Name: isolation and culture of embryonic mouse neural stem cells
Uploaded: 2018-11-11T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Embryonic Mouse Neural Stem Cells at JoVE.com

Эта работа была поддержана института Руана.

Все операции и процедуры на животных были утверждены Комитетом животных этики Института Руана, Тегеран, Иран.
1. Подготовка хирургических инструментов, Стиральная буфера (HEPES-MEM), СМИ культуры клеток и клеток культуры пластин
<ol><li>Стерилизуйте хирургические инструменты (?...

<ol>
	<li>Navarro Quiroz, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Signaling+in+Neuronal+Stem+Cells.">Cell Signaling in Neuronal Stem Cells.</a> Cells. 7 (7), (2018).</li><li>Choi, C. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Thrombin+Receptor+Restricts+Subventricular+Zone+Neural+Stem+Cell+Expansion+and+Differentiation.">The Thrombin Receptor Restricts Subventricular Zone Neural Stem Cell Expansion and Differentiation.</a> Scientific Reports. 8 (1), 9360 (2018).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+novel+rat+neural+progenitor+clone+that+expresses+Dlx+family+transcription+factors+and+gives+rise+to+functional+GABAergic+neurons+in+culture.">Isolation of a novel rat neural progenitor clone that expresses Dlx family transcription factors and gives rise to functional GABAergic neurons in culture.</a> Developmental Neurobiology. 72 (6), 805-820 (2012).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+phenotypically+diverse+neural+culture+from+hESC+by+combining+adherent+and+dissociation+methods.">Derivation of phenotypically diverse neural culture from hESC by combining adherent and dissociation methods.</a> Journal of Neuroscience Methods. , (2018).</li><li>Dhara, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+neural+progenitor+cells+derived+from+embryonic+stem+cells+in+feeder-free+cultures.">Human neural progenitor cells derived from embryonic stem cells in feeder-free cultures.</a> Differentiation. 76 (5), 454-464 (2008).</li><li>Aligholi, H., Hassanzadeh, G., Gorji, A., Azari, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Biopsy+Method+for+Isolating+Neural+Stem+Cells+from+the+Subventricular+Zone+of+the+Adult+Rat+Brain+for+Autologous+Transplantation+in+CNS+Injuries.">A Novel Biopsy Method for Isolating Neural Stem Cells from the Subventricular Zone of the Adult Rat Brain for Autologous Transplantation in CNS Injuries.</a> Methods in Molecular Biology. 1462, 711-731 (2016).</li><li>Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M., Ansari, S., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+embryonic+mouse+neural+stem+cell+culture+using+the+neurosphere+assay.">Establishing embryonic mouse neural stem cell culture using the neurosphere assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (47), (2011).</li><li>Ferrari, D., Binda, E., De Filippis, L., Vescovi, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+neural+stem+cells+from+neural+tissues+using+the+neurosphere+technique.">Isolation of neural stem cells from neural tissues using the neurosphere technique.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. , (2010).</li><li>Guo, W., Patzlaff, N. E., Jobe, E. M., Zhao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+multipotent+neural+stem+or+progenitor+cells+from+both+the+dentate+gyrus+and+subventricular+zone+of+a+single+adult+mouse.">Isolation of multipotent neural stem or progenitor cells from both the dentate gyrus and subventricular zone of a single adult mouse.</a> Nature Protocols. 7 (2012), (2005).</li><li>Liu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Passage+Number+is+a+Major+Contributor+to+Genomic+Structural+Variations+in+Mouse+iPSCs.">Passage Number is a Major Contributor to Genomic Structural Variations in Mouse iPSCs.</a> Stem Cells and Development. 32 (10), 2657-2667 (2014).</li><li>Diaferia, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+Chromosomal+Analysis+of+Cultured+Mouse+Neural+Stem+Cell+Lines.">Systematic Chromosomal Analysis of Cultured Mouse Neural Stem Cell Lines.</a> Stem Cells and Development. 20 (8), 1411-1423 (2011).</li><li>Hemmer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+Neural+Stem+Cells+Achieve+Long-Term+Survival+and+Functional+Integration+in+the+Adult+Mouse+Brain.">Induced Neural Stem Cells Achieve Long-Term Survival and Functional Integration in the Adult Mouse Brain.</a> Stem Cell Reports. 3 (3), 423-431 (2014).</li><li>Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+Cytometry+Protocols+for+Surface+and+Intracellular+Antigen+Analyses+of+Neural+Cell+Types.">Flow Cytometry Protocols for Surface and Intracellular Antigen Analyses of Neural Cell Types.</a> Journal of Visualized Experiments. (94), 52241 (2014).</li><li>Zhang, Z., Wang, Z., Rui, W., Wu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnesium+lithospermate+B+promotes+proliferation+and+differentiation+of+neural+stem+cells+in+vitro+and+enhances+neurogenesis+in+vivo.">Magnesium lithospermate B promotes proliferation and differentiation of neural stem cells in vitro and enhances neurogenesis in vivo.</a> Tissue and Cell. 53, 8-14 (2018).</li><li>Zilkha-Falb, R., Gurevich, M., Hanael, E., Achiron, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prickle1+as+positive+regulator+of+oligodendrocyte+differentiation.">Prickle1 as positive regulator of oligodendrocyte differentiation.</a> Neuroscience. 364, 107-121 (2017).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodendrocyte+differentiation+from+human+neural+stem+cells:+A+novel+role+for+c-Src.">Oligodendrocyte differentiation from human neural stem cells: A novel role for c-Src.</a> Neurochemistry International. 120, 21-32 (2018).</li><li>Palanisamy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxytocin+alters+cell+fate+selection+of+rat+neural+progenitor+cells+in+vitro.">Oxytocin alters cell fate selection of rat neural progenitor cells in vitro.</a> PLoS ONE. 13 (1), e0191160 (2018).</li><li>Llewellyn-Smith, I. J., Basbaum, A. I., Braz, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term,+dynamic+synaptic+reorganization+after+GABAergic+precursor+cell+transplantation+into+adult+mouse+spinal+cord.">Long-term, dynamic synaptic reorganization after GABAergic precursor cell transplantation into adult mouse spinal cord.</a> Journal of Comparative Neurology. 526 (3), 480-495 (2018).</li><li>Precious, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FoxP1+marks+medium+spiny+neurons+from+precursors+to+maturity+and+is+required+for+their+differentiation.">FoxP1 marks medium spiny neurons from precursors to maturity and is required for their differentiation.</a> Experimental Neurology. 282, 9-18 (2016).</li></ol>

С помощью подходящего источника нервных стволовых клеток является очень важным для неврологов. Нервные стволовые клетки могут быть собраны из различных областей мозга эмбриона и они могут генерировать конкретные типы нейронов и глиальных клеток. Существует несколько методов для инд?...

Нервные стволовые клетки (NSCs) находятся в различных регионах мозга взрослого и эмбрион, и они имеют тенденцию генерировать различные типы нейронов и глиальных клеток1. НБК богатые регионы3субвентрикулярной зоны в взрослого мозга млекопитающих2 и Ганглиозный возвышением головного мозга эмбриона. В развивающемся мозге Ганглиозный возвышение обеспечивает большую часть коры интернейронов и особенно ГАМК интернейронов3. Есть также менее инвазивные методы для генерации нервных стволовых клеток из эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) или использовать индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSCs), которые снижают спрос на животных. Несмотря на то, что создание NSCs из ЭСК или iPSCs возможно4,5она имеет некоторые преимущества и недостатки по сравнению с изоляции нервных стволовых клеток от взрослого или эмбриона мозга6,7, 8. Протоколы для стимулирования дифференцирования ЭСК и iPSCs сторону нейрональных фенотипов всегда времени и стоимости потребления и уровень успеха (70-80% Nestin положительные клетки)5 ниже по сравнению с прямым изоляции NSCs от животных мозга ( более 99% Nestin позитивных клеток)9. Кроме того стволовые клетки теряют их генетической стабильности и дифференциации тенденция после нескольких проходов10,11. Даже несмотря на то, что есть другие новые сообщения о прямое преобразование соматических клеток в NSCs, эти клетки генетически модифицированные и не являются легко доступны в каждой лаборатории12. Таким образом существует большой спрос на изоляции нервных стволовых клеток от животных мозга; Это позволяет уменьшить количество животных использования путем совершенствования хирургической техники. Путем сокращения времени, хирургические и улучшения методов, можно сохранить клетки от повреждения и получить высокий уровень NSCs от каждого животного.
Здесь мы представляем упрощенной и воспроизводимый метод для изоляции нервных стволовых клеток от мозга эмбриона мыши E13 .

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:942px;" width="941">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:389px;">15 mL tubes</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">Falcon</td>
			<td dir="LTR" style="width:235px;">352097</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:389px;">50 mL tubes</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">Falcon</td>
			<td dir="LTR">352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:389px;">Adson Forceps, 12 cm, Straight</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">WPI</td>
			<td dir="LTR">14226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:389px;">B27</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">Gibco</td>
			<td dir="LTR" style="width:235px;">17504-44</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:389px;">bFGF</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">Sigma</td>
			<td dir="LTR" style="width:235px;">F0291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:389px;">bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td style="width:235px;">A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;">dish 10cm&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">Falcon</td>
			<td dir="LTR" style="width:235px;">353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:389px;">Dressing Forceps, 12.5 cm, Straight</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">WPI</td>
			<td dir="LTR">15908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;">Dumont Tweezers, 11 cm, Straight</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">WPI</td>
			<td dir="LTR" style="width:235px;">500342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:389px;">EGF</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">Sigma</td>
			<td dir="LTR" style="width:235px;">E9644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;">Ethanol</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">Merck</td>
			<td dir="LTR" style="width:235px;">100983&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:389px;">Glutamate</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">Sigma&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:235px;">G3291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:389px;">Glutamax</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">Gibco</td>
			<td dir="LTR" style="width:235px;">35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:389px;">goat anti rabbit FITC conjugated secondary antibody</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td style="width:235px;">AP307F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:389px;">goat serum</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td style="width:235px;">G9023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;">Heparin&#160;&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">Sigma</td>
			<td dir="LTR" style="width:235px;">h3149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:389px;">HEPES</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">Sigma</td>
			<td dir="LTR" style="width:235px;">83264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:389px;">HEPES</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">Sigma</td>
			<td dir="LTR">90909C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;">insulinsyringe with 25-27 gauge Needle&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">SUPA medical</td>
			<td dir="LTR">A1SNL127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:389px;">laminin</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">sigma&#160;&#160;&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:235px;">L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td dir="LTR" height="26" style="height:26px;width:389px;">MEM</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">Sigma</td>
			<td dir="LTR" style="width:235px;">M2279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td dir="LTR" height="26" style="height:26px;width:389px;">N2 supplement</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">Gibco</td>
			<td dir="LTR" style="width:235px;">17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:389px;">NB medium</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">Gibco</td>
			<td dir="LTR" style="width:235px;">21103-31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:389px;">Non-essential amino acid (NEAA)</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">Gibco</td>
			<td dir="LTR" style="width:235px;">11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:389px;">PBS without Ca and Mg</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">Gibco</td>
			<td dir="LTR">20012050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:389px;">Penicilin/ Streptomycin</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">Gibco</td>
			<td dir="LTR" style="width:235px;">5140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:389px;">Poly-L-ornithine</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">Sigma</td>
			<td dir="LTR" style="width:235px;">&#160;P4957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:389px;">rabbit anti mouse beta tubulin-III antibody</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td style="width:235px;">T2200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:389px;">rabbit anti mouse GFAP antibody</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td style="width:235px;">G4546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:389px;">rabbit anti mouse Nestin antibody</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td style="width:235px;">N5413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:389px;">Scalpel Handle #3</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">WPI</td>
			<td dir="LTR">500236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;">Scissors curve</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">WPI</td>
			<td dir="LTR" style="width:235px;">14396</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:389px;">Scissors sharp straight</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">WPI</td>
			<td dir="LTR">14192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;">Soybean trypsin inhibitor</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">Roche</td>
			<td dir="LTR" style="width:235px;">10109886001&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;">Tissue culture flasks, T25</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">BD</td>
			<td dir="LTR" style="width:235px;">353014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;">Tissue culture flasks, T75</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">BD</td>
			<td dir="LTR" style="width:235px;">353024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:389px;">Tween 20</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td style="width:235px;">P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;">Vannas Scissors,&#160; 8 cm, Straight&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">WPI</td>
			<td>14003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:389px;">&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">Sigma</td>
			<td dir="LTR">M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and culture of embryonic mouse neural stem cells

Нервные стволовые клетки (NSCs) Multipotent с и может привести к трем видам основных клеток центральной нервной системы (ЦНС). В vitro культуры и расширение NSCs обеспечивают удобный источник клеток для неврологов для изучения функции нейронов и глиальных клеток, а также их взаимодействия. Существует несколько методов сообщил для изоляции нервных стволовых клеток от взрослого или эмбриона млекопитающих мозги. Во время микрохирургической операции изолировать NSCs из разных регионов эмбриональных ЦНС очень важно уменьшить повреждение клетки мозга, чтобы получить самый высокий коэффициент живой и расширяемая стволовых клеток. Возможный способ для снижения стресса во время изоляции этих клеток мозга эмбриона мыши — сокращение времени хирургического. Здесь мы демонстрируем разработанная методика для быстрой изоляции этих клеток от ганглиозных возвышение эмбриона мыши13 E. Хирургические процедуры включают в себя сбор эмбрионов мыши13 E от матки, резка лобной Фонтанелле эмбриона с изогнутой иглой оконечности, извлечение мозг от черепа, microdissection изолированных мозга урожай Ганглиозный возвышение, диссоциация заготовленной ткани в НСК среднего получить одну ячейку подвеска, и, наконец, обшивка клеток в культуре подвеска для создания neurospheres.

Микро рассечение, изоляция клетки и культуры нейросферы. Здесь мы представили быстрый и эффективный метод для изоляции нервных стволовых клеток и мышь E13 мозга микрохирургии. Эта статья показывает, что это возможно удалить весь мозг из черепа E по13 </sup...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Embryonic Mouse Neural Stem Cells at JoVE.com

Isolation and Culture of Embryonic Mouse Neural Stem Cells

Здесь мы представляем Роман микрохирургическая техника для изоляции нервных стволовых клеток от ганглиозных возвышение эмбриона мыши13 E.

Изоляции и культуры нервных стволовых клеток эмбриона мыши

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and ...

Целью этого видео-протокола является создание источника и эффективного протокола для эмбриональной мыши нейронной изоляции стволовых клеток и культуры. Здравствуйте, я Марьям Садеги-Заде. Я магистр клеточной и молекулярной биологии в Институте Рояна.Сегодня я и мой коллега хотим показать вам, как собрать нейронную стволовую клетку из 13 эмбрионов мыши ганглионной высокотемиенции. Здравствуйте, я Бахарех Ализаде-Шурджестан. Я магистр клеточной и молекулярной биологии на кафедре стволовых клеток Института биотехнологии Рояна.Здравствуйте, я Реза Дехгани-Варнамхати. Также я изучаю клеточной и молекулярной биологии в Институте Рояна. Хирургические процедуры включают сбор каждых 13 эмбрионов мыши из матки.Резка передней части фонтанеля эмбриона с согнутой иглой кончик извлечения мозга из черепа. Микро-рассечение изолированного мозга для сбора ганглионной высокотысячи. Диссоциация собранных тканей в среде нервной стволовой клетки, чтобы получить одноклеточную суспензию.И, наконец, покрытие клеток в культуре суспензии для генерации нервных клеток. Очистите и дезинфицируете кожу брюшной полости, распылив 70% этанола. Управление кожи вверх живота, а затем сократить кожу и подчеркнул лица с ножницами, чтобы раскрыть брюшной полости и рога матки.Удалите рога матки, содержащие эмбрионы ножницами, и перенесите их в коническую трубку 50 мл, содержащую 25 мл холодного буфера HEPES MEM. Поместите коническую трубку под капотом ламинального потока. Откройте крышку под капотом.Принесите рога матки из трубки, и промыть три раза с достаточным объемом свежего холодного буфера HEPES MEM для устранения мусора и крови. Перенесите маточную ткань в 10-сантиметровую чашку Петри, содержащую от 7 до 10 мл холодного буфера HEPES MEM. Откройте рога матки с помощью тонких ножниц и перенесите эмбрионы в новое блюдо, содержащее от 7 до 10 мл холодного буфера HEPES MEM.Теперь поместите 10 см блюдо с эмбрионами под рассечение микроскопа для микро-рассечения операции. Согните кончик шприц-иглы, нажав его кончик на стальной скальпель лезвие ручкой. Согните кончик иглы до тех пор, пока кончик не будет согнут под углом от 70 до 90 градусов.Проверьте кончик иглы под рассечением микроскопа, чтобы увидеть изгиб на кончике иглы. Естественно, эмбрионы имеют боковое положение в этом. Не изменяя своего положения, ухранил шею и тело эмбриона мелкими типсами, а затем вставил согнутую часть иглы глубоко в переднюю часть фонтанеля головы эмбриона.Там будет небольшое кровотечение или сгусток крови. Перемещение кончик иглы поверхностно в то время как изогнутая часть находится внутри выпуклость к лбу, а затем к задней части головы. Убедитесь в том, чтобы прорезать кожу и череп, а не повредить основной мозг.Нажмите кожу кончиком иглы боковой, чтобы раскрыть мозг. Вставьте иглу с боковой стороны кожи под рамой от боковой стороны кожи к области под мозгом. А затем удалить мозг из этой кожи головы, нажав его, чтобы выйти из расчлененного черепа.Ганглионическое высокопреосвятность четко показано на видео с его медиальной и боковой частей. Провел мозг устойчивый с помощью ухода типсов, а затем с помощью микросхисторов, чтобы сократить коры каждого полушария, чтобы разоблачить ганглийской высокотемиенции. Провел мозг и место расчлененных ганглионной высокотыли в 15 мл центрифуги трубки, содержащей нервной стволовой клетки средств массовой информации.Повторите эту процедуру до тех пор, пока весь мозг не будет микро-рассечен. Вырезать расчлененные ганглионные возмения, поместив наконечник пипетки против нижней части трубки и пипетки подвески вверх и вниз в течение 2 5 раз, чтобы разбить ткани, чтобы получить одноклеточную подвеску. Центрифуга подвески на 110 г в течение 5 минут.Удалите супернатант и повторно потеку клетки в 1 мл 0,05%трубки в EDTA. Инкубировать клеточной подвески в 37 градусов по Цельсию в течение 10 минут. А затем добавить эквивалентный объем ингибитора трипсина сои, чтобы остановить активность трипсина.Pipette ячейки подвески вверх и вниз, чтобы убедиться, что трипсин был полностью инактивирован. Центрифуга клеточной суспензии при 110 г в течение 5 минут. Удалить супернатант и повторного перерасхода клеток в 1 мл полной нервной стволовой клетки среды и подсчитать количество клеток.Плита клетки на нервной среде стволовых клеток в подходящий размер ткани культуры колбу. Перенесите 5 мл 2T25, 20 мл на T75 и 40 мл в колбы T175. Нейросферы появятся после 3 дней культуры при 37 градусах Цельсия в увлажненные инкубатор с 5%CO2.Чтобы сосать культуру нейросферы, перенесите среду с подвешенными нейросферами в центрифугу, чтобы центрифугу при 110 г в течение 5 минут, а затем отбросьте супернатант. При 1 мл 0,05%трипсина ЭДТА и инкубации при 37 градусах Цельсия в течение 10 минут. Затем инактивировать трипсин с помощью ингибитора соя tyrpsin и пипетки нейросфер мягко вверх и вниз, чтобы сделать их одиночными клетками.Центрифуга клеточной суспензии при 110 г в течение 5 минут. Откажитесь от супернатанта и повторно найди клетки в 1 мл нервных стволовых клеток среды. Эти клетки готовы к следующему шагу культуры или культуры на ламинат и полностью покрытием поверхности для передовых экспериментов.Путем культивировать миллион главным образом нервных стволовых клеток после 7 дней число клеток увеличит до 3 до 4 миллионов. Через шесть-семь дней сферы должны измерять от 150 до 200 микрометров в диаметре и будут готовы к суб-культуре на ламинированной поли орнитинированной посуде при отсутствии bFGF и EGF для нейрональной дифференциации. Результаты анализа цитометрии потока показывают, что около 95% клеток, составляющих нейросферы, были положительными Nestin, который является известным маркером для нервных стволовых клеток.Анализы с использованием бета-тубулина III и ганглио волокнистых белковых антител показывают, что, культивируя нервные стволовые клетки на покрытой поверхности около 94%, показан фенотип нейронов и около 5%показывают генотип глиала. В этом коротком видео лабораторный метод для быстрой изоляции нервной стволовой клетки от 13 эмбрионов мыши ганглионной высокотемиенции. Я надеюсь, что вы будете успеха в вашей нервной культуры стволовых клеток.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Разбор и культуры спаечный Нейроны из эмбриональных спинного мозга

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

Выделение и расширение взрослой мыши нервные стволовые клетки Использование Neurosphere Пробирной

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay

Создание эмбриональных Мышь нейронные культуры стволовых клеток Использование Neurosphere Пробирной

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life ...

Isolation and Culture of Neural Crest Stem Cells from Human Hair Follicles

Выделение и культуры нервного гребня стволовых клеток из человеческих волоса

Hair follicles undergo lifelong growth and hair cycle is a well-controlled process involving stem cell proliferation and quiescence. Hair bulge is a ...

Lectin-based Isolation and Culture of Mouse Embryonic Motoneurons

Лектин изоляции, основанные на культуре и мышь мотонейронов Эмбриональные

Spinal motoneurons develop towards postmitotic stages through early embryonic nervous system development and subsequently grow out dendrites and axons. ...

Isolation and Culture of Rat Embryonic Neural Cells: A Quick Protocol

Выделение и культуры крысы эмбриональных нервных клеток: Быстрый протокол

We are describing a quick method to dissociate and culture hippocampal or cortical neurons from E15-17 rat embryos. The procedure can be applied ...

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Расширение эмбриональных и взрослых нервных стволовых клеток путем<em&gt; В Utero</em&gt; Электропорации или вирусных Стереотаксическая инъекций

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

Выделение и культуры клеток нервного гребня из эмбриональных мышей нервной трубки

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

Выделение и культуры эндотелиальных клеток из эмбриональных переднего мозга

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice

Один мышь, двух культур: Выделение и культивирование взрослых нервных стволовых клеток из двух Нейрогенные зон отдельных мышей

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult ...