Name: isolation and culture of embryonic mouse neural stem cells
Uploaded: 2018-11-11T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Embryonic Mouse Neural Stem Cells at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av Royan Institute.

Alle operasjoner og prosedyrer på dyr ble godkjent av dyreetikk av Royan Institute, Sveits.
1. forberedelse av kirurgiske instrumenter, vaske bufferen (HEPES-MEM), celle kultur medier og celle kultur plater
<ol><li>Sterilisere kirurgiske verktøy (saks, skalpell blad håndtere og tang) av autoklavering dem basert på rutinemessig sterilisering retningslinjene.</li>
	<li>Forberede en tilstrekkelig mengde HEPES-MEM buffer (rundt 100 mL er nok for hver gravid mus). Legge til høye konsentrasjo...

<ol>
	<li>Navarro Quiroz, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Signaling+in+Neuronal+Stem+Cells.">Cell Signaling in Neuronal Stem Cells.</a> Cells. 7 (7), (2018).</li><li>Choi, C. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Thrombin+Receptor+Restricts+Subventricular+Zone+Neural+Stem+Cell+Expansion+and+Differentiation.">The Thrombin Receptor Restricts Subventricular Zone Neural Stem Cell Expansion and Differentiation.</a> Scientific Reports. 8 (1), 9360 (2018).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+novel+rat+neural+progenitor+clone+that+expresses+Dlx+family+transcription+factors+and+gives+rise+to+functional+GABAergic+neurons+in+culture.">Isolation of a novel rat neural progenitor clone that expresses Dlx family transcription factors and gives rise to functional GABAergic neurons in culture.</a> Developmental Neurobiology. 72 (6), 805-820 (2012).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+phenotypically+diverse+neural+culture+from+hESC+by+combining+adherent+and+dissociation+methods.">Derivation of phenotypically diverse neural culture from hESC by combining adherent and dissociation methods.</a> Journal of Neuroscience Methods. , (2018).</li><li>Dhara, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+neural+progenitor+cells+derived+from+embryonic+stem+cells+in+feeder-free+cultures.">Human neural progenitor cells derived from embryonic stem cells in feeder-free cultures.</a> Differentiation. 76 (5), 454-464 (2008).</li><li>Aligholi, H., Hassanzadeh, G., Gorji, A., Azari, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Biopsy+Method+for+Isolating+Neural+Stem+Cells+from+the+Subventricular+Zone+of+the+Adult+Rat+Brain+for+Autologous+Transplantation+in+CNS+Injuries.">A Novel Biopsy Method for Isolating Neural Stem Cells from the Subventricular Zone of the Adult Rat Brain for Autologous Transplantation in CNS Injuries.</a> Methods in Molecular Biology. 1462, 711-731 (2016).</li><li>Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M., Ansari, S., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+embryonic+mouse+neural+stem+cell+culture+using+the+neurosphere+assay.">Establishing embryonic mouse neural stem cell culture using the neurosphere assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (47), (2011).</li><li>Ferrari, D., Binda, E., De Filippis, L., Vescovi, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+neural+stem+cells+from+neural+tissues+using+the+neurosphere+technique.">Isolation of neural stem cells from neural tissues using the neurosphere technique.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. , (2010).</li><li>Guo, W., Patzlaff, N. E., Jobe, E. M., Zhao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+multipotent+neural+stem+or+progenitor+cells+from+both+the+dentate+gyrus+and+subventricular+zone+of+a+single+adult+mouse.">Isolation of multipotent neural stem or progenitor cells from both the dentate gyrus and subventricular zone of a single adult mouse.</a> Nature Protocols. 7 (2012), (2005).</li><li>Liu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Passage+Number+is+a+Major+Contributor+to+Genomic+Structural+Variations+in+Mouse+iPSCs.">Passage Number is a Major Contributor to Genomic Structural Variations in Mouse iPSCs.</a> Stem Cells and Development. 32 (10), 2657-2667 (2014).</li><li>Diaferia, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+Chromosomal+Analysis+of+Cultured+Mouse+Neural+Stem+Cell+Lines.">Systematic Chromosomal Analysis of Cultured Mouse Neural Stem Cell Lines.</a> Stem Cells and Development. 20 (8), 1411-1423 (2011).</li><li>Hemmer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+Neural+Stem+Cells+Achieve+Long-Term+Survival+and+Functional+Integration+in+the+Adult+Mouse+Brain.">Induced Neural Stem Cells Achieve Long-Term Survival and Functional Integration in the Adult Mouse Brain.</a> Stem Cell Reports. 3 (3), 423-431 (2014).</li><li>Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+Cytometry+Protocols+for+Surface+and+Intracellular+Antigen+Analyses+of+Neural+Cell+Types.">Flow Cytometry Protocols for Surface and Intracellular Antigen Analyses of Neural Cell Types.</a> Journal of Visualized Experiments. (94), 52241 (2014).</li><li>Zhang, Z., Wang, Z., Rui, W., Wu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnesium+lithospermate+B+promotes+proliferation+and+differentiation+of+neural+stem+cells+in+vitro+and+enhances+neurogenesis+in+vivo.">Magnesium lithospermate B promotes proliferation and differentiation of neural stem cells in vitro and enhances neurogenesis in vivo.</a> Tissue and Cell. 53, 8-14 (2018).</li><li>Zilkha-Falb, R., Gurevich, M., Hanael, E., Achiron, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prickle1+as+positive+regulator+of+oligodendrocyte+differentiation.">Prickle1 as positive regulator of oligodendrocyte differentiation.</a> Neuroscience. 364, 107-121 (2017).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodendrocyte+differentiation+from+human+neural+stem+cells:+A+novel+role+for+c-Src.">Oligodendrocyte differentiation from human neural stem cells: A novel role for c-Src.</a> Neurochemistry International. 120, 21-32 (2018).</li><li>Palanisamy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxytocin+alters+cell+fate+selection+of+rat+neural+progenitor+cells+in+vitro.">Oxytocin alters cell fate selection of rat neural progenitor cells in vitro.</a> PLoS ONE. 13 (1), e0191160 (2018).</li><li>Llewellyn-Smith, I. J., Basbaum, A. I., Braz, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term,+dynamic+synaptic+reorganization+after+GABAergic+precursor+cell+transplantation+into+adult+mouse+spinal+cord.">Long-term, dynamic synaptic reorganization after GABAergic precursor cell transplantation into adult mouse spinal cord.</a> Journal of Comparative Neurology. 526 (3), 480-495 (2018).</li><li>Precious, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FoxP1+marks+medium+spiny+neurons+from+precursors+to+maturity+and+is+required+for+their+differentiation.">FoxP1 marks medium spiny neurons from precursors to maturity and is required for their differentiation.</a> Experimental Neurology. 282, 9-18 (2016).</li></ol>

Bruke en egnet kilde av nevrale stamceller er svært viktig for neuroscientists. Nevrale stamceller kan høstes fra ulike områder av embryoet hjernen og de kan generere bestemte typer nerveceller og gliacellene. Det finnes flere metoder for induksjon av nevrale stamceller å overtale dem til å generere modne nevroner og gliacellene. Det er mange rapporter indikerer at under bestemte kultur forhold og trophic faktor regimenter, de kunne generere neurons14, oligodendrocytes15</su...

Nevrale stamceller (NSCs) ligger i forskjellige områder av voksen og embryo hjernen og de har en tendens til å generere ulike typer nerveceller og glial celle1. Subventricular soner i voksen pattedyr hjernen2 og ganglionic anseelse i fosteret hjernen er NSC rike regioner3. I utvikle hjernen leverer ganglionic eminense de fleste kortikale interneurons og spesielt GABAergic interneurons3. Det er også mindre invasive metoder for nevrale stamceller generasjon fra embryonale stamceller (ESCs) eller indusert pluripotent stamceller (iPSCs) som reduserer behovet for dyr bruk. Til tross for at genererer NSCs fra ESCs eller iPSCs er mulig4,5, har den noen fordeler og ulemper sammenlignet med isolering av nevrale stamceller fra voksen og embryo hjernen6,7, 8. Protokollene for inducing differensiering av ESCs og iPSCs mot neuronal fenotyper er alltid tid og kostnader forbruker og frekvensen av suksess (70-80% Nestin positive celler)5 er lavere sammenlignet med direkte isolering av NSCs fra dyr hjernen ( mer enn 99% Nestin positive celler)9. Videre miste stamceller deres genetisk stabilitet og differensiering tendens etter flere avsnitt10,11. Selv om det er andre nye rapporter om direkte konvertering av somatiske celler i NSCs, disse cellene er genmodifisert og er ikke lett tilgjengelig i hver lab12. Derfor er det fortsatt et stort behov for isolering av nevrale stamceller fra dyr hjernen; Det er mulig å redusere antall dyr behandling ved å forbedre kirurgiske teknikker. Reduserer kirurgiske og forbedre teknikkene, er det mulig å holde celler fra skade og få den høyeste frekvensen av NSCs fra hvert dyr.
Her introduserer vi en forenklet og reproduserbar teknikk for isolering av nevrale stamceller fra mus E13 embryoet hjerne.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:942px;" width="941">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:389px;">15 mL tubes</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">Falcon</td>
			<td dir="LTR" style="width:235px;">352097</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:389px;">50 mL tubes</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">Falcon</td>
			<td dir="LTR">352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:389px;">Adson Forceps, 12 cm, Straight</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">WPI</td>
			<td dir="LTR">14226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:389px;">B27</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">Gibco</td>
			<td dir="LTR" style="width:235px;">17504-44</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:389px;">bFGF</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">Sigma</td>
			<td dir="LTR" style="width:235px;">F0291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:389px;">bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td style="width:235px;">A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;">dish 10cm&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">Falcon</td>
			<td dir="LTR" style="width:235px;">353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:389px;">Dressing Forceps, 12.5 cm, Straight</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">WPI</td>
			<td dir="LTR">15908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;">Dumont Tweezers, 11 cm, Straight</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">WPI</td>
			<td dir="LTR" style="width:235px;">500342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:389px;">EGF</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">Sigma</td>
			<td dir="LTR" style="width:235px;">E9644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;">Ethanol</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">Merck</td>
			<td dir="LTR" style="width:235px;">100983&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:389px;">Glutamate</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">Sigma&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:235px;">G3291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:389px;">Glutamax</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">Gibco</td>
			<td dir="LTR" style="width:235px;">35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:389px;">goat anti rabbit FITC conjugated secondary antibody</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td style="width:235px;">AP307F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:389px;">goat serum</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td style="width:235px;">G9023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;">Heparin&#160;&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">Sigma</td>
			<td dir="LTR" style="width:235px;">h3149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:389px;">HEPES</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">Sigma</td>
			<td dir="LTR" style="width:235px;">83264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:389px;">HEPES</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">Sigma</td>
			<td dir="LTR">90909C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;">insulinsyringe with 25-27 gauge Needle&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">SUPA medical</td>
			<td dir="LTR">A1SNL127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:389px;">laminin</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">sigma&#160;&#160;&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:235px;">L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td dir="LTR" height="26" style="height:26px;width:389px;">MEM</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">Sigma</td>
			<td dir="LTR" style="width:235px;">M2279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td dir="LTR" height="26" style="height:26px;width:389px;">N2 supplement</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">Gibco</td>
			<td dir="LTR" style="width:235px;">17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:389px;">NB medium</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">Gibco</td>
			<td dir="LTR" style="width:235px;">21103-31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:389px;">Non-essential amino acid (NEAA)</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">Gibco</td>
			<td dir="LTR" style="width:235px;">11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:389px;">PBS without Ca and Mg</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">Gibco</td>
			<td dir="LTR">20012050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:389px;">Penicilin/ Streptomycin</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">Gibco</td>
			<td dir="LTR" style="width:235px;">5140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:389px;">Poly-L-ornithine</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">Sigma</td>
			<td dir="LTR" style="width:235px;">&#160;P4957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:389px;">rabbit anti mouse beta tubulin-III antibody</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td style="width:235px;">T2200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:389px;">rabbit anti mouse GFAP antibody</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td style="width:235px;">G4546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:389px;">rabbit anti mouse Nestin antibody</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td style="width:235px;">N5413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:389px;">Scalpel Handle #3</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">WPI</td>
			<td dir="LTR">500236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;">Scissors curve</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">WPI</td>
			<td dir="LTR" style="width:235px;">14396</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:389px;">Scissors sharp straight</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">WPI</td>
			<td dir="LTR">14192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;">Soybean trypsin inhibitor</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">Roche</td>
			<td dir="LTR" style="width:235px;">10109886001&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;">Tissue culture flasks, T25</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">BD</td>
			<td dir="LTR" style="width:235px;">353014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;">Tissue culture flasks, T75</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">BD</td>
			<td dir="LTR" style="width:235px;">353024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:389px;">Tween 20</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td style="width:235px;">P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;">Vannas Scissors,&#160; 8 cm, Straight&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">WPI</td>
			<td>14003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:389px;">&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">Sigma</td>
			<td dir="LTR">M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and culture of embryonic mouse neural stem cells

Nevrale stamceller (NSCs) er multipotent og kan gi opphav til de tre store celle typene sentralnervesystemet (CNS). In vitro kultur og utvidelse av NSCs gi en passende kilde celler for nevrologer å studere funksjon av nevroner og gliacellene sammen med deres samspill. Det finnes flere rapporterte teknikker for isolering av nevrale stamceller fra voksen og embryo pattedyr hjerner. Under Mikrokirurgiske operasjonen isolere NSCs fra forskjellige regioner i embryonale CNS, er det svært viktig å redusere skade på hjernen celler å få den høyeste forholdet mellom live og utvidbart stamceller. En mulig teknikk for stress reduksjon under isolasjon av disse cellene fra musen embryoet hjernen er reduksjonen av kirurgiske tid. Her viser vi en utviklet teknikk for rask isolering av disse cellene fra E13 musen fosteret ganglionic eminense. Kirurgiske prosedyrer inkluderer høsting E13 mouse embryoer fra livmoren, kutte den frontal fontanelle av embryoet med en bøyd pinne-spissen, utpakking hjernen i skallen, microdissection av isolerte hjernen å høste ganglionic eminense, dissosiasjon høstet vevet i NSC medium for å få en enkeltcelle suspensjon, og til slutt plating celler i suspensjon kultur for å generere neurospheres.

Mikro-disseksjon, cellen aisolering og Neurosphere kultur. Her presentert vi en rask og effektiv metode mus E13 hjernen mikrokirurgi og isolering av nevrale stamceller. Denne artikkelen viser at det er mulig å fjerne hele hjernen fra en E13 musen embryoet skallen gjennom en fin brudd i frontal fontanelle. Med denne metoden hjernen varer mindre skade og er det mulig å isolere celler fra ulike deler av hjernen. Høstet cellene kunne generere neurosph...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Embryonic Mouse Neural Stem Cells at JoVE.com

Isolation and Culture of Embryonic Mouse Neural Stem Cells

Her introduserer vi en Mikrokirurgiske teknikken for isolering av nevrale stamceller fra E13 musen fosteret ganglionic eminense.

Isolasjon og kultur av embryonale mus embryonale stamceller

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and ...

Målet med denne videoprotokollen er å etablere en kilde og effektiv protokoll for embryonal mus neural stamcelleisolasjon og kultur. Hei, jeg er Maryam Sadeghi-Zadeh. Jeg er masterstudent i cellulær og molekylærbiologi ved Royan Institute.I dag vil jeg og min kollega vise deg hvordan du høster nevrale stamceller fra 13 embryomus ganglionic eminens. Hei, jeg er Bahareh Alizadeh-Shoorjestan. Jeg er masterstudent for cellulær og molekylærbiologi ved stamcelleavdelingen ved Royan Institute for Biotechnology.Hei, jeg er Reza Dehghani-Varnamkhasti. Også jeg studerer cellulær og molekylærbiologi i Royan Institute. Kirurgiske prosedyrer inkluderer høsting av hver 13 museembryoer fra livmor.Kutte forsiden av fontanel av embryo med en bøyd nål tips trekke hjernen fra skallen. Mikrodeksjon av isolert hjerne for å høste ganglionic eminens. Dissosiasjon av høstet vev i et nevrale stamcellemedium for å få en enkelt celle suspensjon.Og til slutt, plating celler i en suspensjon kultur for å generere nerveceller. Rengjør og desinfiserende huden i mageområdet ved sprøyting med 70% etanol. Kontroller huden oppover magen og deretter kutte huden og understreket ansikts med saks for å avdekke bukhulen og livmor horn.Fjern livmorhornene som inneholder embryoene med saks og overfør dem til et 50 ml konisk rør som inneholder 25 ml kald HEPES MEM-buffer. Plasser det koniske røret under laminalstrømningshetten. Åpne hetten under panseret.Ta livmorhornene ut av røret, og skyll tre ganger med nok volum av den friske kalde HEPES MEM-bufferen for å eliminere rusk og blod. Overfør livmorvevet til en 10 cm petriskål som inneholder 7 til 10 ml kald HEPES MEM-buffer. Åpne livmorhornene med fin saks og overfør embryoer til en ny tallerken som inneholder 7 til 10 ml kald HEPES MEM-buffer.Legg nå 10 cm parabolen med embryoer under disseksjonsmikroskopet for mikrodeksjonsoperasjon. Bøy spissen på en sprøytenål ved å skyve spissen på et stålskalpellbladhåndtak. Bøy spissen av nålen til spissen er bøyd i en vinkel på 70 til 90 grader.Kontroller spissen av nålen under disseksjonsmikroskopet for å se bøyningen på spissen av nålen. Naturlig embryoer har en lateral posisjon i dette. Uten å endre sin posisjon, holdt halsen og kroppen av embryoet med fine tang og sett deretter den bøyde delen av nålen dypt inn i forsiden av fontanelen til embryohodet.Det ville være en liten blødning eller en blodpropp der. Flytt nålespissen overfladisk mens den bøyde delen er inne i bulen mot pannen og deretter mot baksiden av hodet. Sørg for å skjære gjennom huden og skallen, og ikke for å skade den underliggende hjernen.Skyv huden med nålespissen sidealt for å avdekke hjernen. Sett nålen fra sidesiden av huden til under rammen fra sidesiden av huden til området under hjernen. Og fjern deretter hjernen fra denne hodebunnen ved å skyve den for å komme ut fra den dissekerte skallen.Den ganglionic eminens er tydelig vist i video med sine mediale og laterale deler. Holdt hjernen stødig ved hjelp av pleiekraftene og deretter ved hjelp av mikroscissorer for å kutte cortex av hver halvkule for å avsløre ganglionic eminens. Holdt hjernen og plassere dissekert ganglionic eminens i 15 ml sentrifuge rør som inneholder nevrale stamcellemedier.Gjenta denne prosedyren til hele hjernen har blitt mikro-dissekert. Skjær dissekert ganglionic eminens ved å plassere pipettespissen mot bunnen av røret og pipette suspensjonen opp og ned i 2 5 ganger for å bryte opp vevet for å få en enkelt celle suspensjon. Sentrifuger suspensjonen ved 110 g i 5 minutter.Fjern de overnaturlige og gjenoppuss cellene i 1 ml 0,05% rør i EDTA. Inkuber cellesuspensjonen i en 37 grader Celsius i 10 minutter. Og legg deretter til et tilsvarende volum av soyabønne trypsinhemmer for å stoppe trypsinaktivitet.Pipette cellen suspensjon opp og ned for å sikre at trypsin har blitt helt inaktivert. Sentrifuger cellefjæringen ved 110 g i 5 minutter. Fjern det overnaturlige og resuspend cellene i 1 ml komplett nevrale stamcellemedium og telle antall celler.Plate cellene på neural stamcelle medium i egnet størrelse vev kultur kolbe. Overfør 5 ml 2T25, 20 ml til T75 og 40 ml til T175 flasker. Neurosfærer vil vises etter 3 dagers kultur ved 37 grader Celsius i en fuktet inkubator med 5% CO2.For å suge kulturen nevrosfærene, overfør mediet med suspenderte nevrosfærer til sentrifugen for å sentrifuge på 110 g i 5 minutter, og kast deretter det overnaturlige. Ved 1 ml 0,05% trypsin EDTA og inkuber ved 37 grader Celsius i 10 minutter. Deretter inaktiver trypsin ved hjelp av soyben tyrpsinhemmer og pipette neurosfærene forsiktig opp og ned for å gjøre dem enkeltceller.Sentrifuger cellefjæringen ved 110 g i 5 minutter. Kast de overnaturante og gjenoppusst cellene i 1 ml nevrale stamceller medium. Disse cellene er klare for neste trinn kultur eller kultur på laminat og fullt belagt overflate for avanserte eksperimenter.Ved å dyrke en million primære nevrale stamceller etter syv dager vil antall celler øke til tre til fire millioner. Etter seks til syv dager sfærene skal måle mellom 150 til 200 mikrometer i diameter og vil være klar for sub kultur på laminat poly ornitin belagt retter i fravær av bFGF og EGF for neuronal differensiering. Flow cytometri analyse resultater viser at nær 95% av cellene utgjør neurospheres var Nestin positiv som er en kjent markør for nevrale stamceller.Analyser ved hjelp av beta tubulin III og ganglio fibrøse protein antistoffer avslører at ved å dyrke nevrale stamceller på belagt overflate rundt 94% vist nevronal fenotype og rundt 5% viser glial fenotype. I denne korte videoen en lab teknikk for rask isolering av nevrale stamcelle fra 13 mus embryo ganglionic eminens. Jeg håper du vil lykkes i din nevrale stamcellekultur.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life ...

Isolation and Culture of Neural Crest Stem Cells from Human Hair Follicles

Isolasjon og kultur av neural crest stamceller fra Human Hair Follikler

Hair follicles undergo lifelong growth and hair cycle is a well-controlled process involving stem cell proliferation and quiescence. Hair bulge is a ...

Lectin-based Isolation and Culture of Mouse Embryonic Motoneurons

Spinal motoneurons develop towards postmitotic stages through early embryonic nervous system development and subsequently grow out dendrites and axons. ...

Isolation and Culture of Rat Embryonic Neural Cells: A Quick Protocol

Isolering og kultur Rat Embryonale nevrale celler: En rask protokoll

We are describing a quick method to dissociate and culture hippocampal or cortical neurons from E15-17 rat embryos. The procedure can be applied ...

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Utvidelse av embryonale og voksne nevrale stamceller ved<em&gt; In Utero</em&gt; Electroporation eller Viral stereotaksiske Injection

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

Isolering og kultur neural crest Celler fra Embryonic murin Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

Isolasjon og kultur av endotelceller fra Embryonale brain

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice

En mus, to kulturer: Isolation and Culture of Adult nevrale stamceller fra de to nevrogene Soner Individuell Mus

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult ...