Name: isolation and culture of embryonic mouse neural stem cells
Uploaded: 2018-11-11T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Embryonic Mouse Neural Stem Cells at JoVE.com

Detta arbete stöds av Royan Institutet.

Alla operationer och förfaranden på djuret godkändes av utskottet djuretik i Royan Institutet, Teheran, Iran.
1. beredning av kirurgiska instrument, tvätt buffert (HEPES-MEM), Cell kulturmassmedia och Cell kultur plattor
<ol><li>Sterilisera kirurgiska verktyg (sax, skalpell blad handtag och tången) i autoklav dem baserat på riktlinjerna som rutinmässig sterilisering.</li>
	<li>Förbereda en lämplig volym av HEPES-MEM buffert (omkring 100 mL räcker till varje dräktiga möss). Lägga...

<ol>
	<li>Navarro Quiroz, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Signaling+in+Neuronal+Stem+Cells.">Cell Signaling in Neuronal Stem Cells.</a> Cells. 7 (7), (2018).</li><li>Choi, C. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Thrombin+Receptor+Restricts+Subventricular+Zone+Neural+Stem+Cell+Expansion+and+Differentiation.">The Thrombin Receptor Restricts Subventricular Zone Neural Stem Cell Expansion and Differentiation.</a> Scientific Reports. 8 (1), 9360 (2018).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+novel+rat+neural+progenitor+clone+that+expresses+Dlx+family+transcription+factors+and+gives+rise+to+functional+GABAergic+neurons+in+culture.">Isolation of a novel rat neural progenitor clone that expresses Dlx family transcription factors and gives rise to functional GABAergic neurons in culture.</a> Developmental Neurobiology. 72 (6), 805-820 (2012).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+phenotypically+diverse+neural+culture+from+hESC+by+combining+adherent+and+dissociation+methods.">Derivation of phenotypically diverse neural culture from hESC by combining adherent and dissociation methods.</a> Journal of Neuroscience Methods. , (2018).</li><li>Dhara, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+neural+progenitor+cells+derived+from+embryonic+stem+cells+in+feeder-free+cultures.">Human neural progenitor cells derived from embryonic stem cells in feeder-free cultures.</a> Differentiation. 76 (5), 454-464 (2008).</li><li>Aligholi, H., Hassanzadeh, G., Gorji, A., Azari, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Biopsy+Method+for+Isolating+Neural+Stem+Cells+from+the+Subventricular+Zone+of+the+Adult+Rat+Brain+for+Autologous+Transplantation+in+CNS+Injuries.">A Novel Biopsy Method for Isolating Neural Stem Cells from the Subventricular Zone of the Adult Rat Brain for Autologous Transplantation in CNS Injuries.</a> Methods in Molecular Biology. 1462, 711-731 (2016).</li><li>Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M., Ansari, S., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+embryonic+mouse+neural+stem+cell+culture+using+the+neurosphere+assay.">Establishing embryonic mouse neural stem cell culture using the neurosphere assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (47), (2011).</li><li>Ferrari, D., Binda, E., De Filippis, L., Vescovi, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+neural+stem+cells+from+neural+tissues+using+the+neurosphere+technique.">Isolation of neural stem cells from neural tissues using the neurosphere technique.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. , (2010).</li><li>Guo, W., Patzlaff, N. E., Jobe, E. M., Zhao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+multipotent+neural+stem+or+progenitor+cells+from+both+the+dentate+gyrus+and+subventricular+zone+of+a+single+adult+mouse.">Isolation of multipotent neural stem or progenitor cells from both the dentate gyrus and subventricular zone of a single adult mouse.</a> Nature Protocols. 7 (2012), (2005).</li><li>Liu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Passage+Number+is+a+Major+Contributor+to+Genomic+Structural+Variations+in+Mouse+iPSCs.">Passage Number is a Major Contributor to Genomic Structural Variations in Mouse iPSCs.</a> Stem Cells and Development. 32 (10), 2657-2667 (2014).</li><li>Diaferia, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+Chromosomal+Analysis+of+Cultured+Mouse+Neural+Stem+Cell+Lines.">Systematic Chromosomal Analysis of Cultured Mouse Neural Stem Cell Lines.</a> Stem Cells and Development. 20 (8), 1411-1423 (2011).</li><li>Hemmer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+Neural+Stem+Cells+Achieve+Long-Term+Survival+and+Functional+Integration+in+the+Adult+Mouse+Brain.">Induced Neural Stem Cells Achieve Long-Term Survival and Functional Integration in the Adult Mouse Brain.</a> Stem Cell Reports. 3 (3), 423-431 (2014).</li><li>Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+Cytometry+Protocols+for+Surface+and+Intracellular+Antigen+Analyses+of+Neural+Cell+Types.">Flow Cytometry Protocols for Surface and Intracellular Antigen Analyses of Neural Cell Types.</a> Journal of Visualized Experiments. (94), 52241 (2014).</li><li>Zhang, Z., Wang, Z., Rui, W., Wu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnesium+lithospermate+B+promotes+proliferation+and+differentiation+of+neural+stem+cells+in+vitro+and+enhances+neurogenesis+in+vivo.">Magnesium lithospermate B promotes proliferation and differentiation of neural stem cells in vitro and enhances neurogenesis in vivo.</a> Tissue and Cell. 53, 8-14 (2018).</li><li>Zilkha-Falb, R., Gurevich, M., Hanael, E., Achiron, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prickle1+as+positive+regulator+of+oligodendrocyte+differentiation.">Prickle1 as positive regulator of oligodendrocyte differentiation.</a> Neuroscience. 364, 107-121 (2017).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodendrocyte+differentiation+from+human+neural+stem+cells:+A+novel+role+for+c-Src.">Oligodendrocyte differentiation from human neural stem cells: A novel role for c-Src.</a> Neurochemistry International. 120, 21-32 (2018).</li><li>Palanisamy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxytocin+alters+cell+fate+selection+of+rat+neural+progenitor+cells+in+vitro.">Oxytocin alters cell fate selection of rat neural progenitor cells in vitro.</a> PLoS ONE. 13 (1), e0191160 (2018).</li><li>Llewellyn-Smith, I. J., Basbaum, A. I., Braz, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term,+dynamic+synaptic+reorganization+after+GABAergic+precursor+cell+transplantation+into+adult+mouse+spinal+cord.">Long-term, dynamic synaptic reorganization after GABAergic precursor cell transplantation into adult mouse spinal cord.</a> Journal of Comparative Neurology. 526 (3), 480-495 (2018).</li><li>Precious, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FoxP1+marks+medium+spiny+neurons+from+precursors+to+maturity+and+is+required+for+their+differentiation.">FoxP1 marks medium spiny neurons from precursors to maturity and is required for their differentiation.</a> Experimental Neurology. 282, 9-18 (2016).</li></ol>

Använda en lämplig källa av neurala stamceller är mycket viktigt för neuroforskare. Neurala stamceller kan skördas från olika områden av hjärnan som embryo och de kan generera specifika typer av neuron och gliaceller. I området i närheten finns det flera metoder för induktion av differentiering av neurala stamceller att förmå dem att generera mogna neuron och gliaceller. Det finns många rapporter som visar att de under specifika odlingsbetingelser och trofiska faktor regementen, kunde generera nervceller<s...

Neurala stamceller (Karolina) bosatta i olika regioner av hjärnan som vuxen och embryo och de har en tendens att generera olika typer av nervceller och glial cell1. De subventrikulära zonerna i vuxna däggdjur hjärnan2 och ganglieblockerande eminens i embryo hjärnan är NSC rika regioner3. I hjärnans utveckling levererar höjd ganglieblockerande de flesta kortikala interneuronen och särskilt GABAergic interneuroner3. Det finns också mindre invasiva metoder för neurala stamceller generation från embryonala stamceller (råden) eller inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) som minskar efterfrågan på djur använder. Trots att generera Karolina från ESCs eller iPSCs är möjligt4,5, har den vissa fördelar och nackdelar jämfört med isolering av neurala stamceller från vuxna eller embryo hjärnan6,7, 8. Protokollen för att inducera differentiering av ekonomiska och sociala råden och iPSCs mot neuronala fenotyper är alltid tid och kostnad konsumerar och graden av framgång (70-80% Nestin positiva celler)5 är lägre jämfört med direkt isolering av Karolina från den djura hjärna ( Mer än 99% Nestin positiva celler)9. Dessutom förlorar stamceller deras genetiska stabilitet och differentiering tendens efter flera passager10,11. Även om det finns andra nya rapporter om direkt omvandling av somatiska celler till Karolina, dessa celler är genetiskt konstruerade och är inte lätt tillgängliga i varje lab12. Därför finns det fortfarande en stor efterfrågan för isolering av neurala stamceller från animaliska hjärnan; Det är möjligt att minska mängden animaliska användning genom att förbättra de kirurgiska teknikerna. Genom att minska det kirurgiska tid och förbättra teknikerna, är det möjligt att hålla celler från skador och erhålla den högsta andelen Karolina från varje djur.
Här introducerar vi en förenklad och reproducerbara teknik för isolering av neurala stamceller från mus E13 embryo hjärna.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:942px;" width="941">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:389px;">15 mL tubes</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">Falcon</td>
			<td dir="LTR" style="width:235px;">352097</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:389px;">50 mL tubes</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">Falcon</td>
			<td dir="LTR">352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:389px;">Adson Forceps, 12 cm, Straight</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">WPI</td>
			<td dir="LTR">14226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:389px;">B27</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">Gibco</td>
			<td dir="LTR" style="width:235px;">17504-44</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:389px;">bFGF</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">Sigma</td>
			<td dir="LTR" style="width:235px;">F0291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:389px;">bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td style="width:235px;">A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;">dish 10cm&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">Falcon</td>
			<td dir="LTR" style="width:235px;">353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:389px;">Dressing Forceps, 12.5 cm, Straight</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">WPI</td>
			<td dir="LTR">15908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;">Dumont Tweezers, 11 cm, Straight</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">WPI</td>
			<td dir="LTR" style="width:235px;">500342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:389px;">EGF</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">Sigma</td>
			<td dir="LTR" style="width:235px;">E9644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;">Ethanol</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">Merck</td>
			<td dir="LTR" style="width:235px;">100983&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:389px;">Glutamate</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">Sigma&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:235px;">G3291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:389px;">Glutamax</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">Gibco</td>
			<td dir="LTR" style="width:235px;">35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:389px;">goat anti rabbit FITC conjugated secondary antibody</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td style="width:235px;">AP307F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:389px;">goat serum</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td style="width:235px;">G9023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;">Heparin&#160;&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">Sigma</td>
			<td dir="LTR" style="width:235px;">h3149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:389px;">HEPES</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">Sigma</td>
			<td dir="LTR" style="width:235px;">83264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:389px;">HEPES</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">Sigma</td>
			<td dir="LTR">90909C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;">insulinsyringe with 25-27 gauge Needle&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">SUPA medical</td>
			<td dir="LTR">A1SNL127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:389px;">laminin</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">sigma&#160;&#160;&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:235px;">L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td dir="LTR" height="26" style="height:26px;width:389px;">MEM</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">Sigma</td>
			<td dir="LTR" style="width:235px;">M2279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td dir="LTR" height="26" style="height:26px;width:389px;">N2 supplement</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">Gibco</td>
			<td dir="LTR" style="width:235px;">17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:389px;">NB medium</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">Gibco</td>
			<td dir="LTR" style="width:235px;">21103-31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:389px;">Non-essential amino acid (NEAA)</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">Gibco</td>
			<td dir="LTR" style="width:235px;">11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:389px;">PBS without Ca and Mg</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">Gibco</td>
			<td dir="LTR">20012050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:389px;">Penicilin/ Streptomycin</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">Gibco</td>
			<td dir="LTR" style="width:235px;">5140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:389px;">Poly-L-ornithine</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">Sigma</td>
			<td dir="LTR" style="width:235px;">&#160;P4957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:389px;">rabbit anti mouse beta tubulin-III antibody</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td style="width:235px;">T2200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:389px;">rabbit anti mouse GFAP antibody</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td style="width:235px;">G4546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:389px;">rabbit anti mouse Nestin antibody</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td style="width:235px;">N5413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:389px;">Scalpel Handle #3</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">WPI</td>
			<td dir="LTR">500236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;">Scissors curve</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">WPI</td>
			<td dir="LTR" style="width:235px;">14396</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:389px;">Scissors sharp straight</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">WPI</td>
			<td dir="LTR">14192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;">Soybean trypsin inhibitor</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">Roche</td>
			<td dir="LTR" style="width:235px;">10109886001&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;">Tissue culture flasks, T25</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">BD</td>
			<td dir="LTR" style="width:235px;">353014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;">Tissue culture flasks, T75</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">BD</td>
			<td dir="LTR" style="width:235px;">353024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:389px;">Tween 20</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td style="width:235px;">P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;">Vannas Scissors,&#160; 8 cm, Straight&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">WPI</td>
			<td>14003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:389px;">&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td dir="LTR" style="width:145px;">Sigma</td>
			<td dir="LTR">M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and culture of embryonic mouse neural stem cells

Neurala stamceller (Karolina) är multipotenta och kan ge upphov till de tre stora cell typerna av centrala nervsystemet (CNS). In vitro kultur och expansion av Karolina ger en lämplig källa av celler för neuroforskare att studera funktionen av neuron och gliaceller tillsammans med deras interaktioner. Det finns flera rapporterade metoder för isolering av neurala stamceller från vuxna eller embryo däggdjurs hjärnor. Under den mikrokirurgisk operationen för att isolera Karolina från olika regioner av embryonala CNS, är det mycket viktigt att minska skadan hjärncellerna att erhålla den högsta andelen av levande och utbyggbart stamceller. En möjlig teknik för stressreducering under isolering av dessa celler från mus embryo hjärnan är minskning av kirurgisk tid. Här visar vi en utvecklad teknik för snabb isolering av dessa celler från den E13 mus embryo ganglieblockerande eminens. Kirurgiska ingrepp inkluderar skörd E13 musembryon från livmodern, skära den främre fontanellen av embryot med en böjd nål spets, extrahera hjärnan från skallen, lokalt av isolerade hjärnan att skörda den ganglieblockerande eminens, dissociation skördade vävnaden i NSC medium att få en enda cellsuspension, och slutligen plätering celler i suspension kultur att generera neurospheres.

Micro-dissektion, Cell isolering och Neurosphere kultur. Här presenterade vi en snabb och effektiv metod för musen E13 hjärnan mikrokirurgi och isolering av neurala stamceller. Denna artikel visar att det är möjligt att ta bort hela hjärnan från en E13 mus embryo skallen genom en fin bristning i främre fontanell. Med den här metoden hjärnan tål mindre skada och det är möjligt att isolera cellerna från olika delar av hjärnan. De skörda...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Embryonic Mouse Neural Stem Cells at JoVE.com

Isolation and Culture of Embryonic Mouse Neural Stem Cells

Här introducerar vi en ny mikrokirurgisk teknik för isolering av neurala stamceller från E13 mus embryo ganglieblockerande höjd.

Isolering och kultur av embryonala mus neurala stamceller

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and ...

Syftet med denna video protokoll är att upprätta en källa och effektivt protokoll för embryonal mus neuralstamcell isolering och kultur. Hej, jag är Maryam Sadeghi-Zadeh. Jag är masterstudent i cell- och molekylärbiologi i Royan-institutet.Idag vill jag och min kollega visa dig hur man skördar neural stamcell från 13 embryomus ganglionic eminens. Hej, jag är Bahareh Alizadeh-Shoorjestan. Jag är masterstudent för cell- och molekylärbiologi i stamcellsavdelningen vid Royan Institute for Biotechnology.Hej, jag är Reza Dehghani-Varnamkhasti. Även jag studerar Cell- och molekylärbiologi i Royan Institute. Kirurgiska ingrepp inkluderar skörd varje 13 mus embryon från livmodern.Skära framsidan av fontanel av embryo med en böjd nål spets extrahera hjärnan från skallen. Mikro-dissektion av isolerade hjärnan att skörda den ganglionic eminens. Dissociation av den skördade vävnaden i ett neuralt stamcellsmedium för att få en enda cell suspension.Och slutligen, plätering celler i en suspension kultur för att generera nervceller. Rengör och desinfektionsmedel huden av buken området genom att spraya med 70%etanol. Kontrollera huden uppåt buken och sedan klippa huden och understrukna ansiktsbehandling med sax för att avslöja bukhålan och livmoderhorn.Avlägsna livmoderhornen som innehåller embryona med en sax och överför dem till ett koniskt rör på 50 ml som innehåller 25 ml kall HEPES MEM-buffert. Placera det koniska röret under laminalflödeshuven. Öppna locket under huven.Ta ut livmoderhornen från röret och skölj tre gånger med tillräckligt med volym av den färska kalla HEPES MEM-bufferten för att eliminera skräp och blod. Överför livmodervävnaden till en 10 cm petriskål som innehåller 7 till 10 ml kall HEPES MEM-buffert. Öppna livmoderhornen med hjälp av fin sax och överför embryon till en ny rätt som innehåller 7 till 10 ml kall HEPES MEM-buffert.Nu sätter 10 cm skålen med embryon under dissekera mikroskop för mikroskopoperation. Böj spetsen på en sprutnål genom att trycka dess spets på ett skalpellbladshandtag av stål. Böj nålspetsen tills spetsen är böjd i en vinkel på 70 till 90 grader.Kontrollera nålspetsen under det dissekerande mikroskopet för att se böjen vid nålspetsen. Naturligtvis embryon har en lateral ställning i detta. Utan att ändra sin position, höll halsen och kroppen av embryot med fina tärningar och sedan för in den böjda delen av nålen djupt in i framsidan av fontanel av embryohuvudet.Det skulle vara en liten blödning eller en blodpropp där. Flytta nålspetsen ytligt medan den böjda delen är inne i utbuktning mot pannan och sedan mot bakhuvudet. Se till att skära igenom huden och skallen, och inte att skada den underliggande hjärnan.Tryck huden med nålspetsen i laterled för att avslöja hjärnan. Sätt in nålen från laterala sidan av huden till under ramen från den laterala sidan av huden till området under hjärnan. Och ta sedan bort hjärnan från denna hårbotten genom att trycka den för att komma ut från dissekerade skallen.Den ganglionic eminens visas tydligt i video med dess mediala och laterala delar. Höll hjärnan stadigt med hjälp av vårdtens tärna och sedan använda mikroscissorer för att skära hjärnhalkens cortex för att exponera den ganglionic eminens. Höll hjärnan och placera dissekeras ganglionic eminens i 15 ml centrifug röret som innehåller neurala stamcellsmedia.Upprepa detta förfarande tills alla hjärnan har mikro-dissekeras. Skär dissekeras ganglionic eminens genom att placera pipetten spets mot botten av röret och pipetter suspensionen upp och ner för 2 5 gånger för att bryta upp vävnaden för att få en enda cell suspension. Centrifugera suspensionen vid 110 g i 5 minuter.Ta bort supernatanten och resuspend cellerna i 1 ml 0,05%-tub i EDTA. Inkubera cellen suspension i en 37 grader Celsius i 10 minuter. Och sedan lägga till en motsvarande volym sojabönor trypsin inhibitor för att stoppa trypsin aktivitet.Pipettera cellupphängningen upp och ner för att se till att trypsin har varit helt inaktiverad. Centrifugera cellupphängningen vid 110 g i 5 minuter. Ta bort supernatanten och resuspend cellerna i 1 ml komplett neurala stamceller medium och räkna antalet celler.Platta cellerna på neurala stamceller medium i lämplig storlek vävnad kulturodling kolv. Överför 5 ml 2T25, 20 ml till T75, och 40 ml till T175 kolvar. Neurospheres kommer att visas efter 3 dagar kultur vid 37 grader Celsius i en befuktad inkubator med 5%CO2.Att suga kultur neurosfärerna, överföra mediet med suspenderade neurospheres till centrifug till centrifug vid 110 g i 5 minuter, och sedan kassera supernatant. Vid 1 ml av 0,05%trypsin EDTA och inkubera på 37 grader Celsius i 10 minuter. Inaktivera sedan trypsin med hjälp av sojaben tyrpsinhämmare och pipetter neurosfärerna försiktigt upp och ner för att göra dem enstaka celler.Centrifugera cellupphängningen vid 110 g i 5 minuter. Kassera supernatanten och resuspend cellerna i 1 ml av neurala stamceller medium. Dessa celler är redo för nästa steg kultur eller kultur på laminat och helt belagd yta för avancerade experiment.Genom att odla en miljon primära neurala stamceller efter sju dagar antalet celler kommer att öka till tre till fyra miljoner. Efter sex till sju dagar sfärerna bör mäta mellan 150 till 200 mikrometer i diameter och kommer att vara redo för sub kultur på laminat poly ornitin belagda rätter i avsaknad av bFGF och EGF för neuronal differentiering. Flow cytometry analysresultat visar att nära 95%av celler som utgör neurosfärerna var Nestin positiva vilket är en känd markör för neurala stamceller.Analyser med hjälp av beta tubulin III och ganglio fibrösa protein antikroppar avslöjar att genom att odla neurala stamceller på belagda ytan runt 94%visas neuronal fenotyp och runt 5%visa gliamokulatiska fenotyp. I just denna korta video ett labb teknik för snabb isolering av neural stamcell från 13 mus embryo ganglionic eminens. Jag hoppas att du kommer att bli framgång i din neurala stamcellskultur.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Dissektion och kultur commissural neuroner från embryonala ryggmärg

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

Isolering och utvidgning av den vuxna Mouse neurala stamceller Använda Neurosphere analys

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay

Etablera Embryonala Mus Neurala Kultur Stem Cell Använda Neurosphere analys

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life ...

Isolation and Culture of Neural Crest Stem Cells from Human Hair Follicles

Isolering och odling av neurala celler Crest härrör från mänskliga hårsäckar

Hair follicles undergo lifelong growth and hair cycle is a well-controlled process involving stem cell proliferation and quiescence. Hair bulge is a ...

Lectin-based Isolation and Culture of Mouse Embryonic Motoneurons

Lektin-baserade isolering och odling av mus Embryonala Motoneurons

Spinal motoneurons develop towards postmitotic stages through early embryonic nervous system development and subsequently grow out dendrites and axons. ...

Isolation and Culture of Rat Embryonic Neural Cells: A Quick Protocol

Isolering och kultur råttembryonala neurala celler: En snabb protokoll

We are describing a quick method to dissociate and culture hippocampal or cortical neurons from E15-17 rat embryos. The procedure can be applied ...

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Utbyggnad av embryonala och vuxna neurala stamceller genom<em&gt; I Utero</em&gt; Elektroporering eller viral stereotaxisk injektion

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

Isolering och odling av neurallistceller från embryonala Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

Isolering och odling av endotelceller från embryonal framhjärnan

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice

En mus, två kulturer: isolering och odling av vuxna neurala stamceller från de två neurogen zoner Individuell möss

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult ...