Name: isolation and culture of embryonic mouse neural stem cells
Uploaded: 2018-11-11T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Embryonic Mouse Neural Stem Cells at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af instituttets Royan.

Alle operationer og procedurer på dyret blev godkendt af Dyreetik Udvalget af instituttets Royan, Teheran, Iran.
1. forberedelse af kirurgiske instrumenter, vask Buffer (HEPES-MEM), celle Kulturmedier og celle kultur plader
<ol><li>Sterilisere de kirurgiske værktøjer (saks, skalpel kniv håndtag og pincet) ved autoklavering dem baseret på retningslinjerne for rutinemæssig sterilisation.</li>
	<li>Forberede et passende volumen af HEPES-MEM buffer (omkring 100 mL er nok til hver gravide m...

<ol>
	<li>Navarro Quiroz, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Signaling+in+Neuronal+Stem+Cells.">Cell Signaling in Neuronal Stem Cells.</a> Cells. 7 (7), (2018).</li><li>Choi, C. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Thrombin+Receptor+Restricts+Subventricular+Zone+Neural+Stem+Cell+Expansion+and+Differentiation.">The Thrombin Receptor Restricts Subventricular Zone Neural Stem Cell Expansion and Differentiation.</a> Scientific Reports. 8 (1), 9360 (2018).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+novel+rat+neural+progenitor+clone+that+expresses+Dlx+family+transcription+factors+and+gives+rise+to+functional+GABAergic+neurons+in+culture.">Isolation of a novel rat neural progenitor clone that expresses Dlx family transcription factors and gives rise to functional GABAergic neurons in culture.</a> Developmental Neurobiology. 72 (6), 805-820 (2012).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+phenotypically+diverse+neural+culture+from+hESC+by+combining+adherent+and+dissociation+methods.">Derivation of phenotypically diverse neural culture from hESC by combining adherent and dissociation methods.</a> Journal of Neuroscience Methods. , (2018).</li><li>Dhara, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+neural+progenitor+cells+derived+from+embryonic+stem+cells+in+feeder-free+cultures.">Human neural progenitor cells derived from embryonic stem cells in feeder-free cultures.</a> Differentiation. 76 (5), 454-464 (2008).</li><li>Aligholi, H., Hassanzadeh, G., Gorji, A., Azari, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Biopsy+Method+for+Isolating+Neural+Stem+Cells+from+the+Subventricular+Zone+of+the+Adult+Rat+Brain+for+Autologous+Transplantation+in+CNS+Injuries.">A Novel Biopsy Method for Isolating Neural Stem Cells from the Subventricular Zone of the Adult Rat Brain for Autologous Transplantation in CNS Injuries.</a> Methods in Molecular Biology. 1462, 711-731 (2016).</li><li>Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M., Ansari, S., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+embryonic+mouse+neural+stem+cell+culture+using+the+neurosphere+assay.">Establishing embryonic mouse neural stem cell culture using the neurosphere assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (47), (2011).</li><li>Ferrari, D., Binda, E., De Filippis, L., Vescovi, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+neural+stem+cells+from+neural+tissues+using+the+neurosphere+technique.">Isolation of neural stem cells from neural tissues using the neurosphere technique.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. , (2010).</li><li>Guo, W., Patzlaff, N. E., Jobe, E. M., Zhao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+multipotent+neural+stem+or+progenitor+cells+from+both+the+dentate+gyrus+and+subventricular+zone+of+a+single+adult+mouse.">Isolation of multipotent neural stem or progenitor cells from both the dentate gyrus and subventricular zone of a single adult mouse.</a> Nature Protocols. 7 (2012), (2005).</li><li>Liu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Passage+Number+is+a+Major+Contributor+to+Genomic+Structural+Variations+in+Mouse+iPSCs.">Passage Number is a Major Contributor to Genomic Structural Variations in Mouse iPSCs.</a> Stem Cells and Development. 32 (10), 2657-2667 (2014).</li><li>Diaferia, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+Chromosomal+Analysis+of+Cultured+Mouse+Neural+Stem+Cell+Lines.">Systematic Chromosomal Analysis of Cultured Mouse Neural Stem Cell Lines.</a> Stem Cells and Development. 20 (8), 1411-1423 (2011).</li><li>Hemmer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+Neural+Stem+Cells+Achieve+Long-Term+Survival+and+Functional+Integration+in+the+Adult+Mouse+Brain.">Induced Neural Stem Cells Achieve Long-Term Survival and Functional Integration in the Adult Mouse Brain.</a> Stem Cell Reports. 3 (3), 423-431 (2014).</li><li>Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+Cytometry+Protocols+for+Surface+and+Intracellular+Antigen+Analyses+of+Neural+Cell+Types.">Flow Cytometry Protocols for Surface and Intracellular Antigen Analyses of Neural Cell Types.</a> Journal of Visualized Experiments. (94), 52241 (2014).</li><li>Zhang, Z., Wang, Z., Rui, W., Wu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnesium+lithospermate+B+promotes+proliferation+and+differentiation+of+neural+stem+cells+in+vitro+and+enhances+neurogenesis+in+vivo.">Magnesium lithospermate B promotes proliferation and differentiation of neural stem cells in vitro and enhances neurogenesis in vivo.</a> Tissue and Cell. 53, 8-14 (2018).</li><li>Zilkha-Falb, R., Gurevich, M., Hanael, E., Achiron, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prickle1+as+positive+regulator+of+oligodendrocyte+differentiation.">Prickle1 as positive regulator of oligodendrocyte differentiation.</a> Neuroscience. 364, 107-121 (2017).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodendrocyte+differentiation+from+human+neural+stem+cells:+A+novel+role+for+c-Src.">Oligodendrocyte differentiation from human neural stem cells: A novel role for c-Src.</a> Neurochemistry International. 120, 21-32 (2018).</li><li>Palanisamy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxytocin+alters+cell+fate+selection+of+rat+neural+progenitor+cells+in+vitro.">Oxytocin alters cell fate selection of rat neural progenitor cells in vitro.</a> PLoS ONE. 13 (1), e0191160 (2018).</li><li>Llewellyn-Smith, I. J., Basbaum, A. I., Braz, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term,+dynamic+synaptic+reorganization+after+GABAergic+precursor+cell+transplantation+into+adult+mouse+spinal+cord.">Long-term, dynamic synaptic reorganization after GABAergic precursor cell transplantation into adult mouse spinal cord.</a> Journal of Comparative Neurology. 526 (3), 480-495 (2018).</li><li>Precious, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FoxP1+marks+medium+spiny+neurons+from+precursors+to+maturity+and+is+required+for+their+differentiation.">FoxP1 marks medium spiny neurons from precursors to maturity and is required for their differentiation.</a> Experimental Neurology. 282, 9-18 (2016).</li></ol>

Ved hjælp af en passende kilde til neurale stamceller er meget vigtigt for neuroforskere. Neurale stamceller kunne høstes fra forskellige områder af hjernen, embryo og de kan generere specifikke typer for neuroner og gliaceller. Der er flere metoder til induktion af differentiering af neurale stamceller at tilskynde dem til at generere modne neuroner og gliaceller. Der er talrige rapporter viser, at under specifikke dyrkningsbetingelserne og trofiske faktor regimenter, kunne de skabe neuroner14...

Neurale stamceller (NSCs) er bosat i forskellige regioner af hjernen, voksen og embryo og de har en tendens til at generere forskellige typer for neuroner og glial celler1. De subventricular zoner i voksne pattedyr hjerne2 og ganglionære eminence i embryo hjernen er NSC rige regioner3. I udvikle hjernen leverer ganglionære eminence de fleste af de kortikale interneurons og især GABAergic interneurons3. Der er også mindre invasive metoder til neurale stamceller generation fra embryonale stamceller (økonomiske) eller induceret pluripotente stamceller (iPSCs) at reducerer efterspørgslen efter dyre brug. Til trods for at generere NSCs fra europæiske sektorråd eller iPSCs er muligt4,5, har det nogle fordele og ulemper i forhold til isolering af neurale stamceller fra voksne eller embryo hjernen6,7, 8. Protokoller for inducere differentiering af økonomiske og sociale råd og iPSCs mod neuronal fænotyper er altid tid og omkostninger, tidskrævende og satsen for succes (70-80% Nestin positive celler)5 er lavere sammenlignet med direkte isolation af NSCs fra dyrs hjerne ( mere end 99% Nestin positive celler)9. Derudover mister stamceller deres genetiske stabilitet og differentiering tendens efter flere passager10,11. Selv om der er andre nye rapporter om direkte omdannelse af somatiske celler til NSCs, disse celler er genetisk manipuleret og er ikke let tilgængelige i hver lab12. Derfor er der stadig en stor efterspørgsel efter isolering af neurale stamceller fra animalske hjernen; Det er muligt at reducere mængden af animalske forbrug ved at forbedre de kirurgiske teknikker. Ved at reducere den kirurgiske tid og forbedre teknikkerne, er det muligt at holde cellerne fra skader og opnå den højeste sats af NSCs fra de enkelte dyr.
Her, indfører vi en forenklet og reproducerbare teknik til isolation af neurale stamceller fra musen E13 embryo hjernen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:942px;" width="941">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:389px;">15 mL tubes</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">Falcon</td>
			<td dir="LTR" style="width:235px;">352097</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:389px;">50 mL tubes</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">Falcon</td>
			<td dir="LTR">352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:389px;">Adson Forceps, 12 cm, Straight</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">WPI</td>
			<td dir="LTR">14226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:389px;">B27</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">Gibco</td>
			<td dir="LTR" style="width:235px;">17504-44</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:389px;">bFGF</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">Sigma</td>
			<td dir="LTR" style="width:235px;">F0291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:389px;">bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td style="width:235px;">A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;">dish 10cm&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">Falcon</td>
			<td dir="LTR" style="width:235px;">353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:389px;">Dressing Forceps, 12.5 cm, Straight</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">WPI</td>
			<td dir="LTR">15908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;">Dumont Tweezers, 11 cm, Straight</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">WPI</td>
			<td dir="LTR" style="width:235px;">500342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:389px;">EGF</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">Sigma</td>
			<td dir="LTR" style="width:235px;">E9644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;">Ethanol</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">Merck</td>
			<td dir="LTR" style="width:235px;">100983&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:389px;">Glutamate</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">Sigma&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:235px;">G3291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:389px;">Glutamax</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">Gibco</td>
			<td dir="LTR" style="width:235px;">35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:389px;">goat anti rabbit FITC conjugated secondary antibody</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td style="width:235px;">AP307F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:389px;">goat serum</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td style="width:235px;">G9023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;">Heparin&#160;&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">Sigma</td>
			<td dir="LTR" style="width:235px;">h3149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:389px;">HEPES</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">Sigma</td>
			<td dir="LTR" style="width:235px;">83264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:389px;">HEPES</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">Sigma</td>
			<td dir="LTR">90909C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;">insulinsyringe with 25-27 gauge Needle&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">SUPA medical</td>
			<td dir="LTR">A1SNL127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:389px;">laminin</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">sigma&#160;&#160;&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:235px;">L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td dir="LTR" height="26" style="height:26px;width:389px;">MEM</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">Sigma</td>
			<td dir="LTR" style="width:235px;">M2279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td dir="LTR" height="26" style="height:26px;width:389px;">N2 supplement</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">Gibco</td>
			<td dir="LTR" style="width:235px;">17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:389px;">NB medium</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">Gibco</td>
			<td dir="LTR" style="width:235px;">21103-31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:389px;">Non-essential amino acid (NEAA)</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">Gibco</td>
			<td dir="LTR" style="width:235px;">11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:389px;">PBS without Ca and Mg</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">Gibco</td>
			<td dir="LTR">20012050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:389px;">Penicilin/ Streptomycin</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">Gibco</td>
			<td dir="LTR" style="width:235px;">5140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:389px;">Poly-L-ornithine</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">Sigma</td>
			<td dir="LTR" style="width:235px;">&#160;P4957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:389px;">rabbit anti mouse beta tubulin-III antibody</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td style="width:235px;">T2200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:389px;">rabbit anti mouse GFAP antibody</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td style="width:235px;">G4546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:389px;">rabbit anti mouse Nestin antibody</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td style="width:235px;">N5413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:389px;">Scalpel Handle #3</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">WPI</td>
			<td dir="LTR">500236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;">Scissors curve</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">WPI</td>
			<td dir="LTR" style="width:235px;">14396</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:389px;">Scissors sharp straight</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">WPI</td>
			<td dir="LTR">14192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;">Soybean trypsin inhibitor</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">Roche</td>
			<td dir="LTR" style="width:235px;">10109886001&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;">Tissue culture flasks, T25</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">BD</td>
			<td dir="LTR" style="width:235px;">353014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;">Tissue culture flasks, T75</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">BD</td>
			<td dir="LTR" style="width:235px;">353024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:389px;">Tween 20</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td style="width:235px;">P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;">Vannas Scissors,&#160; 8 cm, Straight&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">WPI</td>
			<td>14003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:389px;">&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">Sigma</td>
			<td dir="LTR">M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and culture of embryonic mouse neural stem cells

Neurale stamceller (NSCs) er Multipotente og kan give anledning til de tre store celletyper i centralnervesystemet (CNS). In vitro kultur og udvidelse af NSCs giver en passende kilde til celler for neuroforskere at studere funktionen af neuroner og gliaceller sammen med deres interaktioner. Der er flere rapporteret teknikker til isolation af neurale stamceller fra voksne eller embryo pattedyr hjerner. Under den microsurgical drift at isolere NSCs fra forskellige regioner i den embryonale CNS, er det meget vigtigt at reducere skader på hjerneceller til at opnå det højeste forholdet mellem levende og udvidelige stamceller. En mulig teknik til stress reduktion under isolation af disse celler fra mus embryo hjernen er reduktion af kirurgisk tid. Her viser vi en udviklet teknik til hurtig isolation af disse celler fra E13 mus embryo ganglionære eminence. Kirurgiske procedurer omfatter høst E13 mus embryoner fra livmoderen, skære den frontale fontanelle af embryo med en bøjet nål tip, uddrager hjernen fra kraniet, microdissection af isolerede hjernen til at høste de ganglionære eminence, dissociation af den høstede væv i NSC medie til at få en enkelt cellesuspension, og endelig plating celler i suspension kultur til at generere neurospheres.

Mikro-dissektion, celle Isolation og Neurosphere kultur. Her præsenterede vi en hurtig og effektiv metode for musen E13 hjernen mikrokirurgi og isolation af neurale stamceller. Denne artikel viser, at det er muligt at fjerne hele hjernen fra en E13 mus embryo kraniet gennem en fin brud i frontal fontanelle. Med denne metode, hjernen lider mindre skade og det er muligt at isolere celler fra forskellige dele af hjernen. De høstede celler kunne genere...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Embryonic Mouse Neural Stem Cells at JoVE.com

Isolation and Culture of Embryonic Mouse Neural Stem Cells

Her introducerer vi en ny microsurgical teknik til isolering af neurale stamceller fra E13 mus embryo ganglionære eminence.

Isolation og kultur af embryonale mus neurale stamceller

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and ...

Formålet med denne video protokol er at etablere en kilde og effektiv protokol for Embryonic Mouse Neural Stem Cell Isolation og Kultur. Hej, jeg hedder Maryam Sadeghi-Zadeh. Jeg er student af cellulær og molekylær biologi på Royan Institute.I dag mig og min kollega ønsker at vise dig, hvordan du høster neurale stamceller fra 13 embryo mus ganglionic eminence. Hej, jeg er Bahareh Alizadeh-Shoorjestan. Jeg er masterstuderende for cellulær og molekylær biologi i Stamcelleafdelingen på Royan Institute for Biotechnology.Hej, jeg er Reza Dehghani-Varnamkhasti. Også jeg studerer cellulær og molekylær biologi i Royan Institute. Kirurgiske procedurer omfatter høst hver 13 mus embryoner fra livmoderen.Skæring forsiden af fontanel af embryo med en bøjet nål spids udvinding hjernen fra kraniet. Mikrodissektion af isoleret hjerne til at høste ganglionic eminence. Dissociation af det høstede væv i en neuralstamcelle medium for at få en enkelt celle suspension.Og endelig, plating celler i en suspension kultur til at generere nerveceller. Rengør og desinficerer huden på maven ved sprøjtning med 70 % ethanol. Kontroller huden opad maven og derefter skære huden og understregede ansigtsbehandling med en saks for at afdække bughulen og livmoderhorn.Uterinehorn, der indeholder embryonerne, fjernes med en saks, og de overføres til et 50 ml konisk rør med en 25 ml kold HEPES MEM-buffer. Placer det koniske rør under laminal flowhætten. Åbn hætten under kølerhjelmen.Bring livmoderhornene ud af røret, og skyl tre gange med nok volumen af den friske kolde HEPES MEM buffer til at fjerne snavs og blod. Uterinvævet overføres til en 10 cm petriskål indeholdende 7 til 10 ml kold HEPES MEM-buffer. Åbn livmoderhornene med en saks, og overfør embryoner til en ny skål, der indeholder 7 til 10 ml kold HEPES MEM-buffer.Læg nu 10 cm skålen med embryoner under det dissekerende mikroskop til mikrodissektion. Bøj spidsen af en sprøjtenål ved at skubbe spidsen på et håndtag til en stålskalpelkling. Bøj spidsen af nålen, indtil spidsen er bøjet i en vinkel på 70 til 90 grader.Kontroller spidsen af nålen under det dissekerende mikroskop for at se svinget på spidsen af nålen. Naturligvis embryoner har en lateral position i dette. Uden at ændre deres position, holdt halsen og kroppen af fosteret med fine scefæcen og derefter indsætte den bøjede del af nålen dybt ind i forsiden af fontanel af embryohovedet.Der ville være en lille blødning eller en blodprop der. Bevæg nålespidsen overfladisk, mens den bøjede del er inde i bulen mod panden og derefter mod bagsiden af hovedet. Sørg for at skære gennem huden og kraniet, og ikke at beskadige den underliggende hjerne.Skub huden med nålespidsen side om side for at afdække hjernen. Indsæt nålen fra sidesiden af huden til under rammen fra den laterale side af huden til området under hjernen. Og fjern derefter hjernen fra denne hovedbund ved at skubbe den til at komme ud fra det dissekerede kranium.Den ganglionic eminence er tydeligt vist i video med sine mediale og laterale dele. Holdt hjernen stabil ved hjælp af pleje scefængsler og derefter bruge microscissors at skære cortex af hver halvkugle til at afsløre ganglionic eminence. Holdt hjernen og sted dissekeret ganglionic eminence i 15 ml centrifuge rør, der indeholder neurale stamceller medier.Gentag denne procedure, indtil hele hjernen er blevet mikro-dissekeret. Skær dissekeret ganglionic eminence ved at placere pipette spidsen mod bunden af røret og pipette suspensionen op og ned i 2 5 gange for at bryde op vævet for at få en enkelt celle suspension. Centrifuge suspensionen ved 110 g i 5 minutter.Fjern supernatanten og opslæm cellerne igen i 1 ml 0,05% rør i EDTA. Inkuber cellesuspensionen i 37 grader Celsius i 10 minutter. Og derefter tilføje en tilsvarende mængde sojabønner trypsin hæmmer til at stoppe trypsin aktivitet.Pipette celle suspensionen op og ned for at sikre, at trypsin er blevet helt inaktiveret. Centrifuge celleaffjedringen ved 110 g i 5 minutter. Fjern supernatant og resuspend cellerne i 1 ml komplet neuralstamcellemedium og tælle antallet af celler.Plade cellerne på neurale stamceller medium i den passende størrelse væv kultur kolbe. 5 ml 2T25, 20 ml til T75 og 40 ml overføres til T175-kolber. Neurosfærer vises efter 3 dages kultur ved 37 grader Celsius i en befugtet inkubator med 5% CO2.At sutte kultur neurosfærer, overføre mediet med suspenderede neurosfærer til centrifugen til centrifuge ved 110 g i 5 minutter, og derefter kassere supernatant. Ved 1 ml 0,05% trypsin EDTA og inkuberes ved 37 grader Celsius i 10 minutter. Derefter inaktivere trypsin ved hjælp af sojben tyrpsin hæmmer og pipette neurosfærer forsigtigt op og ned for at gøre dem enkelte celler.Centrifuge celleaffjedringen ved 110 g i 5 minutter. Kassér supernatanten og resuspend cellerne i 1 ml neurale stamceller medium. Disse celler er klar til næste trin kultur eller kultur på laminat og fuldt belagt overflade til avancerede eksperimenter.Ved at dyrke en million primære neurale stamceller efter syv dage antallet af celler vil stige til tre til fire millioner. Efter seks til syv dage bør kuglerne måle mellem 150 og 200 mikrometer i diameter og vil være klar til subkultur på laminat poly ornithinbelagte retter i mangel af bFGF og EGF til neuronal differentiering. Flow cytometri assay resultater viser, at tæt på 95% af celler, der udgør neurosfærer var Nestin positive, som er en kendt markør for neurale stamceller.Assays ved hjælp af beta tubulin III og ganglio fibros protein antistoffer afslører, at ved at dyrke neurale stamceller på belagt overflade omkring 94% vist neuronal fænotype og omkring 5% viser glia fænotype. I netop denne korte video en lab teknik til hurtig isolering af neurale stamceller fra 13 mus embryo ganglionic eminence. Jeg håber du vil blive en succes i din neurale stamcellekultur.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life ...

Isolation and Culture of Neural Crest Stem Cells from Human Hair Follicles

Isolering og Kultur neuralkam stamceller fra menneskelige hårsække

Hair follicles undergo lifelong growth and hair cycle is a well-controlled process involving stem cell proliferation and quiescence. Hair bulge is a ...

Lectin-based Isolation and Culture of Mouse Embryonic Motoneurons

Spinal motoneurons develop towards postmitotic stages through early embryonic nervous system development and subsequently grow out dendrites and axons. ...

Isolation and Culture of Rat Embryonic Neural Cells: A Quick Protocol

Isolering og dyrkning af Rotte Embryonale Neurale Celler: En hurtig protokol

We are describing a quick method to dissociate and culture hippocampal or cortical neurons from E15-17 rat embryos. The procedure can be applied ...

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Ekspansion af embryoniske og voksne neurale stamceller ved<em&gt; In Utero</em&gt; Elektroporering eller viral stereotaktisk injektion

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

Isolering og dyrkning af neurale kamceller fra embryonale Murin Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

Isolering og dyrkning af endotelceller fra embryonale forebrain

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice

En mus, to kulturer: isolering og dyrkning af voksne neurale stamceller fra Two Neurogene zoner Individuel Mus

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult ...