendemässiga farmakologi paradigm.

Kolinerg signalering modulerar många processer i hjärnan, inklusive uppmärksamhet kontroll, viljande rörelse och belöning1,2. Läkemedel som ökar acetylkolin (ACh) överföring används för behandling av kognitiv svikt vid Alzheimers sjukdom, vilket innebär en viktig roll för kolinerga system i kognition3. En förbättrad förståelse av kolinerga receptorer och kretsar i friska och sjuka kan leda till bättre behandlingsmetoder för flera neurologiska sjukdomar/störningar.
ACh nikotinreceptorer (nAChRs) är en familj av ligandreglerade jonkanaler som flux katjoner som svar på endogena ACh eller exogena nikotin från tobaksvaror. Tanke på att de var bland de allra första signalsubstansen receptorerna att vara beskrivna4, är nAChR farmakologi och läge i muskelfibrer väl förstått för muskel-typ receptorer. Däremot är jämförelsevis lite känt om farmakologi och subcellulär distribution av infödda nAChRs i hjärnan. Denna lucka i kunskap togs nyligen upp genom att utveckla en ny kemiska sond som möjliggör rumsligt inskränkt och snabb aktivering av nAChRs i hjärnvävnad under cellular imaging och elektrofysiologiska inspelning5. Här beskrivs de viktigaste metodologiska stegen som är inblandade i detta tillvägagångssätt, med det övergripande målet att förbättra förmågan att ansluta nAChR funktion med neuronala struktur.
Photoactivatable nikotin (PA-Nic, kemiskt namn: 1-[7-[bis(carboxymethyl)-amino] kumarin-4-yl] metyl-nikotin) kan vara photolyzed med ~ 405 nm laser blinkar för att effektivt frigöra nikotin5,6. Före uncaging, PA-Nic är stabil i lösning och uppvisar inga ogynnsamma farmakologisk eller fotokemisk funktioner5. Efter fotolys, släppt nikotin aktiverar förutsägbart nAChRs och uncaging biprodukter är farmakologiskt inerta5. En continuous-wave laser används som fotolys ljuskälla med en uteffekt > 1 mW mätt vid provet. När lokaliserad, riktade foto-stimulering är kombinerat med möjligheten att lokalisera cellulära membran med 2-foton mikroskopi (2PLSM) för laserscanning, och de två viktigaste fördelarna med detta tillvägagångssätt är fullt insåg: fotolys hastighet och rumsliga precision.
I de flesta avseenden är fotolys av PA-Nic överlägsen andra metoder för att leverera nAChR ligander till receptorer i hjärnan skivor. Sådana metoder inkluderar bad ansökan7 och lokal drog leverans via en puffer pipett8. Medan det tidigare tillvägagångssättet tenderar att överbetona de långsiktiga effekterna av tillämpad drogen, kan den senare metoden lida av variabilitet i svar kinetik mellan prövningar och mellan celler. Ingen av dessa alternativa metoder kan adekvat skilja receptor aktiviteter i olika cellulära platser från samma neuron. Optogenetically-aktiverat frisläppandet av ACh har använts för utredning av inhemska nAChRs9,10,11, men det har inte visat sig användbar för mappning subcellulär nAChR platser. Dessutom de flesta studier utnyttjar detta tillvägagångssätt har förlitat sig på en ChR2-uttryckande bakteriella artificiella kromosom transgena möss med onormal kolinerga transmissionen12,13,14, 15 , 16 , 17.
PA-Nic fotolys är inte bara optisk metod för att studera kolinerga receptorer. En bur carbachol användes till funktionellt karta ACh receptor aktiviteter i odlade celler18 och hjärnan skivor19, men var inte kommersiellt tillgängliga för jämförande studier under utvecklingen av PA-Nic. En rutenium bis (bipyridine)-nikotin komplexa (RuBi-nikotin) rapporterades för nikotin uncaging20, men reklamfilmförberedelser RuBi-nikotin visade sämre än PA-Nic i en head-to-head jämförelse studera5. Det kan vara lämpligt att upprepa sådana jämförande experiment med icke-kommersiella, höggradigt renat RuBi-nikotin, som dess synliga absorption kan komplimang PA-nätverkskortets funktioner för kolinerga studier. Slutligen manipulerats nAChRs också optiskt med en kombination av foto-omkopplingsbar ligander och genetiskt modifierade receptorer21. Detta tillvägagångssätt är ett komplement till PA-Nic Fotolys i hjärnvävnad, med förmåga/kravet av genetiska inriktning av den modifierade nAChR ses som både en fördel och en nackdel.
Flera viktiga krav av detta tillvägagångssätt bör noteras. Först behövs en lämplig visualisering metod att exakt lokalisera den neuronala membranen. Imaging med konventionella påljusfluorescens mikroskopi kan räcka när man studerar odlade celler, men för inspelning från nervceller i hjärnan skivor eller andra tjock vävnad preparat, 2PLSM eller konfokalmikroskopi är ett krav. För det andra behövs en lämplig metod att placera fotolys laserstrålen. Denna strategi använder tredjeparts en dual-galvanometer scan huvud med två oberoende x-y speglar för raster skanning av imaging beam och punkt ljusaktivering använder uncaging laser beam22,23,24. Andra, mer begränsade lösningar är möjliga, såsom (1) ett enda-galvanometer scan huvud att alternativt raster File imaging balken och uncaging balken, eller (2) helt enkelt rikta uncaging strålen till mitten av synfältet så att cellen förs till Denna position för flash fotolys. För det tredje krävs ett system för samtidiga elektrofysiologiska inspelning om man vill samla in fysiologiska signaler under experiment. Ovanstående krav kan uppfyllas med en lämplig all-optisk imaging teknik, som nyligen beskriven5. Nedan, ett detaljerat protokoll ingår som beskriver de viktigaste stegen i denna strategi.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Instruments, Consumables, and Miscellaneous Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiclamp 700B</td>
			<td>Molecular Devices Corp.</td>
			<td></td>
			<td>Patch clamp amplifier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pneumatic Picopump</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>PV820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instrument Co</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature Controller</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>TC-324C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibrating blade microtome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>VT1200S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrafree-MC Centrifugal Filter</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>UFC30GV0S</td>
			<td>internal solution filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass Capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B150F-4</td>
			<td>patch and local application pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(-)-Nicotine hydrogen tartrate salt</td>
			<td>Glentham</td>
			<td>GL9693</td>
			<td>nicotine salt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7-carboxymethylamino-4-methyl coumarin</td>
			<td>Janelia Research Campus</td>
			<td></td>
			<td>PA-Nic by-product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-[7-[bis(carboxymethyl)- amino]coumarin-4-yl]methyl-nicotine</td>
			<td>Janelia Research Campus</td>
			<td></td>
			<td>PA-Nic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Euthasol (Pentobarbital Sodium and Phenytoin Sodium)</td>
			<td>Virbac</td>
			<td>ANADA #200-071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa FluorTM 488 Hydrazide</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A10436</td>
			<td>green fill dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa FluorTM 568 Hydrazide</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A10437</td>
			<td>red fill dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-carboxy-AF594 (Alexa Fluor 594)</td>
			<td>Janelia Research Campus</td>
			<td></td>
			<td>red fill dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX 314 chloride</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2313</td>
			<td>voltage-gated sodium channel blocker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power Meter&#160;</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>S120C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals for Solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Methyl-D-glucamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic monohydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(+)-Sodium L-ascorbate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiourea</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>230391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>223506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&#8242;,N&#8242;-tetraacetic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8242;-triphosphate magnesium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanosine 5&#8242;-triphosphate sodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Components of 2-Photon Microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Ultima Laser Scanner for Olympus BX51 Microscope</td>
			<td>Bruker Nano, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>imaging software and galvos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160; Imaging X-Y galvanometers</td>
			<td>Cambridge Technology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Mai Tai HP1040</td>
			<td>Spectra-Physics</td>
			<td></td>
			<td>Tuneable IR laser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; &#160;&#160;&#160;&#160;&#160;Pockels cell M350-80-02-BK with M302RM Driver</td>
			<td>Conoptics, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>for IR laser attenuation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Integrating Sphere Photodiode Power Sensor</td>
			<td>Thorlabs, Inc</td>
			<td></td>
			<td>laser power pick-off photodiode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160; Uncaging X-Y galvanometers</td>
			<td>Cambridge Technology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Helios 2-Line Laser Launch</td>
			<td>Bruker Nano, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>uncaging laser components</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; OBIS LX/LS 405 nm (100 mW)</td>
			<td>Coherent, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; OBIS LX/LS 473 nm (75 mW)</td>
			<td>Coherent, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; &#160;Point-Photoactivation / Fiber Input Module for Limo Sidecar - Uncaging</td>
			<td>Bruker Nano, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upright Microscope</td>
			<td>&#160;Olympus</td>
			<td>BX51WIF</td>
			<td>Upright microscope chasis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160; Objective: Olympus M Plan FL 10x; NA 0.3 WD 11 mm</td>
			<td>&#160;Olympus</td>
			<td></td>
			<td>10x objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160; Objective: Olympus M Plan Fluorite 60x/1.0 WD=2mm NIR</td>
			<td>&#160;Olympus</td>
			<td></td>
			<td>60x water-dipping objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160; X-Cite 110, four-LED LLG coupled epi-fluorescence light source</td>
			<td>Excelitas Technologies</td>
			<td></td>
			<td>LED Light Source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Epi-Fluorescence Filter: ET-GFP (FITC/CY2) for Epi-Turret</td>
			<td>Chroma Technologies</td>
			<td></td>
			<td>LED Filter for blue light excitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Epi-Fluorescence Filter: ET-DsRed (TRITC/CY3) for Epi-Turret</td>
			<td>Chroma Technologies</td>
			<td></td>
			<td>LED Filter for green light excitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160; B&#38;W CCD camera; Watec, 0.5in B/W CCD</td>
			<td>Watec Co., LTD.</td>
			<td></td>
			<td>CCD camera for patch clamp recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>External Detectors - Dual Reflected Emission - Olympus Upright (Multi-Alkali, GaAsP)</td>
			<td>Bruker Nano, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160; Multi-alkali side-on PMT</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>R3896</td>
			<td>red channel PMT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 595/50m</td>
			<td>Chroma Technologies</td>
			<td></td>
			<td>red channel emission filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 565lpxr</td>
			<td>Chroma Technologies</td>
			<td></td>
			<td>dichroic beam splitter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160; GaAsP end-on PMT</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>7422PA-40</td>
			<td>green channel PMT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 525/70m</td>
			<td>Chroma Technologies</td>
			<td></td>
			<td>green channel emission filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; High-Speed Shutter for Hamamatsu H7422 PMT</td>
			<td>Vincent Associates / Bruker</td>
			<td>517329</td>
			<td>PMT shutter mount</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dodt Gradient Contrast Transmission Detection Module</td>
			<td>Bruker Nano, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160; Multi-alkali side-on PMT</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>R3896</td>
			<td>Dodt PMT</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

probing nicotinic acetylcholine receptor function in mouse brain slices via laser flash photolysis of photoactivatable nicotine

Acetylkolin (ACh) verkar via receptorer att modulera olika neuronala processer, men det har svårt för att länka ACh receptor funktion med subcellulär läge inom celler där denna funktion utförs. För att studera subcellulär placeringen av nikotinreceptorer ACh (nAChRs) i native hjärnvävnad, utvecklades en optisk metod för exakt release av nikotin på diskreta platser nära neuronala membran under elektrofysiologiska inspelningar. Patch-fastklämd nervceller i hjärnan skivor är fyllda med färga för att visualisera deras morfologi under 2-photon laser scanning mikroskopi och nikotin uncaging utförs med en ljus blixt genom att fokusera en 405 nm laser beam nära en eller flera cellulära membran. Cellulära aktuella omläggningar mäts, och en högupplöst tredimensionella (3D) bild av inspelade neuron är gjord för att möjliggöra avstämning av nAChR svaren med cellulära morfologi. Denna metod möjliggör detaljerad analys av nAChR funktionell distribution i komplexa vävnad preparat, lovar att förbättra förståelsen av kolinerg neurotransmission.

För fotolys är stimulering, exponeringsdos (intensitet och tid), exponering läge och beam geometri viktiga variabler. Systemet beskrivs i denna artikel kan två olika photostimulation balkar, justerbar via flyttar en lins och utcheckning av photostimulation ljusstrålen innan balken träder galvanometer systemet. Utan denna lins, photostimulation strålen fyller ingången eleven av 60 x / 1.0 NA vatten-doppning [60 x WD] mål, producerar en nära-diffraktion-begränsad, sub-µm plats på fokalplanet inuti provet. Detta är förknippat med photostimulation ljus med en timglasform, sträcker sig ovanför och nedanför den focal spot symmetrisk med den optiska axeln. Med objektiv isatt i sökvägen, photostimulation laserljus är inriktad till ingången eleven av objektivet och sedan avslutas som en penna-liknande stråle. Denna balk, som förväntas vara ~ 10 µm i diameter för en 60 x mål, lodrätt jämnt/under hela provet. I det här läget blir ljusintensiteten på valfri plats inom stimulering plats ~ 1% av nära-diffraktion-begränsad liten spot intensiteten. Alltså krävs högre laser befogenheter normalt när du använder ~ 10 µm spot stimulering. För alla experiment rapporterats i denna artikel, användes ett timglas-typ photostimulation-beam.
Levererade prov kraften kan plottas mot inställningen inspänning, efter mätning av laser på provet med hjälp av en kraftmätare. Dessa studier använder en 60 x WD mål med ett avstånd av 2 mm, men det är inte nedsänkt i vatten att undvika potentiella skada elementet detektor mätningar på power. När mål med listan NA > 0,95 mäts i luft (utan nedsänkning vätska), det kan finnas totalreflexion förluster på elementet lins framsidan på grund av det lägre indexet (luft). I detta fall, för en mer exakt prov power mätning (för att korrigera för totalreflexion förluster), öka den uppmätta kraften av 1,0 NA objektiva (1,0/0,95)2 mätt i luften. Figur 1a visar en typisk indata/utdata-tomt för 405 nm och 473 nm synligt lasrar som är införlivade med lasern lansera systemet i denna studie. Dessa lasersystem är idealiska för foto-stimulering dos Exponeringskontroll av följande skäl: (1) de är pre kalibrerad att ge direkt linjär uteffekt i förhållande till inspänning (0-5 V), (2) de ger en tyst slutare drift (med ingen laser produktionen), och (3) de har rapid, sub-ms intensitet puls längd kontroll (0.1 ms svar). När du använder spot foto-stimulering med en laser/galvo system, är rutinmässig kalibrering av MarkPoints ställen en viktig uppgift. Figur 1b (till vänster) visar ett system som är ur kalibrering (önskad punkt att foto-stimulera inte resulterar i exakt stimulering av denna punkt, som indikeras av bränna-håls läge), med en återgång till exakt positionering av plats efter kalibrering ( Figur 1b, högra panelen). 
PA-Nic är blygsamt fluorescerande (utsläpp peak på ~ 510 nm), uppvisar effektiv excitation mellan 350-450 nm (1-photon magnetisering) eller 700-900 nm (2-photon magnetisering)5. För att visualisera PA-Nic under lokal applicering, PA-Nic (1 mM) tillämpades nära hjärnvävnad följt av samtidig avbildning av hjärnan (1) vävnad optisk sektionerad överföring sammanhang via Dodt kontrast och (2) utsända fluorescens från excitation (900 nm) av PA-Nic. PA-Nic 2PE fluorescens var lätt att upptäcka under trycket utmatning från ett lokalt program pipett (figur 2a). Nikotin och en monoalkylcoumarin, 7-carboxymethylamino-4-metyl kumarin, är de huvudsakliga fotokemiska produkterna av PA-Nic fotolys reaktion5. Med samma imaging inställningar/parametrar som användes för PA-Nic imaging, fotograferades vävnaden under leverans av antingen nikotin (1 mM) eller 7-carboxymethylamino-4-metyl kumarin (1 mM). Ingen fluorescerande signal upptäcktes (figur 2a, mellersta och nedre paneler), visar specificiteten av PA-Nic resultaten. Slutligen, PA-Nic tillämpades inom hjärnvävnad och PA-Nic fluorescens utsläpp fotograferades (figur 2b). Detta tillvägagångssätt bekräftar att PA-Nic är närvarande inom 100-200 µm i lokala tillämpningen pipetten. Tillsammans, bekräftar dessa uppgifter att PA-Nic effektivt levereras till hjärnans vävnad via lokala program.
Elektrofysiologi inspelningar med samtidiga 2PLSM för visualisering av cellulära strukturer kräver utredaren att balans överväganden för båda komponenterna av experimentet, och ofta ett smalt tidsfönster (~ 20 min) är tillgänglig för giltig prov datainsamling från en lappat cell. Utan med tanke på cellulära visualisering, är det bäst att börja spela in så snart som möjligt efter inbrott eftersom inspelningen stabiliteten tenderar att minska med tiden. Dock när imaging är ett krav, måste elektrofysiologiska överväganden tillåta tillräcklig tid för fluorescens koncentrationen ökar i små/fjärrkontroll strukturer. Detta exemplifieras genom att undersöka en dye koncentration fylla kurva28, vilket är ibland användbart att härleda när imaging en ny celltyp. Figur 3 visar flera exempel nervceller avbildats som Z-stackar via 2PLSM och kollapsat till en maximal intensitet projektion för presentation ändamål. Figur 3a visar bilder av hög kvalitet där neuronala morfologi verkar vara komplett, brus minimeras och skräp inte störa tolkningen av cellulära morfologi. Figur 3b visar bilder av lägre kvalitet, på grund av en lägre signal till bakgrunden baserat och betydande skräp. Detta skräp visas ofta som sfäriska fickor av intensiv fluorescens, som härrör från utmatning av imaging färgämne från patch pipetten samtidigt närmar sig cellen. Bland annat införande av 100 µM PA-Nic i badet (när du utför bad ansökan) tenderar att minska förhållandet signal-till-bakgrund och leder till suboptimala bildens kontrast. Alexa Fluor 568 eller 594 är ofta ganska användbart i lokala tillämpningen experiment som finder färgämne eller som ett normaliserande 2PE referens/normalisering signal. En effektiv våglängd för två-photon excitation av dessa färgämnen är ~ 780 nm27, som tillåter samtidiga visualisering av PA-Nic och identifiering av cellulära fack. Denna våglängd, dock undvika inte helt två-photon fotolys av PA-Nic5. Alexa Fluor 488 är fördelaktigt i PA-Nic bad-ansökan experiment; När glada med en lämplig våglängd ≥900 nm, kan två-photon fotolys av PA-Nic5 undvikas samtidigt bibehålla lämpliga visualisering av cellulära fack.
Figur 4 visar exempeldata för lokaliserad PA-Nic laser flash fotolys på MHb nervceller i hjärnan skivor. Figur 4a (övre paneler) visar ett exempel på en ”referens” bilden, som är en skärm-ta till fånga av den sista 2PLSM bild tagen innan protokollet MarkPoints kördes, övertäckt med foto-stimulering plats platsen. Figur 4a (nedre bilden paneler) visar en inzoomad bild av foto-stimulering spot överlagras på cellulära morfologi. Motsvarande tid-korrelerade elektrofysiologiska svar PA-Nic fotolys visas i figur 4alägre paneler. Tidigare arbete visat att dessa strömningar är känsliga för nAChR antagonister5. Figur 4b visar representativa uppgifter från olika celler där den enda plats fotolys utfördes med ett intervall på antingen 1 s eller 10 s. ett 10 s-intervall får tillräcklig återhämtningstiden för baslinjen hålla nuvarande, kortare 1 s intervall ledde till en gradvis ökning av anläggningen som är aktuella som protokoll fortsatte. Den ökande nuvarande antyder att nikotin inte hade tillräckligt med tid att diffundera bort från systemet med 1 Hz intervall29. Sådana tidsmässiga svar analyser måste vara utfört de novo på någon ny celltyp som studeras, eftersom neurofarmakologi av nAChRs kan skilja sig mellan celltyper.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58873/58873fig1.jpg"> Figur 1: Photostimulation laser kalibrering. (en) foto-stimulering laser uteffekt. Effekt vid prov planet (genom en 60 x / 1.0 NA vatten-doppning mål) mättes för 405 nm och 473 nm foto-stimulering lasrar på angivna kapacitetsinställningen. (b) foto-stimulering laser kalibrering. Skärm ta till fånga profilen Visa rumslig relation mellan avsedda foto-stimulering plats och motsvarande plats där foto-stimulering inträffade (bränna hål) före (vänster) och efter (höger) kör kalibrering i MarkPoints. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58873/58873fig1large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58873/58873fig2.jpg"> Figur 2: PA-Nic lokala tillämpningen. (en) identifiering av PA-Nic från en lokal applikation pipett. 1 mM PA-Nic, fotolys biprodukt eller nikotin var upplöst i ACSF lästs in lokalt program pipett och dispenseras på hjärnvävnaden under 2PLSM (900 nm magnetisering) imaging använder samma imaging inställningar för varje läkemedel. Laserscanning Dodt kontrast överföring bilden visar vävnad/pipetten medan en GaAsP katod PMT användes för att fånga fluorescens utsläpp. (b), PA-Nic (1 mM) var perfusion i hjärnvävnad och avbildas via 2PLSM som (en) att Visa laterala spridningen av PA-Nic med dess inneboende fluorescens. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58873/58873fig2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58873/58873fig3.jpg"> Figur 3: förvärv av 2-foton mikroskopi bilder för laserscanning. (en) Optimal 2PLSM Z-stackar. Två exempel på 2PLSM Z-stack maximalstyrkan prognoser är visas av MHb nervceller med väl löst dendriter och lite till inget störande skräp. (b) suboptimala 2PLSM Z-stackar. Två exempel på 2PLSM Z-stack maximalstyrkan prognoser visas för MHb nervceller omgiven av skräp (färgämne utvisas från pipetten under närma sig cellen). Sådana bilder är svårare att tolka än bilderna som de visas i (en). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58873/58873fig3large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58873/58873fig4.jpg"> Figur 4: Laser flash fotolys av PA-Nic. (en) MarkPoints referens bilder och inåtgående strömmar frammanade av PA-Nic fotolys. För en MHb neuron visas rå referensbilder för MarkPoints foto-stimulering prövningar på en enda (indikeras) cellulär plats. Observera att för vissa foto-stimulering platser (den högra bilden i denna serie), dendritiska struktur är i fokus men de soma och proximala dendrite är inte. Under varje referensbild ritas nikotin uncaging-framkallat inåt nuvarande. (b) mellan stimulus intervall för PA-Nic fotolys. Föredöme inspelningar visas för MHb nervceller där nikotin var upprepade gånger uncaged på samma perisomatic plats med ett mellan stimulus intervall 1 s eller 10 s. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58873/58873fig4large.jpg" target="_blank">vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Probing Nicotinic Acetylcholine Receptor Function in Mouse Brain Slices via Laser Flash Photolysis of Photoactivatable Nicotine at JoVE.com

Probing Nicotinic Acetylcholine Receptor Function in Mouse Brain Slices via Laser Flash Photolysis of Photoactivatable Nicotine

Denna artikel presenterar en metod för att studera nikotinacetylkolinreceptorer (nAChRs) i mus hjärnan skivor av nikotin uncaging. När tillsammans med samtidiga patch clamp inspelning och 2-foton mikroskopi för laserscanning, ansluter nikotin uncaging nikotinhaltiga receptorn funktion med cellulära morfologi, att ge en djupare förståelse av kolinerga neurobiologi.

Sondera Nicotinic acetylkolin Receptor funktion i mus hjärnan skivor via Laser Flash fotolys Photoactivatable nikotin

Acetylcholine (ACh) acts through receptors to modulate a variety of neuronal processes, but it has been challenging to link ACh receptor function with ...

Denna teknik utnyttjar multi-foton laser-scanning mikroskopi i samband med laser-flash photolysis av en fotoaktiv nikotin molekyl. Att tillåta exakt aktivering av nikotiniska kolinerga receptorer. Denna teknik möjliggör fin spatiotemporal kontroll över nikotin receptor agonist ansökan, vilket ger ett kraftfullt verktyg för studier av receptorn funktionella uttrycksmönster och kolinerga synaptiska eller volymöverföring.Innan du börjar proceduren, använd en programmerbar pipettdragare för att dra en mikropipette i glas med en 20-till 40-mikrometer öppningsdiameter. Sila ungefär en milliliter inspelningslösning genom ett 0,22-mikronfilter. Och resuspend nog lyophilized photoactivatable nikotin i filtrerad inspelningslösning för att ge en två-millimolar slutlig koncentration.Återfylla den drog lokala ansökan mikropipette med 50 mikroliter av fotoaktivt läkemedel, och säkra pipetten i en pipett hållare monterad på en micromanipulator. Anslut pipettens hållare via lämplig slanglängd till ett tryckutmatningssystem som kan hålla i sig lågtrycksapplikation. Och använd mikromanipulatorn för att manövrera den lokala applikationspipetten i lösningen för extracellulär inspelning.Placera pipettens spets något ovanför ett mushjärnvävnadsprov, cirka 50 mikrometer från intressecellen. Och kort tillämpa en till två pounds per kvadrattum av tryck på pipetten. Det bör vara minimal till ingen förskjutning av cellen av intresse.Efter att ha uppnått en stabil helcellsplåster klämma, slå på den låga ansökan på tryckutskjutningsanordningen, och mätta vävnaden som omger cellen med fotoaktiv nikotin i en till två minuter. Lokala program introducerar ytterligare komplexitet i experimentet. Men det skonar förening och tillåter högre koncentrationer av PA-Nic som skall utnyttjas.För bad tillämpning av den fotoaktiva nikotin, först lösa tillräckligt av lyophilized drogen i en volym av inspelningslösning lämplig för kontinuerlig återcirkulation till en 100-mikromolar slutlig koncentration. Och ladda den resulterande blandningen till ett perfusionssystem. Börja sedan återcirkulationen av den fotoaktivera nikotinlösningen med en 1,5-till 2-millimeters per minut-hastighet, med hjälp av slangar med en minimal innerdiameter och totallängd för att minimera den nödvändiga återcirkulationsvolymen.Under recirkulationen, kontinuerligt bubbla lösningen med karbiogen, och upprätthålla badtemperaturen vid 32 grader Celsius under svagt ljus. Bad ansökan drar nytta av enkelhet och enhetlighet PA-Nic permeation av vävnaden. Men det nödvändigtvis använder lägre mikromolar PA-Nic koncentrationer, och förbrukar högre totala mängder av förening.För levande visualisering av en medial habenula neuron, använd överförd ljus eller infraröd differentialstörning kontrastoptik och en videokamera för att upprätta en stabil, hela cellen patch klämma inspelning. Efter upprättandet av den cellfästa högmotståndskonfigurationen, men innan inbrott, växlar du inställnings- och programvara till laserskanningsläge. Efter inbrott, använd laserscanning för att kontrollera att bildåtergivningsfärgen av intresse är passivt fylla neuron genom diffusion.Låt färgämnet fylla cellfacken i minst 20 till 30 minuter innan du använder live-skanningsfunktionen för att visualisera neuron och subcellulärt delutrymme av intresse. Välj bildbehandlingsparametrar som tillåter en korrekt livevisualisering av de neuronala funktionerna, manipulera lämpliga inställningar för att påverka eller ändra visningsvisualisering, upplösning, signal-brus-förhållande och bildramsanskaffningstid vid behov. Förbättra signalkontrasten genom att öppna uppslagsbordets fönster och justera inställningarna för uppslagsbordsgolv och tak.Om du vill lokalisera ett område av intresse inom vävnaden väljer du den optiska zoomen 1X och använder panoreringskontrollerna. Använd verktyget Z-serien för att välja en start- och stoppposition som innehåller den cell av intresse. Ange en stegstorlek på en mikrometer, och välj en bildstorlek som ger en bild med högst upplösning.Ofta 1, 024 med 1, 024 pixlar per rad. Sedan i följd bild neuron i varje Z-plan som innehåller cellen. För att kalibrera laserstimuleringen startar du systemskanningen med en bildgivande lasereffekt som är större än minimum, och finjusterar objektivt fokus på det tunna röda markörfluorescensskiktet.Välj ett område inom fluorescensfältet fritt från skräp och jämnt belagda med markör, och öppna verktygen, kalibrerings- och justeringsmenyn för att välja den oskadliga galvokalibreringsfunktionen. Följ burn spots handledning för den rumsliga kalibreringen av den andra galvanometern spegelpar, välja 405-nanometer laser, en laserstimuleringseffekt på 400, och en stimulering varaktighet 20 millisekunder. Att ge en-till fem-mikrometer diameter hål i den röda markören.Välj uppdatering för att stimulera och uppdatera bilden efter mitten plats bränna, och flytta den runda röda indikatorn till den faktiska plats plats för centrum, höger-center, och nedre-center fläckar för att få ett rutnät med nio fläckar. För att testa kalibreringen, öppna fönstret för markeringspunkter och aktivera stimuleringsparametrarna för de definierade fläckarna manuellt i ett nytt område av provet, var noga med att den korrekta senaste kalibreringsfilen läses in i fönstret med markeringspunkter. Applicera sedan en testpuls för att verifiera rätt kalibrering.För att kortfattat avbilda och lokalisera det subcellulära intresseområdet väljer du live-skanning och använd öka den optiska zoomen för att visualisera eventuella små strukturer efter behov. Placera markeringspunkten med enstaka fläckkors i direkt anslutning till cellmembranet och ställ in fotostimuleringsparametrarna på en varaktighet på en till 50 millisekvis, en en-till-fyra-milliwattlasereffekt och minst en försöksversion. Välj sedan kör markera punkter för att initiera varumärket punkter protokollet, och observera den elektrofysiologi datainsamling i realtid.Fotoaktiv nikotin 2PE fluorescens av en millimolar PA-Nic är lätt detekteras under tryck utskjutning från en lokal ansökan pipett som visat. Medan leveransen av de viktigaste fotokemiska produkterna av fotoaktiv nikotinfotolysreaktionen genererar ingen fluorescerande signal vid samma koncentration och exciteringskraft och våglängd. Demonstrerar specificiteten hos de fotoaktiva nikotinresultaten.Imaging av den fotoaktiva nikotin tillämpas på hjärnvävnaden som visat avslöjar förekomsten av läkemedlet inom 100 till 200 mikrometer av den lokala ansökan pipetten. Bekräftar att fotoaktiv nikotin effektivt kan levereras till hjärnvävnaden via lokal applicering. Här, högkvalitativa bilder inom vilka neuronal morfologi verkar vara komplett, är bullret minimeras, och skräp inte stör tolkningen av cellulära morfologi, visas.Dessa bilder är dock av lägre kvalitet. På grund av ett lägre signal-till-bakgrundsförhållande och betydande skräp. Para ihop två-foton laser skanning mikroskopi av mediala habenula nervceller i hjärnan skivor med laser flash photolysis av PA-Nic som visat, möjliggör försoning av elektrofysiologiska svar med cellulära morfologi.Enkel-spot photolysis utförs med 10-sekunders intervall tillåter en tillräcklig återhämtningstid för baslinjen hålla ström. Medan en kortare en sekunds intervall leder till en gradvis ökning av innehavsströmmen allt eftersom protokollet fortsätter. Tyder på att nikotinet inte har tillräckligt med tid att sprida sig bort från systemet med de kortare intervallerna.Vid utformningen av experiment som utnyttjar fotoaktivtiga molekyler är det viktigt att komma ihåg att välja fluorescerande indikatorer och rapportera fluoroforer med kompatibla excitationsemissionsspektra. PA-Nic är kompatibel med de flesta vanliga fluoroforer på grund av sin korta våglängd fotolys topp. När du väljer den lämpligaste PA-Nic applikationstekniken är det viktigt att noga överväga det funktionella uttrycket, fysiologisk aktivitet av nikotinreceptorerna i nervcellerna av intresse.Skickligt utnyttjande av denna teknik möjliggör fin spatiotemporal kontroll av nikotinapplikation, vilket möjliggör spännande nya möjligheter för att studera kinetiken hos infödd nikotinreceptorengagemang, subcellulär lokalisering och modulering av neuronal aktivitet genom nikotinreceptoraktivering.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Flash Photolysis of Caged Compounds in the Cilia of Olfactory Sensory  Neurons

Flash Fotolys av Caged föreningar i Cilia av Olfactory sensoriska neuroner

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. ...

Spectral Confocal Imaging of Fluorescently tagged Nicotinic Receptors in Knock-in Mice with Chronic Nicotine Administration

Spektral Confocal avbildning av fluorescensmärkta nikotinreceptorer i Knock-in Möss med kronisk Nikotin Administration

Ligand-gated ion channels in the central nervous system (CNS) are implicated in numerous conditions with serious medical and social consequences.  For ...

Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

Imaging Kalcium svar i GFP-märkta neuroner i hypotalamus skivor mushjärna

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the ...

Local Application of Drugs to Study Nicotinic Acetylcholine Receptor Function in Mouse Brain Slices

Lokal applicering av läkemedel att studera Nicotinic Funktion acetylkolinreceptorn i skivor mushjärna

Tobacco use leads to numerous health problems, including cancer, heart disease, emphysema, and stroke. Addiction to cigarette smoking is a prevalent ...

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

In vivo Postnatal elektroporation och Time-lapse avbildning av neuroblast migration i mus Akut hjärnan skivor

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to ...

Laser-guided Neuronal Tracing In Brain Explants

Laserstyrda Neuronal spårning i Brain Explantat

We present a technique which combines an in vitro tracer injection protocol, which uses a series of electrical and pressure pulses to increase dye uptake ...

Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique

Imaging Serotonerga Fibrer i ryggmärgen hos möss med hjälp av CLARITY / CUBIC teknik

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal ...

Studying Brain Function in Children Using Magnetoencephalography

Studera hjärnans funktion i barn som använder Magnetencefalografi

Magnetoencephalography (MEG) is a non-invasive neuroimaging technique which directly measures magnetic fields produced by the electrical activity of the ...

Chronic Implantation of Whole-cortical Electrocorticographic Array in the Common Marmoset

Kronisk Implantation av hela-kortikala Electrocorticographic matris i Marmosettapa

Electrocorticography (ECoG) allows the monitoring of electrical field potentials from the cerebral cortex with high spatiotemporal resolution. Recent ...