Sondera Nicotinic acetylkolin Receptor funktion i mus hjärnan skivor via Laser Flash fotolys Photoactivatable nikotin

Denna teknik utnyttjar multi-foton laser-scanning mikroskopi i samband med laser-flash photolysis av en fotoaktiv nikotin molekyl. Att tillåta exakt aktivering av nikotiniska kolinerga receptorer. Denna teknik möjliggör fin spatiotemporal kontroll över nikotin receptor agonist ansökan, vilket ger ett kraftfullt verktyg för studier av receptorn funktionella uttrycksmönster och kolinerga synaptiska eller volymöverföring.

Innan du börjar proceduren, använd en programmerbar pipettdragare för att dra en mikropipette i glas med en 20-till 40-mikrometer öppningsdiameter. Sila ungefär en milliliter inspelningslösning genom ett 0,22-mikronfilter. Och resuspend nog lyophilized photoactivatable nikotin i filtrerad inspelningslösning för att ge en två-millimolar slutlig koncentration.

Återfylla den drog lokala ansökan mikropipette med 50 mikroliter av fotoaktivt läkemedel, och säkra pipetten i en pipett hållare monterad på en micromanipulator. Anslut pipettens hållare via lämplig slanglängd till ett tryckutmatningssystem som kan hålla i sig lågtrycksapplikation. Och använd mikromanipulatorn för att manövrera den lokala applikationspipetten i lösningen för extracellulär inspelning.

Placera pipettens spets något ovanför ett mushjärnvävnadsprov, cirka 50 mikrometer från intressecellen. Och kort tillämpa en till två pounds per kvadrattum av tryck på pipetten. Det bör vara minimal till ingen förskjutning av cellen av intresse.

Efter att ha uppnått en stabil helcellsplåster klämma, slå på den låga ansökan på tryckutskjutningsanordningen, och mätta vävnaden som omger cellen med fotoaktiv nikotin i en till två minuter. Lokala program introducerar ytterligare komplexitet i experimentet. Men det skonar förening och tillåter högre koncentrationer av PA-Nic som skall utnyttjas.

För bad tillämpning av den fotoaktiva nikotin, först lösa tillräckligt av lyophilized drogen i en volym av inspelningslösning lämplig för kontinuerlig återcirkulation till en 100-mikromolar slutlig koncentration. Och ladda den resulterande blandningen till ett perfusionssystem. Börja sedan återcirkulationen av den fotoaktivera nikotinlösningen med en 1,5-till 2-millimeters per minut-hastighet, med hjälp av slangar med en minimal innerdiameter och totallängd för att minimera den nödvändiga återcirkulationsvolymen.

Under recirkulationen, kontinuerligt bubbla lösningen med karbiogen, och upprätthålla badtemperaturen vid 32 grader Celsius under svagt ljus. Bad ansökan drar nytta av enkelhet och enhetlighet PA-Nic permeation av vävnaden. Men det nödvändigtvis använder lägre mikromolar PA-Nic koncentrationer, och förbrukar högre totala mängder av förening.

För levande visualisering av en medial habenula neuron, använd överförd ljus eller infraröd differentialstörning kontrastoptik och en videokamera för att upprätta en stabil, hela cellen patch klämma inspelning. Efter upprättandet av den cellfästa högmotståndskonfigurationen, men innan inbrott, växlar du inställnings- och programvara till laserskanningsläge. Efter inbrott, använd laserscanning för att kontrollera att bildåtergivningsfärgen av intresse är passivt fylla neuron genom diffusion.

Låt färgämnet fylla cellfacken i minst 20 till 30 minuter innan du använder live-skanningsfunktionen för att visualisera neuron och subcellulärt delutrymme av intresse. Välj bildbehandlingsparametrar som tillåter en korrekt livevisualisering av de neuronala funktionerna, manipulera lämpliga inställningar för att påverka eller ändra visningsvisualisering, upplösning, signal-brus-förhållande och bildramsanskaffningstid vid behov. Förbättra signalkontrasten genom att öppna uppslagsbordets fönster och justera inställningarna för uppslagsbordsgolv och tak.

Om du vill lokalisera ett område av intresse inom vävnaden väljer du den optiska zoomen 1X och använder panoreringskontrollerna. Använd verktyget Z-serien för att välja en start- och stoppposition som innehåller den cell av intresse. Ange en stegstorlek på en mikrometer, och välj en bildstorlek som ger en bild med högst upplösning.

Ofta 1, 024 med 1, 024 pixlar per rad. Sedan i följd bild neuron i varje Z-plan som innehåller cellen. För att kalibrera laserstimuleringen startar du systemskanningen med en bildgivande lasereffekt som är större än minimum, och finjusterar objektivt fokus på det tunna röda markörfluorescensskiktet.

Välj ett område inom fluorescensfältet fritt från skräp och jämnt belagda med markör, och öppna verktygen, kalibrerings- och justeringsmenyn för att välja den oskadliga galvokalibreringsfunktionen. Följ burn spots handledning för den rumsliga kalibreringen av den andra galvanometern spegelpar, välja 405-nanometer laser, en laserstimuleringseffekt på 400, och en stimulering varaktighet 20 millisekunder. Att ge en-till fem-mikrometer diameter hål i den röda markören.

Välj uppdatering för att stimulera och uppdatera bilden efter mitten plats bränna, och flytta den runda röda indikatorn till den faktiska plats plats för centrum, höger-center, och nedre-center fläckar för att få ett rutnät med nio fläckar. För att testa kalibreringen, öppna fönstret för markeringspunkter och aktivera stimuleringsparametrarna för de definierade fläckarna manuellt i ett nytt område av provet, var noga med att den korrekta senaste kalibreringsfilen läses in i fönstret med markeringspunkter. Applicera sedan en testpuls för att verifiera rätt kalibrering.

För att kortfattat avbilda och lokalisera det subcellulära intresseområdet väljer du live-skanning och använd öka den optiska zoomen för att visualisera eventuella små strukturer efter behov. Placera markeringspunkten med enstaka fläckkors i direkt anslutning till cellmembranet och ställ in fotostimuleringsparametrarna på en varaktighet på en till 50 millisekvis, en en-till-fyra-milliwattlasereffekt och minst en försöksversion. Välj sedan kör markera punkter för att initiera varumärket punkter protokollet, och observera den elektrofysiologi datainsamling i realtid.

Fotoaktiv nikotin 2PE fluorescens av en millimolar PA-Nic är lätt detekteras under tryck utskjutning från en lokal ansökan pipett som visat. Medan leveransen av de viktigaste fotokemiska produkterna av fotoaktiv nikotinfotolysreaktionen genererar ingen fluorescerande signal vid samma koncentration och exciteringskraft och våglängd. Demonstrerar specificiteten hos de fotoaktiva nikotinresultaten.

Imaging av den fotoaktiva nikotin tillämpas på hjärnvävnaden som visat avslöjar förekomsten av läkemedlet inom 100 till 200 mikrometer av den lokala ansökan pipetten. Bekräftar att fotoaktiv nikotin effektivt kan levereras till hjärnvävnaden via lokal applicering. Här, högkvalitativa bilder inom vilka neuronal morfologi verkar vara komplett, är bullret minimeras, och skräp inte stör tolkningen av cellulära morfologi, visas.

Dessa bilder är dock av lägre kvalitet. På grund av ett lägre signal-till-bakgrundsförhållande och betydande skräp. Para ihop två-foton laser skanning mikroskopi av mediala habenula nervceller i hjärnan skivor med laser flash photolysis av PA-Nic som visat, möjliggör försoning av elektrofysiologiska svar med cellulära morfologi.

Enkel-spot photolysis utförs med 10-sekunders intervall tillåter en tillräcklig återhämtningstid för baslinjen hålla ström. Medan en kortare en sekunds intervall leder till en gradvis ökning av innehavsströmmen allt eftersom protokollet fortsätter. Tyder på att nikotinet inte har tillräckligt med tid att sprida sig bort från systemet med de kortare intervallerna.

Vid utformningen av experiment som utnyttjar fotoaktivtiga molekyler är det viktigt att komma ihåg att välja fluorescerande indikatorer och rapportera fluoroforer med kompatibla excitationsemissionsspektra. PA-Nic är kompatibel med de flesta vanliga fluoroforer på grund av sin korta våglängd fotolys topp. När du väljer den lämpligaste PA-Nic applikationstekniken är det viktigt att noga överväga det funktionella uttrycket, fysiologisk aktivitet av nikotinreceptorerna i nervcellerna av intresse.

Skickligt utnyttjande av denna teknik möjliggör fin spatiotemporal kontroll av nikotinapplikation, vilket möjliggör spännande nya möjligheter för att studera kinetiken hos infödd nikotinreceptorengagemang, subcellulär lokalisering och modulering av neuronal aktivitet genom nikotinreceptoraktivering.