Name: isolation and culture of embryonic mouse neural stem cells
Uploaded: 2018-11-11T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Embryonic Mouse Neural Stem Cells at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door het Instituut van Royan.

Alle chirurgische ingrepen en procedures op dier goedgekeurd door het dierenethiek Comité van het Instituut van Royan, Teheran, Iran.
1. bereiding van chirurgische instrumenten, wassen Buffer (HEPES-MEM), cel cultuurmedia en cel cultuur platen
<ol><li>Steriliseren de chirurgische instrumenten (schaar, scalpel blad handvat en forceps) in autoclaaf die hen gebaseerd op de richtsnoeren van de routine sterilisatie.</li>
	<li>Bereiden van een voldoende hoeveelheid HEPES-MEM buffer (ongeveer 100 ...

<ol>
	<li>Navarro Quiroz, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Signaling+in+Neuronal+Stem+Cells.">Cell Signaling in Neuronal Stem Cells.</a> Cells. 7 (7), (2018).</li><li>Choi, C. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Thrombin+Receptor+Restricts+Subventricular+Zone+Neural+Stem+Cell+Expansion+and+Differentiation.">The Thrombin Receptor Restricts Subventricular Zone Neural Stem Cell Expansion and Differentiation.</a> Scientific Reports. 8 (1), 9360 (2018).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+novel+rat+neural+progenitor+clone+that+expresses+Dlx+family+transcription+factors+and+gives+rise+to+functional+GABAergic+neurons+in+culture.">Isolation of a novel rat neural progenitor clone that expresses Dlx family transcription factors and gives rise to functional GABAergic neurons in culture.</a> Developmental Neurobiology. 72 (6), 805-820 (2012).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+phenotypically+diverse+neural+culture+from+hESC+by+combining+adherent+and+dissociation+methods.">Derivation of phenotypically diverse neural culture from hESC by combining adherent and dissociation methods.</a> Journal of Neuroscience Methods. , (2018).</li><li>Dhara, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+neural+progenitor+cells+derived+from+embryonic+stem+cells+in+feeder-free+cultures.">Human neural progenitor cells derived from embryonic stem cells in feeder-free cultures.</a> Differentiation. 76 (5), 454-464 (2008).</li><li>Aligholi, H., Hassanzadeh, G., Gorji, A., Azari, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Biopsy+Method+for+Isolating+Neural+Stem+Cells+from+the+Subventricular+Zone+of+the+Adult+Rat+Brain+for+Autologous+Transplantation+in+CNS+Injuries.">A Novel Biopsy Method for Isolating Neural Stem Cells from the Subventricular Zone of the Adult Rat Brain for Autologous Transplantation in CNS Injuries.</a> Methods in Molecular Biology. 1462, 711-731 (2016).</li><li>Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M., Ansari, S., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+embryonic+mouse+neural+stem+cell+culture+using+the+neurosphere+assay.">Establishing embryonic mouse neural stem cell culture using the neurosphere assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (47), (2011).</li><li>Ferrari, D., Binda, E., De Filippis, L., Vescovi, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+neural+stem+cells+from+neural+tissues+using+the+neurosphere+technique.">Isolation of neural stem cells from neural tissues using the neurosphere technique.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. , (2010).</li><li>Guo, W., Patzlaff, N. E., Jobe, E. M., Zhao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+multipotent+neural+stem+or+progenitor+cells+from+both+the+dentate+gyrus+and+subventricular+zone+of+a+single+adult+mouse.">Isolation of multipotent neural stem or progenitor cells from both the dentate gyrus and subventricular zone of a single adult mouse.</a> Nature Protocols. 7 (2012), (2005).</li><li>Liu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Passage+Number+is+a+Major+Contributor+to+Genomic+Structural+Variations+in+Mouse+iPSCs.">Passage Number is a Major Contributor to Genomic Structural Variations in Mouse iPSCs.</a> Stem Cells and Development. 32 (10), 2657-2667 (2014).</li><li>Diaferia, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+Chromosomal+Analysis+of+Cultured+Mouse+Neural+Stem+Cell+Lines.">Systematic Chromosomal Analysis of Cultured Mouse Neural Stem Cell Lines.</a> Stem Cells and Development. 20 (8), 1411-1423 (2011).</li><li>Hemmer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+Neural+Stem+Cells+Achieve+Long-Term+Survival+and+Functional+Integration+in+the+Adult+Mouse+Brain.">Induced Neural Stem Cells Achieve Long-Term Survival and Functional Integration in the Adult Mouse Brain.</a> Stem Cell Reports. 3 (3), 423-431 (2014).</li><li>Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+Cytometry+Protocols+for+Surface+and+Intracellular+Antigen+Analyses+of+Neural+Cell+Types.">Flow Cytometry Protocols for Surface and Intracellular Antigen Analyses of Neural Cell Types.</a> Journal of Visualized Experiments. (94), 52241 (2014).</li><li>Zhang, Z., Wang, Z., Rui, W., Wu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnesium+lithospermate+B+promotes+proliferation+and+differentiation+of+neural+stem+cells+in+vitro+and+enhances+neurogenesis+in+vivo.">Magnesium lithospermate B promotes proliferation and differentiation of neural stem cells in vitro and enhances neurogenesis in vivo.</a> Tissue and Cell. 53, 8-14 (2018).</li><li>Zilkha-Falb, R., Gurevich, M., Hanael, E., Achiron, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prickle1+as+positive+regulator+of+oligodendrocyte+differentiation.">Prickle1 as positive regulator of oligodendrocyte differentiation.</a> Neuroscience. 364, 107-121 (2017).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodendrocyte+differentiation+from+human+neural+stem+cells:+A+novel+role+for+c-Src.">Oligodendrocyte differentiation from human neural stem cells: A novel role for c-Src.</a> Neurochemistry International. 120, 21-32 (2018).</li><li>Palanisamy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxytocin+alters+cell+fate+selection+of+rat+neural+progenitor+cells+in+vitro.">Oxytocin alters cell fate selection of rat neural progenitor cells in vitro.</a> PLoS ONE. 13 (1), e0191160 (2018).</li><li>Llewellyn-Smith, I. J., Basbaum, A. I., Braz, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term,+dynamic+synaptic+reorganization+after+GABAergic+precursor+cell+transplantation+into+adult+mouse+spinal+cord.">Long-term, dynamic synaptic reorganization after GABAergic precursor cell transplantation into adult mouse spinal cord.</a> Journal of Comparative Neurology. 526 (3), 480-495 (2018).</li><li>Precious, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FoxP1+marks+medium+spiny+neurons+from+precursors+to+maturity+and+is+required+for+their+differentiation.">FoxP1 marks medium spiny neurons from precursors to maturity and is required for their differentiation.</a> Experimental Neurology. 282, 9-18 (2016).</li></ol>

Met behulp van een geschikte bron van neurale stamcellen is zeer belangrijk voor neurowetenschappers. Neurale stamcellen kan worden geoogst uit verschillende gebieden van de hersenen van embryo en ze kunnen het genereren van specifieke soorten zenuwcellen en gliacellen. Er zijn verschillende methoden voor de inductie van differentiatie van neurale stamcellen voor het opwekken van hen voor het genereren van volwassen zenuwcellen en gliacellen. Er zijn talrijke rapporten die aangeeft dat zij onder de voorwaarden van de spe...

Neurale stamcellen (NSCs) bevinden zich in verschillende regio's van de volwassene en embryo hersenen en ze hebben de neiging om het genereren van verschillende soorten neuronen en gliale cel1. De subventriculaire zones in de volwassen zoogdieren hersenen2 en ganglionaire eminentie in de hersenen embryo zijn NSC rijke regio's3. In de ontwikkelende hersenen levert de ganglionaire eminentie allermeest naar de corticale interneuronen en met name GABAergic interneuronen3. Er zijn ook minder invasieve methoden voor neurale stamcellen generatie vanaf embryonale stamcellen (SER's) of geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) die het verminderen van de vraag naar dier gebruiken. Ondanks het feit dat het genereren van NSCs van sociaal-economische raden of iPSCs mogelijk4,5 is, heeft het een aantal voordelen en nadelen vergeleken met het isolement van neurale stamcellen uit de volwassen of embryonale hersenen6,7, 8. De protocollen voor de differentiatie van SER's en iPSCs richting neuronale fenotypen inducerende zijn altijd tijd en kosten consumeren en het tarief van succes (70-80% Nestin positieve cellen)5 is lager in vergelijking met de directe isolatie van NSCs uit de dierlijke hersenen ( meer dan 99% Nestin positieve cellen)9. Bovendien verliezen stamcellen hun genetische stabiliteit en differentiatie neiging na verscheidene passages10,11. Hoewel er andere nieuwe rapporten over directe omzetting van somatische cellen in NSCs, deze cellen zijn genetisch gemanipuleerde en zijn niet gemakkelijk toegankelijk in elk lab12. Daarom, is er nog steeds een grote vraag voor isolatie van neurale stamcellen van de dierlijke hersenen; het is mogelijk om het verminderen van de hoeveelheid dierlijke gebruik door het verbeteren van de chirurgische technieken. Door verkorting van de chirurgische en verbetering van de technieken, is het mogelijk om te houden van de cellen uit de buurt van schade en het hoogste percentage van NSCs te verkrijgen van elk dier.
Hier introduceren we een vereenvoudigde en reproduceerbare techniek voor isolatie van neurale stamcellen van muis E13 embryo hersenen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:942px;" width="941">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:389px;">15 mL tubes</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">Falcon</td>
			<td dir="LTR" style="width:235px;">352097</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:389px;">50 mL tubes</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">Falcon</td>
			<td dir="LTR">352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:389px;">Adson Forceps, 12 cm, Straight</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">WPI</td>
			<td dir="LTR">14226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:389px;">B27</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">Gibco</td>
			<td dir="LTR" style="width:235px;">17504-44</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:389px;">bFGF</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">Sigma</td>
			<td dir="LTR" style="width:235px;">F0291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:389px;">bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td style="width:235px;">A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;">dish 10cm&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">Falcon</td>
			<td dir="LTR" style="width:235px;">353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:389px;">Dressing Forceps, 12.5 cm, Straight</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">WPI</td>
			<td dir="LTR">15908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;">Dumont Tweezers, 11 cm, Straight</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">WPI</td>
			<td dir="LTR" style="width:235px;">500342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:389px;">EGF</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">Sigma</td>
			<td dir="LTR" style="width:235px;">E9644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;">Ethanol</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">Merck</td>
			<td dir="LTR" style="width:235px;">100983&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:389px;">Glutamate</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">Sigma&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:235px;">G3291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:389px;">Glutamax</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">Gibco</td>
			<td dir="LTR" style="width:235px;">35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:389px;">goat anti rabbit FITC conjugated secondary antibody</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td style="width:235px;">AP307F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:389px;">goat serum</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td style="width:235px;">G9023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;">Heparin&#160;&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">Sigma</td>
			<td dir="LTR" style="width:235px;">h3149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:389px;">HEPES</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">Sigma</td>
			<td dir="LTR" style="width:235px;">83264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:389px;">HEPES</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">Sigma</td>
			<td dir="LTR">90909C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;">insulinsyringe with 25-27 gauge Needle&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">SUPA medical</td>
			<td dir="LTR">A1SNL127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:389px;">laminin</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">sigma&#160;&#160;&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:235px;">L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td dir="LTR" height="26" style="height:26px;width:389px;">MEM</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">Sigma</td>
			<td dir="LTR" style="width:235px;">M2279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td dir="LTR" height="26" style="height:26px;width:389px;">N2 supplement</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">Gibco</td>
			<td dir="LTR" style="width:235px;">17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:389px;">NB medium</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">Gibco</td>
			<td dir="LTR" style="width:235px;">21103-31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:389px;">Non-essential amino acid (NEAA)</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">Gibco</td>
			<td dir="LTR" style="width:235px;">11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:389px;">PBS without Ca and Mg</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">Gibco</td>
			<td dir="LTR">20012050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:389px;">Penicilin/ Streptomycin</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">Gibco</td>
			<td dir="LTR" style="width:235px;">5140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:389px;">Poly-L-ornithine</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">Sigma</td>
			<td dir="LTR" style="width:235px;">&#160;P4957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:389px;">rabbit anti mouse beta tubulin-III antibody</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td style="width:235px;">T2200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:389px;">rabbit anti mouse GFAP antibody</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td style="width:235px;">G4546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:389px;">rabbit anti mouse Nestin antibody</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td style="width:235px;">N5413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:389px;">Scalpel Handle #3</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">WPI</td>
			<td dir="LTR">500236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;">Scissors curve</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">WPI</td>
			<td dir="LTR" style="width:235px;">14396</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:389px;">Scissors sharp straight</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">WPI</td>
			<td dir="LTR">14192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;">Soybean trypsin inhibitor</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">Roche</td>
			<td dir="LTR" style="width:235px;">10109886001&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;">Tissue culture flasks, T25</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">BD</td>
			<td dir="LTR" style="width:235px;">353014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;">Tissue culture flasks, T75</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">BD</td>
			<td dir="LTR" style="width:235px;">353024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:389px;">Tween 20</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td style="width:235px;">P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;">Vannas Scissors,&#160; 8 cm, Straight&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">WPI</td>
			<td>14003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:389px;">&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">Sigma</td>
			<td dir="LTR">M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and culture of embryonic mouse neural stem cells

Neurale stamcellen (NSCs) zijn multipotente en aanleiding kunnen geven tot de drie grote celtypes van het centrale zenuwstelsel (CNS). In vitro cultuur en uitbreiding van de NSCs zorgen voor een geschikte bron van cellen voor neurowetenschappers te bestuderen van de functie van neuronen en gliale cellen samen met hun interacties. Er zijn verschillende gerapporteerde technieken voor de isolatie van neurale stamcellen uit volwassen of embryonale zoogdieren hersenen. Tijdens de microchirurgische operatie te isoleren NSCs uit verschillende regio's van de embryonale CNS, is het zeer belangrijk ter beperking van de schade aan de hersencellen te verkrijgen van de hoogste verhouding van live en uitbreidbaar stamcellen. Een mogelijke techniek voor spanningsvermindering tijdens isolatie van deze cellen uit de hersenen van muis embryonale is de vermindering van de chirurgische tijd. Hier tonen wij een ontwikkelde techniek voor snelle isolatie van deze cellen van de E13 muis embryo ganglionaire eminentie. Chirurgische procedures omvatten E13 muis embryo's uit de baarmoeder, snijden de frontale fontanelle van het embryo met een gebogen naald tip, het uitpakken van de hersenen van de schedel, de microdissection van de geïsoleerde hersenen om te oogsten van de ganglionaire eminentie, oogsten dissociatie van het geoogste weefsel op NSC middellange tot het krijgen van een enkele celsuspensie, en ten slotte plating cellen in schorsing cultuur voor het genereren van neurospheres.

Micro-dissectie, cel isolatie en Neurosphere cultuur. Hier voorgesteld hebben we een snelle en efficiënte methode voor muis E13 hersenen microchirurgie en isolatie van neurale stamcellen. Dit artikel toont dat het mogelijk is om het hele brein van een muis voor E13 met de schedel embryo door middel van een mooie breuk in de frontale fontanelle is. Met deze methode de hersenen verdraagt minder schade en het is mogelijk om te isoleren van cellen uit v...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Embryonic Mouse Neural Stem Cells at JoVE.com

Isolation and Culture of Embryonic Mouse Neural Stem Cells

Hier introduceren wij een nieuwe microchirurgische techniek voor de isolatie van neurale stamcellen uit de E13 muis embryo ganglionaire eminentie.

Isolatie en cultuur van muis embryonale neurale stamcellen

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and ...

Het doel van dit videoprotocol is het vaststellen van een bron en efficiënt protocol voor embryonale muis neurale stamcelisolatie en -cultuur. Hallo, ik ben Maryam Sadeghi-Zadeh. Ik ben een master student cellulaire en moleculaire biologie in Royan Institute.Vandaag willen ik en mijn collega je laten zien hoe je neurale stamcel oogsten van 13 embryomuis ganglionic eminentie. Hallo, ik ben Bahareh Alizadeh-Shoorjestan. Ik ben een master student voor cellulaire en moleculaire biologie in de stemcel afdeling van Royan Instituut voor Biotechnologie.Hallo, ik ben Reza Dehghani-Varnamkhasti. Ook studeer ik cellulaire en moleculaire biologie aan het Royan Instituut. Chirurgische ingrepen omvatten het oogsten van elke 13 muisembryo's uit de baarmoeder.Het snijden van de voorkant van fontanel van embryo met een gebogen naald tip het extraheren van de hersenen uit de schedel. Micro-dissectie van geïsoleerde hersenen om de ganglionic eminentie te oogsten. Dissociatie van het geoogste weefsel in een neurale stamcel medium om een enkele cel suspensie te krijgen.En tenslotte, plating cellen in een suspensie cultuur om zenuwcellen te genereren. Reinig en ontsmettingsmiddel de huid van de buik gebied door te spuiten met 70%ethanol. Controle van de huid omhoog buik en snijd vervolgens de huid en onderstreept gezicht met een schaar om buikholte en baarmoeder hoorns te ontdekken.Verwijder de baarmoederhoorns die de embryo's met een schaar bevatten en breng ze over in een conische buis van 50 ml met een koude HEPES MEM-buffer van 25 ml. Plaats de conische buis onder de laminale stroomkap. Open de dop onder de motorkap.Haal de baarmoederhoorns uit de buis en spoel drie keer met voldoende volume van de verse koude HEPES MEM-buffer om vuil en bloed te elimineren. Breng het baarmoederweefsel over in een petrischaal van 10 cm met een koude HEPES MEM-buffer van 7 tot 10 ml. Open de baarmoederhoorns met een fijne schaar en breng embryo's over naar een nieuw gerecht met een koude HEPES MEM-buffer van 7 tot 10 ml.Zet nu de 10 cm schotel met embryo's onder de ontledenmicroscoop voor micro-dissectie operatie. Buig de punt van een spuitnaald door zijn punt op een stalen scalpel mesgreep te duwen. Buig de punt van de naald tot de punt is gebogen onder een hoek van 70 tot 90 graden.Controleer de punt van de naald onder de ontledenmicroscoop om de bocht aan de punt van de naald te zien. Natuurlijk hebben embryo's hierin een zijdelingse positie. Zonder hun positie te veranderen, hield de hals en het lichaam van het embryo met fijne tangen en vervolgens het gebogen deel van de naald diep in de voorkant van de fontanel van het embryohoofd.Er zou een kleine bloeding of een bloedstolsel zijn. Beweeg de naald tip oppervlakkig, terwijl het gebogen deel is in de uitstulping in de richting van het voorhoofd en vervolgens naar de achterkant van het hoofd. Zorg ervoor dat u door de huid en de schedel snijdt en de onderliggende hersenen niet beschadigt.Duw de huid met de naald tip zijwaarts om de hersenen te ontdekken. Steek de naald van zijdelingse kant van de huid aan de onder het frame van de zijkant van de huid naar het gebied onder de hersenen. En verwijder dan de hersenen van deze hoofdhuid door het te duwen om uit de ontleedschedel te komen.De ganglionic eminentie wordt duidelijk getoond in video met zijn mediale en zijdelen. Hield de hersenen stabiel met behulp van de zorg tangen en vervolgens met behulp van microscissors om de cortex van elk halfrond te snijden om de ganglionic eminentie bloot. Hield de hersenen en plaats ontleed ganglionic eminentie in de 15 ml centrifuge buis met neurale stamcel media.Herhaal deze procedure totdat alle hersenen zijn micro-ontleed. Snijd ontleed ganglionic eminentie door het plaatsen van de pipet tip tegen de onderkant van de buis en pipette de schorsing op en neer voor 2 5 keer op te breken van het weefsel om een enkele cel schorsing te krijgen. Centrifuge de vering op 110 g gedurende 5 minuten.Verwijder de supernatant en resuspend de cellen in 1 ml van 0,05%buis in EDTA. Incubeer de celsuspensie in een 37 graden Celsius gedurende 10 minuten. En voeg dan een gelijkwaardig volume van soja-trypsin remmer om trypsine activiteit te stoppen.Pipette de celopening op en neer om ervoor te zorgen dat de trypsine volledig is geïnactiveerd. Centrifuge de celsuspensie op 110 g gedurende 5 minuten. Verwijder de supernatant en resuspend de cellen in 1 ml van volledige neurale stamcel medium en tellen het aantal cellen.Plaat de cellen op neurale stamcel medium in de geschikte grootte weefsel cultuur fles. Breng 5 ml 2T25, 20 ml naar T75 en 40 ml over op T175-kolven. Neurosferen verschijnen na 3 dagen cultuur bij 37 graden Celsius in een bevochtigde couveuse met 5% CO2.Om cultuur de neurosferen te zuigen, breng het medium met zwevende neurosferen naar de centrifuge om 5 minuten op 110 g te centrifugeren en gooi je de supernatant weg. Bij 1 ml van 0,05% trypsin EDTA en incubeer bij 37 graden Celsius gedurende 10 minuten. Dan inactiveren de trypsine met behulp van sojaben tyrpsin remmer en pipet de neurosferen zachtjes op en neer om ze enkele cellen.Centrifuge de celsuspensie op 110 g gedurende 5 minuten. Gooi de supernatant weg en verhoog de cellen in 1 ml neurale stamcellen medium. Deze cellen zijn klaar voor de volgende stap cultuur of cultuur op laminaat en volledig gecoat oppervlak voor geavanceerde experimenten.Door het cultiveren van een miljoen primaire neurale stamcellen na zeven dagen het aantal cellen zal toenemen tot drie tot vier miljoen. Na zes tot zeven dagen moeten de bollen tussen de 150 en 200 micrometer in diameter meten en klaar zijn voor subcultuur op laminaat poly ornithine gecoate gerechten bij afwezigheid van bFGF en EFGF voor neuronale differentiatie. Flow cytometrie test resultaten tonen aan dat in de buurt van 95% van de cellen die de neurosferen waren Nestin positief, dat is een bekende marker voor neurale stamcellen.Tests met behulp van beta tubuline III en ganglio vezelige eiwit antilichamen blijkt dat door het cultiveren van neurale stamcellen op gecoate oppervlak ongeveer 94%aangetoond neuronale fenotype en ongeveer 5%tonen glia fenotype. In deze korte video een lab techniek voor snelle isolatie van neurale stamcel van 13 muis embryo ganglionic eminentie. Ik hoop dat je succes zult hebben in je neurale stamcelcultuur.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Dissectie en Cultuur van Commissural neuronen van het ruggenmerg Embryonic

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

Isolatie en uitbreiding van de volwassen muis neurale stamcellen Met behulp van de Neurosphere Assay

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay

Tot vaststelling van Embryonale Mouse Neural Stem Cell Culture Met behulp van de Neurosphere Assay

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life ...

Isolation and Culture of Neural Crest Stem Cells from Human Hair Follicles

Isolatie en Cultuur van neurale stamcellen uit menselijke haarzakjes

Hair follicles undergo lifelong growth and hair cycle is a well-controlled process involving stem cell proliferation and quiescence. Hair bulge is a ...

Lectin-based Isolation and Culture of Mouse Embryonic Motoneurons

Lectine-based Isolatie en cultuur van de muis embryonale motoneuronen

Spinal motoneurons develop towards postmitotic stages through early embryonic nervous system development and subsequently grow out dendrites and axons. ...

Isolation and Culture of Rat Embryonic Neural Cells: A Quick Protocol

Isolatie en Cultuur van Rat Embryonale neurale cellen: een Quick-protocol

We are describing a quick method to dissociate and culture hippocampal or cortical neurons from E15-17 rat embryos. The procedure can be applied ...

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Uitbreiding van embryonale en adulte neurale stamcellen door<em&gt; In Utero</em&gt; Electroporation of Viral stereotactische injectie

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

Isolatie en Cultuur van neurale lijst cellen van embryonale Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

Isolatie en Cultuur van de endotheelcellen van de embryonale voorhersenen

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice

Een muis, twee culturen: Isolatie en Cultuur van adulte neurale stamcellen uit de Twee Neurogeen Zones van individuele muizen

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult ...