Name: isolation and culture of embryonic mouse neural stem cells
Uploaded: 2018-11-11T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Embryonic Mouse Neural Stem Cells at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי המכון Royan.

כל ניתוחים ופרוצדורות על בעלי חיים אושרו על ידי ועדת האתיקה בעלי חיים של מכון Royan, טהראן, איראן.
1. הכנת מכשירי ניתוח שוטף מאגר (HEPES-מ), תא תרבות המדיה וצלחות תרבות תא
<ol><li>לחטא כלים כירורגיים (מספריים, סכין להב ידית ומלקחיים) על ידי autoclaving שאותם בהתבסס על הקווים המנחים עיקור שגר?...

<ol>
	<li>Navarro Quiroz, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Signaling+in+Neuronal+Stem+Cells.">Cell Signaling in Neuronal Stem Cells.</a> Cells. 7 (7), (2018).</li><li>Choi, C. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Thrombin+Receptor+Restricts+Subventricular+Zone+Neural+Stem+Cell+Expansion+and+Differentiation.">The Thrombin Receptor Restricts Subventricular Zone Neural Stem Cell Expansion and Differentiation.</a> Scientific Reports. 8 (1), 9360 (2018).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+novel+rat+neural+progenitor+clone+that+expresses+Dlx+family+transcription+factors+and+gives+rise+to+functional+GABAergic+neurons+in+culture.">Isolation of a novel rat neural progenitor clone that expresses Dlx family transcription factors and gives rise to functional GABAergic neurons in culture.</a> Developmental Neurobiology. 72 (6), 805-820 (2012).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+phenotypically+diverse+neural+culture+from+hESC+by+combining+adherent+and+dissociation+methods.">Derivation of phenotypically diverse neural culture from hESC by combining adherent and dissociation methods.</a> Journal of Neuroscience Methods. , (2018).</li><li>Dhara, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+neural+progenitor+cells+derived+from+embryonic+stem+cells+in+feeder-free+cultures.">Human neural progenitor cells derived from embryonic stem cells in feeder-free cultures.</a> Differentiation. 76 (5), 454-464 (2008).</li><li>Aligholi, H., Hassanzadeh, G., Gorji, A., Azari, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Biopsy+Method+for+Isolating+Neural+Stem+Cells+from+the+Subventricular+Zone+of+the+Adult+Rat+Brain+for+Autologous+Transplantation+in+CNS+Injuries.">A Novel Biopsy Method for Isolating Neural Stem Cells from the Subventricular Zone of the Adult Rat Brain for Autologous Transplantation in CNS Injuries.</a> Methods in Molecular Biology. 1462, 711-731 (2016).</li><li>Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M., Ansari, S., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+embryonic+mouse+neural+stem+cell+culture+using+the+neurosphere+assay.">Establishing embryonic mouse neural stem cell culture using the neurosphere assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (47), (2011).</li><li>Ferrari, D., Binda, E., De Filippis, L., Vescovi, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+neural+stem+cells+from+neural+tissues+using+the+neurosphere+technique.">Isolation of neural stem cells from neural tissues using the neurosphere technique.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. , (2010).</li><li>Guo, W., Patzlaff, N. E., Jobe, E. M., Zhao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+multipotent+neural+stem+or+progenitor+cells+from+both+the+dentate+gyrus+and+subventricular+zone+of+a+single+adult+mouse.">Isolation of multipotent neural stem or progenitor cells from both the dentate gyrus and subventricular zone of a single adult mouse.</a> Nature Protocols. 7 (2012), (2005).</li><li>Liu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Passage+Number+is+a+Major+Contributor+to+Genomic+Structural+Variations+in+Mouse+iPSCs.">Passage Number is a Major Contributor to Genomic Structural Variations in Mouse iPSCs.</a> Stem Cells and Development. 32 (10), 2657-2667 (2014).</li><li>Diaferia, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+Chromosomal+Analysis+of+Cultured+Mouse+Neural+Stem+Cell+Lines.">Systematic Chromosomal Analysis of Cultured Mouse Neural Stem Cell Lines.</a> Stem Cells and Development. 20 (8), 1411-1423 (2011).</li><li>Hemmer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+Neural+Stem+Cells+Achieve+Long-Term+Survival+and+Functional+Integration+in+the+Adult+Mouse+Brain.">Induced Neural Stem Cells Achieve Long-Term Survival and Functional Integration in the Adult Mouse Brain.</a> Stem Cell Reports. 3 (3), 423-431 (2014).</li><li>Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+Cytometry+Protocols+for+Surface+and+Intracellular+Antigen+Analyses+of+Neural+Cell+Types.">Flow Cytometry Protocols for Surface and Intracellular Antigen Analyses of Neural Cell Types.</a> Journal of Visualized Experiments. (94), 52241 (2014).</li><li>Zhang, Z., Wang, Z., Rui, W., Wu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnesium+lithospermate+B+promotes+proliferation+and+differentiation+of+neural+stem+cells+in+vitro+and+enhances+neurogenesis+in+vivo.">Magnesium lithospermate B promotes proliferation and differentiation of neural stem cells in vitro and enhances neurogenesis in vivo.</a> Tissue and Cell. 53, 8-14 (2018).</li><li>Zilkha-Falb, R., Gurevich, M., Hanael, E., Achiron, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prickle1+as+positive+regulator+of+oligodendrocyte+differentiation.">Prickle1 as positive regulator of oligodendrocyte differentiation.</a> Neuroscience. 364, 107-121 (2017).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodendrocyte+differentiation+from+human+neural+stem+cells:+A+novel+role+for+c-Src.">Oligodendrocyte differentiation from human neural stem cells: A novel role for c-Src.</a> Neurochemistry International. 120, 21-32 (2018).</li><li>Palanisamy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxytocin+alters+cell+fate+selection+of+rat+neural+progenitor+cells+in+vitro.">Oxytocin alters cell fate selection of rat neural progenitor cells in vitro.</a> PLoS ONE. 13 (1), e0191160 (2018).</li><li>Llewellyn-Smith, I. J., Basbaum, A. I., Braz, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term,+dynamic+synaptic+reorganization+after+GABAergic+precursor+cell+transplantation+into+adult+mouse+spinal+cord.">Long-term, dynamic synaptic reorganization after GABAergic precursor cell transplantation into adult mouse spinal cord.</a> Journal of Comparative Neurology. 526 (3), 480-495 (2018).</li><li>Precious, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FoxP1+marks+medium+spiny+neurons+from+precursors+to+maturity+and+is+required+for+their+differentiation.">FoxP1 marks medium spiny neurons from precursors to maturity and is required for their differentiation.</a> Experimental Neurology. 282, 9-18 (2016).</li></ol>

היא מאוד חשוב עבור מדעני מוח בעזרת מקור מתאים של תאי גזע עצביים. תאי גזע עצביים יכול להיות שנקטפו מאזורים שונים במוח העובר, הם יכולים ליצור סוגים ספציפיים של נוירונים ותאי גלייה. ישנן מספר שיטות אינדוקציה של ההתמיינות של תאי גזע עצביים כדי לגרום להם לייצר נוירונים בוגרים ותאי גלייה. ישנם ד?...

תאי גזע עצביים (NSCs) מתגוררים באזורים שונים של המוח מבוגר ואת העובר, ויש להם נטייה ליצור סוגים שונים של נוירונים, תאי גליה1. האזורים subventricular המוח יונקים בוגרים2 קדושתו ganglionic במוח העובר לבטחון לאומי אזורים עשירים3בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד. במוח המתפתח, מספק קדושתו ganglionic רוב interneurons קורטיקלית במיוחד GABAergic interneurons3. יש גם שיטות פולשניות פחות לייצור תאי גזע עצביים מתאי גזע עובריים (ESCs) או להשתמש בתאי גזע pluripotent מושרה (iPSCs) להפחית את הביקוש חיה. למרות העובדה כי יצירת NSCs ESCs או iPSCs הוא אפשרי4,5, זה יש כמה יתרונות וחסרונות לעומת הבידוד של תאי גזע עצביים מבוגר או העובר המוח6,7, 8. הפרוטוקולים עבור גרימת את הבידול של ESCs ו- iPSCs לכיוון פנוטיפים עצביים הם תמיד זמן ועלות לצרוך, הקצב של הצלחה (70-80% Nestin חיובי תאים)5 מושווה נמוך עם בידוד ישיר של NSCs מ (החייתי במוח יותר מ-99% Nestin חיובי תאים)9. יתר על כן, תאי גזע לאבד את נטייתם הגנטית של יציבות ובידול אחרי קטעים מספר10,11. למרות שישנם דיווחים חדשים אחרים על המרה ישירה של תאים סומטיים לתוך NSCs, תאים אלה הם מהונדסים גנטית והם אינם נגישים בקלות בכל מעבדה12. לכן, עדיין יש ביקוש גדול עבור בידוד של תאי גזע עצביים מהמוח בעלי חיים; זה אפשרי לצמצם את כמות השימוש בבעלי חיים על ידי שיפור טכניקות כירורגיות. על-ידי הפחתת זמן ניתוח ושיפור הטכניקות, זה אפשרי לשמור תאים מן הנזק ולקבל שיעור הגבוה ביותר של NSCs של כל בעל חיים.
כאן, אנחנו מציגים טכניקה פשוטה and לשחזור עבור בידוד של תאי גזע עצביים של מוח העובר13 העכבר E.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:942px;" width="941">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:389px;">15 mL tubes</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">Falcon</td>
			<td dir="LTR" style="width:235px;">352097</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:389px;">50 mL tubes</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">Falcon</td>
			<td dir="LTR">352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:389px;">Adson Forceps, 12 cm, Straight</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">WPI</td>
			<td dir="LTR">14226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:389px;">B27</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">Gibco</td>
			<td dir="LTR" style="width:235px;">17504-44</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:389px;">bFGF</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">Sigma</td>
			<td dir="LTR" style="width:235px;">F0291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:389px;">bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td style="width:235px;">A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;">dish 10cm&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">Falcon</td>
			<td dir="LTR" style="width:235px;">353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:389px;">Dressing Forceps, 12.5 cm, Straight</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">WPI</td>
			<td dir="LTR">15908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;">Dumont Tweezers, 11 cm, Straight</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">WPI</td>
			<td dir="LTR" style="width:235px;">500342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:389px;">EGF</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">Sigma</td>
			<td dir="LTR" style="width:235px;">E9644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;">Ethanol</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">Merck</td>
			<td dir="LTR" style="width:235px;">100983&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:389px;">Glutamate</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">Sigma&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:235px;">G3291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:389px;">Glutamax</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">Gibco</td>
			<td dir="LTR" style="width:235px;">35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:389px;">goat anti rabbit FITC conjugated secondary antibody</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td style="width:235px;">AP307F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:389px;">goat serum</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td style="width:235px;">G9023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;">Heparin&#160;&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">Sigma</td>
			<td dir="LTR" style="width:235px;">h3149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:389px;">HEPES</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">Sigma</td>
			<td dir="LTR" style="width:235px;">83264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:389px;">HEPES</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">Sigma</td>
			<td dir="LTR">90909C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;">insulinsyringe with 25-27 gauge Needle&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">SUPA medical</td>
			<td dir="LTR">A1SNL127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:389px;">laminin</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">sigma&#160;&#160;&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:235px;">L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td dir="LTR" height="26" style="height:26px;width:389px;">MEM</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">Sigma</td>
			<td dir="LTR" style="width:235px;">M2279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td dir="LTR" height="26" style="height:26px;width:389px;">N2 supplement</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">Gibco</td>
			<td dir="LTR" style="width:235px;">17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:389px;">NB medium</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">Gibco</td>
			<td dir="LTR" style="width:235px;">21103-31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:389px;">Non-essential amino acid (NEAA)</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">Gibco</td>
			<td dir="LTR" style="width:235px;">11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:389px;">PBS without Ca and Mg</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">Gibco</td>
			<td dir="LTR">20012050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:389px;">Penicilin/ Streptomycin</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">Gibco</td>
			<td dir="LTR" style="width:235px;">5140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:389px;">Poly-L-ornithine</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">Sigma</td>
			<td dir="LTR" style="width:235px;">&#160;P4957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:389px;">rabbit anti mouse beta tubulin-III antibody</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td style="width:235px;">T2200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:389px;">rabbit anti mouse GFAP antibody</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td style="width:235px;">G4546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:389px;">rabbit anti mouse Nestin antibody</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td style="width:235px;">N5413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:389px;">Scalpel Handle #3</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">WPI</td>
			<td dir="LTR">500236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;">Scissors curve</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">WPI</td>
			<td dir="LTR" style="width:235px;">14396</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:389px;">Scissors sharp straight</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">WPI</td>
			<td dir="LTR">14192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;">Soybean trypsin inhibitor</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">Roche</td>
			<td dir="LTR" style="width:235px;">10109886001&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;">Tissue culture flasks, T25</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">BD</td>
			<td dir="LTR" style="width:235px;">353014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;">Tissue culture flasks, T75</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">BD</td>
			<td dir="LTR" style="width:235px;">353024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:389px;">Tween 20</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td style="width:235px;">P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;">Vannas Scissors,&#160; 8 cm, Straight&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">WPI</td>
			<td>14003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:389px;">&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">Sigma</td>
			<td dir="LTR">M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and culture of embryonic mouse neural stem cells

תאי גזע עצביים (NSCs) multipotent, יכולים להצמיח שלושת הסוגים התא העיקריים של מערכת העצבים המרכזית (CNS). In vitro לקשרי תרבות והרחבה של NSCs מספקים מקור מתאים של תאים עבור מדעני מוח ללמוד את הפונקציה של נוירונים ותאי גלייה יחד עם האינטראקציות שלהם. ישנן מספר טכניקות שדווחו על בידודו של תאי גזע עצביים של המוח בתרבית של מבוגר או העובר. במהלך פעולת המיקרוכירורגית לבודד NSCs מאזורים שונים של מערכת העצבים עובריים, חשוב מאוד לצמצם את הנזק לתאי המוח כדי לקבל את היחס הגבוה של תאי גזע בשידור חי וניתן להרחבה. טכניקה אפשרית להפחתת מתח במהלך בידוד התאים האלה מהמוח העובר העכבר הוא צמצום זמן כירורגי. . הנה, נדגים טכניקה שפותחה עבור בידוד מהיר של תאים אלה מן E13 העכבר עובר ganglionic קדושתו. ניתוחים כוללות קצירת E13 העכבר העוברים מן הרחם, חותכים את פונטאנלה חזיתית של העובר עם טיפ המחט בנט, חילוץ במוח הגולגולת, microdissection של המוח מבודדים לקצור את קדושתו ganglionic, דיסוציאציה של הרקמה שנקטפו במדיום לבטחון לאומי כדי לקבל השעיה תא בודד, ולבסוף תאי ציפוי בתרבות ההשעיה ליצירת neurospheres.

ניתוח מיקרו, בידוד תא ותרבות Neurosphere. כאן, אנו הציג שיטה מהירה ויעילה העכבר E13 המוח למיקרו ובידוד של תאי גזע עצביים. מאמר זה מראה שזה אפשרי להסיר את כל המוח גולגולת העובר E העכבר13 דרך קרע בסדר ב פונטאנלה חזיתית. בשיטה זו, המוח מחזיקה מעמד פחות נזק, וזה אפשר...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Embryonic Mouse Neural Stem Cells at JoVE.com

Isolation and Culture of Embryonic Mouse Neural Stem Cells

כאן, אנחנו מציגים בטכניקה המיקרוכירורגית הרומן על בידודו של תאי גזע עצביים מ E13 העכבר עובר ganglionic קדושתו.

בידוד והתרבות של תאי גזע עצביים עובריים בעכבר

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and ...

מטרת פרוטוקול וידאו זה היא הקמת פרוטוקול מקור ויעיל עבור עכבר עוברי עצבי גזע תא בידוד ותרבות. שלום, אני מרים סדגי-זאדה. אני סטודנטית לתואר שני בביולוגיה תאית ומולקולרית במכון רויאן.היום אני ועמיתי רוצים להראות לכם איך לקצור תאי גזע עצביים מ-13 גנגליונים של עכבר עוברים. שלום, אני בחרה עליזאדה-שורז'יסטאן. אני סטודנטית לתואר שני לביולוגיה תאית ומולקולרית במחלקה לתאי גזע במכון רויאן לביוטכנולוגיה.שלום, אני רזא דהגאני-ורנמקהסטי. כמו כן אני לומד ביולוגיה תאית ומולקולרית במכון רויאן. ניתוחים כוללים קצירת כל 13 עוברי עכבר מרחם.חיתוך החלק הקדמי של fontanel של העובר עם קצה מחט כפוף חילוץ המוח מהגולגולת. ניתוח מיקרו של מוח מבודד כדי לקצור את ההגמליוני. דיסוציאציה של הרקמה שנקטפו במדיום תאי גזע עצביים כדי להשיג השעיה של תא יחיד.ולבסוף, ציפוי תאים בתרבות השעיה כדי ליצור תאי עצב. לנקות ולחטא את העור של אזור הבטן על ידי ריסוס עם 70% אתנול. לשלוט על הבטן כלפי מעלה ולאחר מכן לחתוך את העור ואת הפנים עם מספריים כדי לחשוף חלל הבטן וקרני הרחם.הסר את קרני הרחם המכילות את העוברים על ידי מספריים ולהעביר אותם לתוך צינור חרוט 50 מ"ל המכיל 25 מ"ל קר HEPES MEM חיץ. מניחים את הצינור חרוט מתחת למכסה המנוע זרימה למינלית. פתח את הכובע מתחת למכסה המנוע.מוציאים את קרני הרחם מהצינור, ושטיפת שלוש פעמים עם נפח מספיק של חיץ HEPES MEM קר טרי כדי לחסל פסולת ודם. מעבירים את רקמת הרחם לצלחת פטרי באורך 10 ס"מ המכילה חיץ HEPES MEM קר של 7 עד 10 מ"ל. פתח את קרני הרחם באמצעות מספריים עדין ולהעביר עוברים לצלחת חדשה המכילה 7 עד 10 מ"ל של חיץ HEPES MEM קר.עכשיו לשים את צלחת 10 ס"מ עם עוברים מתחת למיקרוסקופ ניתוח לפעולת ניתוח מיקרו. לכופף את קצה מחט מזרק על ידי דחיפת הקצה שלה על ידית להב אזמל פלדה. לכופף את קצה המחט עד הקצה הוא כפוף בזווית של 70 עד 90 מעלות.בדוק את קצה המחט מתחת למיקרוסקופ לנתח כדי לראות את העיקול בקצה המחט. באופן טבעי לעוברים יש תנוחה צברית בזה. מבלי לשנות את עמדתם, החזיק את הצוואר והגוף של העובר עם מטלפים עדין ולאחר מכן להכניס את החלק הכפוף של המחט עמוק לתוך החלק הקדמי של fontanel של ראש העובר.יהיה שם דימום קטן או קריש דם. להזיז את קצה המחט באופן שטחי בעוד החלק הכפוף הוא בתוך הבליטה לכיוון המצח ולאחר מכן לכיוון החלק האחורי של הראש. הקפד לחתוך דרך העור והגולגולת, ולא לפגוע במוח הבסיסי.לדחוף את העור עם קצה המחט באופן מאוחר יותר כדי לחשוף את המוח. הכנס את המחט מהצד הצדדי של העור אל מתחת למסגרת מהצד הצדדי של העור לאזור שמתחת למוח. ואז להסיר את המוח מהקרקפת הזאת על ידי דוחף אותו לצאת מהגולגולת נותבה.ההגמוניה הגנגליונית מוצגת בבירור בוידאו עם החלקים המדיאליים והצלביים שלה. החזיק את המוח יציב באמצעות מטסות הטיפול ולאחר מכן באמצעות microscissors לחתוך את קליפת המוח של כל חצי כדור כדי לחשוף את ההגנגלי. החזיק את המוח ואת המקום ניתחו את ההגנגליות לתוך צינור צנטריפוגה 15 מ"ל המכיל מדיה תאי גזע עצביים.חזור על הליך זה עד שכל המוח עבר ניתוח מיקרו. חותכים את עליונות גנגליונית ניתוק על ידי הצבת קצה פיפטה על החלק התחתון של הצינור פיפטה ההשעיה למעלה ולמטה במשך 2 5 פעמים כדי לשבור את הרקמה כדי לקבל השעיה תא יחיד. צנטריפוגה ההשעיה ב 110 גרם במשך 5 דקות.הסר את העל-טבעי ולחץ מחדש על התאים ב- 1 מ"ל של צינור 0.05% ב- EDTA. דגירה ההשעיה התא ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. ולאחר מכן להוסיף נפח שווה ערך של מעכבי טריפסין סויה להפסיק פעילות טריפסין.פיפטה ההשעיה התא למעלה ולמטה כדי לוודא כי טריפסין כבר מושבת לחלוטין. צנטריפוגה ההשעיה התא ב 110 גרם במשך 5 דקות. הסר את supernatant ו resuspend התאים 1 מ"ל של תא גזע עצבי מלא בינוני לספור את מספר התאים.צלחת התאים בתאי גזע עצביים בינוני לתוך בקבוק תרבות רקמת גודל מתאים. מעבירים 5 מ"ל של 2T25, 20 מ"ל ל-T75 ו-40 מ"ל לבקבוקי T175. נוירוספרות יופיעו לאחר 3 ימים תרבות ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור לח עם 5%CO2.כדי למצוץ את התרבות את הנוירוספרות, להעביר את המדיום עם נוירוספרות מושעה לצנטריפוגה לצנטריפוגה ב 110 גרם במשך 5 דקות, ולאחר מכן להשליך את העל טבעי. ב 1 מ"ל של 0.05% טריפסין EDTA ודגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. ואז להשבית את טריפסין באמצעות מעכבי טירפין סויה פיפטה הנוירוספרות בעדינות למעלה ולמטה כדי להפוך אותם תאים בודדים.צנטריפוגה ההשעיה התא ב 110 גרם במשך 5 דקות. השליכו את העל-טבעי והשקיעו מחדש את התאים ב-1 מ"ל של תאי גזע עצביים בינוניים. תאים אלה מוכנים לשלב הבא תרבות או תרבות על משטח למינציה מצופה מלא לניסויים מתקדמים.על ידי טיפוח מיליון תאי גזע עצביים ראשוניים לאחר שבעה ימים מספר התאים יגדל לשלושה עד ארבעה מיליון. לאחר שישה עד שבעה ימים הספירות צריכות למדוד בין 150 ל -200 מיקרומטר קוטר ויהיו מוכנות לתת תרבות על מנות מצופות למינציה פולי אורניתן בהיעדר bFGF ו- EGF להבחנה עצבית. תוצאות הבדיקה של ציטומטריית זרימה מראות כי קרוב ל-95% מהתאים המהווים את הנוירוספרות היו חיוביים של נסטין, שהוא סמן ידוע לתאי גזע עצביים.בדיקות באמצעות בטא טובולין III ונוגדני חלבון סיבי גנגליו מגלים כי על ידי טיפוח תאי גזע עצביים על פני השטח מצופים סביב 94% הראו פנוטיפ עצבי סביב 5% להראות פנוטיפ גליה. רק בסרטון הקצר הזה טכניקת מעבדה לבידוד מהיר של תאי גזע עצביים מ-13 עוברי עכברים גנגליוניים. אני מקווה שתהצליח בתרבות תאי הגזע העצביים שלך.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Dissection והתרבות של נוירונים Commissural מחוט השדרה עובריים

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

בידוד הרחבה של תאים בוגרים עכבר גזע עצביים שימוש Assay Neurosphere

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay

הקמת עכבר עובריים גזע עצביים תרבית תאים באמצעות Assay Neurosphere

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life ...

Isolation and Culture of Neural Crest Stem Cells from Human Hair Follicles

בידוד ותרבות של תאי גזע עצביים קרסט מזקיקי שיער אנושיים

Hair follicles undergo lifelong growth and hair cycle is a well-controlled process involving stem cell proliferation and quiescence. Hair bulge is a ...

Lectin-based Isolation and Culture of Mouse Embryonic Motoneurons

לקטינים מבוססי בידוד תרבות Motoneurons עכבר עובריים

Spinal motoneurons develop towards postmitotic stages through early embryonic nervous system development and subsequently grow out dendrites and axons. ...

Isolation and Culture of Rat Embryonic Neural Cells: A Quick Protocol

בידוד והתרבות של תאים עובריים עצביים עכברוש: ​​פרוטוקול מהיר

We are describing a quick method to dissociate and culture hippocampal or cortical neurons from E15-17 rat embryos. The procedure can be applied ...

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

התרחבות של תאי גזע עצביים עובריים ומבוגרים על ידי<em&gt; ברחם</em&gt; Electroporation או הזרקת Stereotaxic ויראלי

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

בידוד והתרבות של תאים עצביים לפסגה מהצינור עובריים עצבית Murine

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

בידוד והתרבות של תאי האנדותל מהמוח הקדמי עוברי

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice

עכבר אחד, שתי תרבויות: בידוד והתרבות של תאי גזע עצביים למבוגרים משני האזורים העצביים של עכברים בודדים

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult ...