Name: novel sequence discovery by subtractive genomics
Uploaded: 2019-01-25T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Novel Sequence Discovery by Subtractive Genomics at JoVE.com

Författarna erkänner Michelle Biedermans, Alyssa Pedersen och Colin J. Saldanha för deras hjälp med zebra Fink genomik projektets olika skeden. Vi erkänner också Evgeny Bisk för computing cluster systemadministration och NIH grant 1K22CA184297 (till J.R.B.) och NIH NS 042767 (till C.J.S).

1. de novo montera start sekvens
Obs: Nästa generations sekvens (NGS) data kan användas, så länge en församling kan produceras från dessa data. Lämpliga indata innehåller Illumina, PacBio, eller Oxford Nanopore läser monterade in en fasta fil. För konkretion, det här avsnittet beskrivs en Illumina-baserade transcriptomic församling specifika för zebra Fink studien vi utfört7; dock vara medveten om att detaljerna varierar beroende på projektet. För...

<ol>
	<li>Barh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Comparative+Genomics+Analysis+for+Common+Drug+and+Vaccine+Targets+in+Corynebacterium+pseudotuberculosis+and+other+CMN+Group+of+Human+Pathogens.">A Novel Comparative Genomics Analysis for Common Drug and Vaccine Targets in Corynebacterium pseudotuberculosis and other CMN Group of Human Pathogens.</a> Chemical Biology &amp; Drug Design. 78 (1), 73-84 (2011).</li><li>Sarangi, A. N., Aggarwal, R., Rahman, Q., Trivedi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subtractive+Genomics+Approach+for+in+Silico+Identification+and+Characterization+of+Novel+Drug+Targets+in+Neisseria+Meningitides+Serogroup+B.">Subtractive Genomics Approach for in Silico Identification and Characterization of Novel Drug Targets in Neisseria Meningitides Serogroup B.</a> Journal of Computer Science &amp; Systems Biology. 2 (5), (2009).</li><li>Kaur, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Druggable+Targets+for+Acinetobacter+baumannii+Via+Subtractive+Genomics+and+Plausible+Inhibitors+for+MurA+and+MurB.">Identification of Druggable Targets for Acinetobacter baumannii Via Subtractive Genomics and Plausible Inhibitors for MurA and MurB.</a> Applied Biochemistry and Biotechnology. 171 (2), 417-436 (2013).</li><li>Rathi, B., Sarangi, A. N., Trivedi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+subtraction+for+novel+target+definition+in+Salmonella+typhi.">Genome subtraction for novel target definition in Salmonella typhi.</a> Bioinformation. 4 (4), 143-150 (2009).</li><li>Epstein, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+GBV-D,+a+Novel+GB-like+Flavivirus+from+Old+World+Frugivorous+Bats+(Pteropus+giganteus)+in+Bangladesh.">Identification of GBV-D, a Novel GB-like Flavivirus from Old World Frugivorous Bats (Pteropus giganteus) in Bangladesh.</a> PLoS Pathogens. 6 (7), (2010).</li><li>Kapoor, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Rodent+Homologs+of+Hepatitis+C+Virus+and+Pegiviruses.">Identification of Rodent Homologs of Hepatitis C Virus and Pegiviruses.</a> MBio. 4 (2), (2013).</li><li>Biederman, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+the+First+Germline-Restricted+Gene+by+Subtractive+Transcriptomic+Analysis+in+the+Zebra+Finch,+Taeniopygia+guttata.">Discovery of the First Germline-Restricted Gene by Subtractive Transcriptomic Analysis in the Zebra Finch, Taeniopygia guttata.</a> Current Biology. 28 (10), 1620-1627 (2018).</li><li>Readhead, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiscale+Analysis+of+Independent+Alzheimer's+Cohorts+Finds+Disruption+of+Molecular,+Genetic,+and+Clinical+Networks+by+Human+Herpesvirus.">Multiscale Analysis of Independent Alzheimer's Cohorts Finds Disruption of Molecular, Genetic, and Clinical Networks by Human Herpesvirus.</a> Neuron. 99, 1-19 (2018).</li><li>Carroll, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+global+virome+project.">The global virome project.</a> Science. 359 (6378), 872-874 (2016).</li><li>Pigozzi, M. I., Solari, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germ+cell+restriction+and+regular+transmission+of+an+accessory+chromosome+that+mimics+a+sex+body+in+the+zebra+finch.+Taeniopygia+guttata.">Germ cell restriction and regular transmission of an accessory chromosome that mimics a sex body in the zebra finch. Taeniopygia guttata.</a> Chromosome Research. 6, 105-113 (1998).</li><li>Itoh, Y., Kampf, K., Pigozzi, M. I., Arnold, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cloning+and+characterization+of+the+germline-restricted+chromosome+sequence+in+the+zebra+finch.">Molecular cloning and characterization of the germline-restricted chromosome sequence in the zebra finch.</a> Chromosoma. 118, 527-536 (2009).</li><li>Warren, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genome+of+a+songbird.">The genome of a songbird.</a> Nature. 464, 757-762 (2010).</li><li>Balakrishnan, C. N., Lin, Y. C., London, S. E., Clayton, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAseq+transcriptome+analysis+of+male+and+female+zebra+finch+cell+lines.">RNAseq transcriptome analysis of male and female zebra finch cell lines.</a> Genomics. 100, 363-369 (2012).</li><li>Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trimmomatic:+a+flexible+trimmer+for+Illumina+sequence+data.">Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data.</a> Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).</li><li>Zhang, J., Kobert, K., Flouri, T., Stamatakis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PEAR:+a+fast+and+accurate+Illumina+Paired-End+reAd+mergeR.">PEAR: a fast and accurate Illumina Paired-End reAd mergeR.</a> Bioinformatics. 30, 614-620 (2014).</li><li>Yang, X., Dorman, K. S., Aluru, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reptile:+representative+tiling+for+short+read+error+correction.">Reptile: representative tiling for short read error correction.</a> Bioinformatics. 26, 2526-2533 (2010).</li><li>MacManes, M. D., Eisen, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+transcriptome+assembly+through+error+correction+of+high-throughput+sequence+reads.">Improving transcriptome assembly through error correction of high-throughput sequence reads.</a> PeerJ. 1 (113), (2013).</li><li>Grabherr, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Full-length+transcriptome+assembly+from+RNA-seq+data+without+a+reference+genome.">Full-length transcriptome assembly from RNA-seq data without a reference genome.</a> Nature Biotechnology. 29, 644-652 (2011).</li><li>Li, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aligning+sequence+reads,+clone+sequences+and+assembly+contigs+with+BWA-MEM.">Aligning sequence reads, clone sequences and assembly contigs with BWA-MEM.</a> arXiv. , (2013).</li><li>Langmead, B., Salzberg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2.">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nature Methods. 9, 357-359 (2012).</li><li>Kearse, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geneious+Basic:+an+integrated+and+extendable+desktop+software+platform+for+the+organization+and+analysis+of+sequence+data.">Geneious Basic: an integrated and extendable desktop software platform for the organization and analysis of sequence data.</a> Bioinformatics. 28 (12), 1647-1649 (2012).</li><li>Peirson, S. N., Butler, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+polymerase+chain+reaction.">Quantitative polymerase chain reaction.</a> Methods in Molecular Biology. 362, 349-362 (2007).</li><li>Hunt, M., Kikuchi, T., Sanders, M., Newbold, C., Berriman, M., Otto, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=REAPR+citation:+REAPR:+a+universal+tool+for+genome+assembly+evaluation.">REAPR citation: REAPR: a universal tool for genome assembly evaluation.</a> Genome Biology. 14 (5), (2013).</li><li>Meyer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mitochondrial+genome+sequence+of+a+hominin+from+Sima+de+los+Huesos.">A mitochondrial genome sequence of a hominin from Sima de los Huesos.</a> Nature. 505 (7483), 403-406 (2013).</li><li>Gunnarsd&#243;ttir, E. D., Li, M., Bauchet, M., Finstermeier, K., Stoneking, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+sequencing+of+complete+human+mtDNA+genomes+from+the+Philippines.">High-throughput sequencing of complete human mtDNA genomes from the Philippines.</a> Genome Research. 21 (1), 1-11 (2010).</li><li>King, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-quality+and+high-throughput+massively+parallel+sequencing+of+the+human+mitochondrial+genome+using+the+Illumina+MiSeq.">High-quality and high-throughput massively parallel sequencing of the human mitochondrial genome using the Illumina MiSeq.</a> Forensic Science International: Genetics. 12, 128-135 (2014).</li><li>Yao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+First+Complete+Chloroplast+Genome+Sequences+in+Actinidiaceae:+Genome+Structure+and+Comparative+Analysis.">The First Complete Chloroplast Genome Sequences in Actinidiaceae: Genome Structure and Comparative Analysis.</a> Plos One. 10 (6), (2015).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Complete+Chloroplast+Genome+Sequences+of+Five+Epimedium+Species:+Lights+into+Phylogenetic+and+Taxonomic+Analyses.">The Complete Chloroplast Genome Sequences of Five Epimedium Species: Lights into Phylogenetic and Taxonomic Analyses.</a> Frontiers in Plant Science. 7, (2016).</li><li>Swart, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Oxytricha+trifallax+Mitochondrial+Genome.">The Oxytricha trifallax Mitochondrial Genome.</a> Genome Biologyogy and Evolution. 4 (2), 136-154 (2011).</li><li>Barth, D., Berendonk, T. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+genome+sequence+of+the+ciliate+Paramecium+caudatum+reveals+a+shift+in+nucleotide+composition+and+codon+usage+within+the+genus+Paramecium.">The mitochondrial genome sequence of the ciliate Paramecium caudatum reveals a shift in nucleotide composition and codon usage within the genus Paramecium.</a> BMC Genomics. 12 (1), (2011).</li><li>Coombe, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+the+Complete+Sitka+Spruce+Chloroplast+Genome+Using+10X+Genomics'+GemCode+Sequencing+Data.">Assembly of the Complete Sitka Spruce Chloroplast Genome Using 10X Genomics' GemCode Sequencing Data.</a> Plos One. 11 (9), (2016).</li><li>Herschleb, J., Ananiev, G., Schwartz, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulsed-field+gel+electrophoresis.">Pulsed-field gel electrophoresis.</a> Nature Protocols. 2 (3), 677-684 (2007).</li></ol>

Även subtraktiv genomik är kraftfull, är det inte ett kakmått tillvägagångssätt, som kräver anpassning på flera viktiga steg, och noggrant urval av referens sekvenser och prover. Om den fråga församlingen är av dålig kvalitet, kan filtrering steg bara isolera församlingen artefakter. Det är därför viktigt att noggrant verifiera de novo församlingen med en lämplig validering protokollet till det specifika projektet. För RNA-seq anges riktlinjer Trinity webbplats18 och D...

Syftet med denna metod är att identifiera en roman mål (T) genomiska sekvensen, antingen DNA eller RNA, från en genomisk sammanhang eller referens (R) (figur 1). Metoden är mest användbar om målet inte kan separeras fysiskt, eller om det skulle vara dyrt att göra så. Endast några organismer har perfekt klar genomen för subtraktion, så en viktig innovation i vår metod är kombinationen av computational och bänk metoder i en cykel som gör det möjligt för forskare att isolera mål sekvenser när referensen är ofullkomlig, eller ett utkast genomet från en icke-modell organism. I slutet av en cykel används qPCR tester för att avgöra om mer subtraktion behövs. En validerad kandidat T sekvens visar statistiskt större upptäckt i kända T-positiva prover av qPCR.
Inkarnationer av metoden har genomförts i upptäckten av nya bakteriell målmolekyler som inte har host homologs1,2,3,4 och identifiering av nya virus från infekterade värdar 5,6. Förutom identifiering av T, kan metoden förbättra R: vi nyligen använde metoden för att identifiera 936 saknade gener från zebra Fink referens genomet och en ny gen från en endast könsceller-kromosom (T)7. Subtraktiv genomik är särskilt värdefullt när T kommer sannolikt att vara extremt avvikande från kända sekvenser eller när T identitet är i stort sett odefinierad, liksom den zebra Fink könsceller-begränsad kromosom7.
Genom att inte kräva positiv identifiering av T i förväg, är en viktig fördel av subtraktiv genomik att det är opartisk. I en färsk studie undersökte Readhead et al. förhållandet mellan Alzheimers sjukdom och viral överflöd i fyra regioner i hjärnan. För viral identifiering, Readhead et al. skapat en databas med 515 virus8, starkt begränsa viral agenter som deras studie kunde identifiera. Subtraktiv genomik kunde ha använts till jämföra den friska och Alzheimers genomen för att isolera möjliga nya virus som förknippas med sjukdomen, oavsett deras likhet med kända smittämnen. Medan det finns 263 kända mänskliga-targeting virus, har det uppskattats att omkring 1,67 miljoner oupptäckta viral arter finns, med 631,000-827,000 av dem har en potential att infektera människor9.
Isolering av romanen virus är ett område där subtraktiv genomik är särskilt effektiv, men vissa studier kan inte behöva sådan stränga metod. Exempelvis transkribera studier identifiera nya virus har använt opartisk hög genomströmning sekvensering följt av omvänd Transkription och BLASTx för viral sekvenser5 eller berikande av viral nukleinsyra till extraktet och omvänd viral sekvenser 6. dessa studier anställd de novo sekvensering och montering, subtraktion användes inte eftersom målet sekvenser identifierades positivt genom BLAST. Om virus var helt ny och inte relaterade (eller avlägset besläktade) till andra virus, subtraktiv genomik skulle ha varit en användbar teknik. Fördelen med subtraktiv genomik är att sekvenser som är helt ny kan erhållas. Om organismens arvsmassa är känd, kan det dras ut för att lämna någon viral sekvenser. Till exempel i våra publicerade studien isolerat vi en viral romanserie från zebra Fink genom subtraktiv genomik, om det inte var vår ursprungliga avsikt7.
Subtraktiv genomik har också visat sig användbart vid identifiering av bakteriella vaccin mål, motiveras av den dramatiska ökningen antibiotikaresistens1,2,3,4. För att minimera risken för autoimmun reaktion, forskare minskat ner de potentiella vaccin mål genom att subtrahera några proteiner som har homologs i den mänskliga värden. En särskild studie, Corynebacterium pseudotuberculosis, utförs subtraktion av vertebrate värd genomen från flera bakteriella genomer att säkerställa att möjliga läkemedelsmål inte skulle påverka proteiner i filen hosts som leder till biverkningar 1. grundläggande arbetsflödet av dessa studier är att hämta det bakteriella proteomet, avgöra viktiga proteiner, ta bort överflödiga proteiner, använda BLASTp att isolera de viktiga proteinerna och BLASTp mot värd proteomet att ta bort några proteiner med värd homologs 1 , 2 , 3 , 4. I det här fallet subtraktiv genomik säkerställa att vaccinerna utvecklas inte har någon off-target effekter värd1,2,3,4.
Vi brukade subtraktiv genomik identifiera första protein-kodning genen på en könsceller-begränsad kromosom (GRC) (i detta fall, T), som finns i germlines men inte somatisk vävnad av båda könen10. Innan denna studie var den bara genomisk information som var känt om GRC en upprepande region11. De novo montering utfördes på RNA sekvenserade från äggstocken och teste vävnader (T + R) från vuxen zebra finkar. Computational eliminering av sekvenser utfördes med hjälp av publicerade somatiska (muskel) genome sequence (R1)12, dess raw (Sanger) läsa data (R2) och en somatisk (hjärnan) transkriptom (R3)13. Sekventiell användning av tre referenser drevs av den qPCR testning på steg 5 av varje cykel (figur 2A), visar att ytterligare filtrering krävdes. Den upptäckta α-SNAP-genen bekräftades genom qPCR från DNA och RNA, och kloning och sekvensering. Vi visar i vårt exempel att metoden är flexibel: det är inte beroende av matchande nukleinsyror (DNA vs RNA) och det subtraktion kan utföras med referenser (R) som består av församlingar eller raw-läsningar.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:499px;" width="498">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Accustart II Taq DNA Polymerase</td>
			<td style="width:65px;">Quanta Bio</td>
			<td align="right" style="width:52px;">95141</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Blasic Local Alignment Search Tool (BLAST)</td>
			<td style="width:65px;"></td>
			<td style="width:52px;"></td>
			<td>https://github.com/trinityrnaseq/trinityrnaseq/wiki/Transcriptome-Assembly-Quality-Assessment</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Bowtie 2</td>
			<td style="width:65px;"></td>
			<td style="width:52px;"></td>
			<td>https://www.python.org/download/releases/2.7/</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">BWA-MEM v. 0.7.12</td>
			<td style="width:65px;"></td>
			<td style="width:52px;"></td>
			<td>https://github.com/BenLangmead/bowtie2</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Geneious</td>
			<td style="width:65px;"></td>
			<td style="width:52px;"></td>
			<td>https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">PEAR v. 0.9.6</td>
			<td style="width:65px;"></td>
			<td style="width:52px;"></td>
			<td>http://www.mybiosoftware.com/reptile-1-1-short-read-error-correction.html</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Personal Computer</td>
			<td style="width:65px;">Biomatters</td>
			<td style="width:52px;"></td>
			<td>http://www.geneious.com/</td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:215px;">PowerSYBR qPCR mix</td>
			<td style="width:65px;">ThermoFisher</td>
			<td align="right" style="width:52px;">4367659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Python v. 2.7</td>
			<td style="width:65px;"></td>
			<td style="width:52px;"></td>
			<td>https://sco.h-its.org/exelixis/web/software/pear/</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Reptile v.1.1</td>
			<td style="width:65px;"></td>
			<td style="width:52px;"></td>
			<td>https://alurulab.cc.gatech.edu/reptile</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:215px;">Stratagene Mx3005P</td>
			<td style="width:65px;">Agilent Technologies</td>
			<td align="right" style="width:52px;">401456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">TransDecoder v. 3.0.1</td>
			<td style="width:65px;"></td>
			<td style="width:52px;"></td>
			<td>https://sourceforge.net/projects/bio-bwa/files/</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Trinity v. 2.4.0</td>
			<td style="width:65px;"></td>
			<td style="width:52px;"></td>
			<td>https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/wiki</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

novel sequence discovery by subtractive genomics

Subtraktiv genomik kan användas i någon forskning där målet är att identifiera sekvensen i en gen, protein eller allmänna region som är inbäddad i ett större genomisk sammanhang. Subtraktiv genomik gör det möjligt för forskare att isolera en target sekvens av intresse (T) genom omfattande sekvensering och subtrahera ut kända genetiska element (referens, R). Metoden kan användas för att identifiera nya sekvenser såsom mitokondrier, kloroplaster, virus eller könsceller begränsad kromosomer, och är särskilt användbart när T inte kan enkelt isoleras från R. börjar med omfattande genomisk data (R + T), metoden använder grundläggande lokala Alignment Search Tool (BLAST) mot en referens sekvens eller sekvenser, ta bort matchande kända sekvenser (R), lämnar bakom målet (T). För subtraktion fungerar bäst, bör R vara ett relativt komplett utkast som saknar T. Sedan sekvenser kvar efter subtraktion testas genom kvantitativa Polymerase Chain Reaction (qPCR), behöver R inte vara komplett för metoden att arbeta. Här länkar vi computational steg med experimentella kliver in i en cykel som kan vara upprepade behövs, sekventiellt ta bort flera referens sekvenser och förfina sökningen efter T. Fördelen med subtraktiv genomik är att en helt ny mål-sekvens kan identifieras även i fall där fysisk rening är svårt, omöjligt eller dyrt. En nackdel med metoden är att hitta en lämplig referens för subtraktion och erhålla T-positiva och negativa kontrollprover qPCR. Vi beskriver våra genomförandet av metoden i identifiering av den första genen från könsceller-begränsad kromosomen av zebra Fink. I så fall computational filtrering inblandade tre referenser (R), sekventiellt bort över tre cykler: en ofullständig genomisk församling, genomisk rådata och transcriptomic data.

Efter löpande BLAST, kommer att utdatafilen ha en lista med sekvenser från frågan som matchar databasen. Efter Python subtraktion, kommer ett antal meddelandet sekvenser vara erhållits, och testats av qPCR. Resultat av detta och nästa steg, diskuteras nedan.
Negativt resultat. Det finns två möjliga negativa resultat som kan ses efter BLAST till sekvensen referens. Det kan finnas utan BLAST resultat, vilke...

Watch this Scientific Journal Video about Novel Sequence Discovery by Subtractive Genomics at JoVE.com

Novel Sequence Discovery by Subtractive Genomics

Romanserie upptäckten av subtraktiv genomik

Syftet med detta protokoll är att använda en kombination av computational och bänk forskning för att hitta nya sekvenser som inte kan lätt separeras från en co renande sekvens, som kan vara endast delvis kända.

Subtractive genomics can be used in any research where the goal is to identify the sequence of a gene, protein, or general region that is embedded in a ...

Vårt protokoll är betydande eftersom det kan användas för att identifiera genomiska sekvenser som inte kan isoleras från co-renande sekvenser, som själva kan själva endast delvis kända. De största fördelarna med denna teknik är att det är billigt, med mestadels fri programvara som kan laddas ner samt flexibel. Du kan tillämpa den på många biologiska frågor.Potentiella tillämpningar inkluderar att identifiera bakteriella vaccinmål och identifiera virus vars sekvenser skiljer sig extremt från kända mikrober. Denna metod kan tillämpas på alla system där det okända inte kan vara experimentellt åtskilda, så länge referenssekvensen utan det genomiska målet är tillgänglig. Denna teknik tar några trial and error, så tålamod är viktigt.Du kan behöva problem skjuta programmen. Du får använda program som skiljer sig från de vi beskriver här. Använd bruksanvisningen så mycket som möjligt.Visuell demonstration av den här metoden är till hjälp eftersom beräkningsarbetet är beroende av en grundläggande förståelse för hur kommandoradsprogrammering är strukturerad. Till att börja med använder du Trimmomatic 0.32 för att ta bort illumina-adaptrar och lågkvalitetsbaser. Använd Pear version 0.9.11 för att skapa högkvalitativa sammanslagna läsningar från trimomatiska utdataparade läsningar med hjälp av standardparametrar.Använd sedan Reptil version 1.1 till fel korrigera läsningar som produceras genom Päron. Slutligen använda Trinity version 2.4.0 i standardläge för att montera de korrigerade sekvenser. För strandspecifika bibliotek, använd SS_lib_type parametern.Utdata är en FASTA-fil som kommer att placeras i en ny katalog som kallas trinity_output. Gör en BLAST-databas över referenssekvensen nucleotide_reference. fasta på kommandoraden.BLAST matchade frågan som har monterats mot referensdatabasen. Om du vill skaffa en utdatafil använder du BLAST_results. txt För att generera tabellform utgång krävs för delsekvens bearbetningssteg med Python skript, använd outfmt 6 För ökad stringens, använd protein sekvenser från sammansättningen som BLAST-frågan med översatt nukleotid BLAST, som utför sexvägs översättning av nukleotid databasen.För att erhålla proteinsekvenser för frågan kör du TransDecodern. Kommandot Long0rfs för att identifiera de längsta öppna läsbildrutorna från monterade frågesekvenser. Kör nu tblastn.Om det behövs, säkerställa att rätt genetisk kod väljs för den organism som studeras med hjälp av db_gencode med lämplig kod alternativ. Om en högkvalitativ proteinreferens finns tillgänglig, använd protein-proteinmatchning med blastp snarare än tblastn Gör en BLAST-databas av proteinreferensen. Se till att spara resultatet som en fil för nedströms bearbetning, och använda tabellform utdata för att säkerställa python-skript kan tolka dem korrekt.Nu använder subtraktiv Python-skriptet för att ta bort eventuella matchande sekvenser. Om du vill kartlägga läsningar på sammansättningen, använd BWA-MEM Version 0.7.12 eller bowtie 2 för att kartlägga de nedladdade råläsningar på frågan sammansättningen. Först indexera sammansättningen, sedan kartan läsningar.Utdata kommer att vara SAM-format. Kör Python-skriptet removeUnmapped. py med hjälp av SAM-filen som indata.Detta identifierar namnen på frågesekvenser utan några matchande läsningar och sparar dem i en ny textfil. Utdata från föregående steg är en lista med sekvenser namn i en txt-fil. Extrahera en FASTA-fil med dessa sekvenser.Utdata kommer att vara en fasta-fil. Använd Genius för att bestämma optimal primer sekvenser manuellt. Markera en kandidat sekvens av 21 till 28 baspar för framåt primer, undvika körningar av fyra eller fler av någon bas.Försök att rikta en region med en ganska enhetlig kombination av alla baspar. En enda G eller C vid tre Prime End är fördelaktigt, hjälper till att förankra primern. Klicka på fliken Statistik på höger sida av skärmen för att visa den sekvensens beräknade smälttemperatur när kandidatregionen markeras.Sikta på en smälttemperatur mellan 55 och 60 grader Celsius, samtidigt som du undviker upprepningar, och långa körningar av G C.Välj en omvänd primer på samma sätt, belägen 150 till 250 baspar tre primer av den främre primern. Medan primerlängderna inte behöver matcha, bör den förutspådda smälttemperaturen vara så nära som möjligt till den för framåt primer. Var noga med att vända komplettera sekvensen genom att högerklicka i Genius medan en sekvens är markerad i ett menyalternativ.En alternativ metod är att använda funktionen Primer Design, som återfinns i det övre verktygsfältet i fönstret Sekvens. Infoga regionen för att förstärka under Målregion. Under fliken egenskaper, infoga önskad storlek, smälttemperatur och procent G C, klicka sedan på OK för att få primers genereras.För att utföra kvantitativ PCR-validering av den återstående sekvensen, först förbereda en reaktionsblandning för varje mall i tre exemplar, med vår SYBR Green Master Mix, framåt och omvänd primers, och vatten, för en total volym på 25 mikroliter. Kör ett qPCR-program som informeras av den tidigare validerade temperaturen och förlängningstiden. Slutliga denatureringskurvor bör genereras åtminstone första gången primersna är anställda i qPCR för att validera förstärkningen av en enda DNA-produkt.Mät qPCR SYBR Green-signalerna i förhållande till Actin av Ct För alla fall, beräkna medelvärdet, och standardavvikelsen för två till Ct-släktingen till Actin. Utför endpoint gel elektrofores, för att bekräfta korrekt produktstorlek upptäckt av qPCR. Här kör 25 mikroliter av qPCR-produkten blandat med fem mikroliter av 6X Glitterol färgämne på en 2%TAE Agarose gel vid 200 volt i 20 minuter.Om din qPCR visar att du inte har identifierat målsekvenserna, upprepa hela cykeln med en ny referens, som kan erhållas från en online-databas. Subtraktivt projektet i detta fall började med sekvensering av RNA från groddar-fodrade vävnad av manliga och kvinnliga vuxna zebra fink. I slutändan identifierades 935 somatiska gener som inte tidigare ingick i hela genomanteckningen.Efter beräkningsfiltrering kan kvantitativ PCR ge ett negativt resultat där det inte fanns någon skillnad i detektion över fågelvävnader. Omvänt bekräftas ett positivt resultat som representerar identifieringen av en True Target-sekvens när genomisk DNA qPCR visar statistiskt större detektion i den vävnad av intresse, i förhållande till referensen. Här var alfa snap genen valideras för att vara sett-begränsad eftersom det var utarmat i somatisk vävnad i förhållande till testéer DNA där det var närvarande att nivåer som motsvarar Actin.Det är viktigt att komma ihåg att använda rätt ingångar under var och en av de beräkningsmässiga stegen. Du kanske måste gå igenom cykeln subtraktion flera gånger för att få målet sekvens eller sekvenser. En mängd fylogenetiska, strukturella och funktionella analys kan utföras på de upptäckta generna.Dessa ytterligare metoder ger insikt i genernas evolutionära och funktionella roller. Vi identifierade den första genen på en sett-begränsad songbird kromosom, som breddade intresset för denna överraskande genomiska element. Efterföljande arbete visade liknande kromosomer i många sångfågel arter som innehåller många ytterligare gener.

Research

JoVE Journal

Genetics

In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

Transkription in vitro analyser och deras tillämpning i Drug Discovery

In vitro transcription assays have been developed and widely used for many years to study the molecular mechanisms involved in transcription. This process ...

Novel RNA-Binding Proteins Isolation by the RaPID Methodology

Nya RNA-bindande proteiner Isolering av den snabba Methodology

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern ...

Conjugative Mating Assays for Sequence-specific Analysis of Transfer Proteins Involved in Bacterial Conjugation

Konjugativ Parning Analyser för sekvensspecifik analys av Transfer proteiner involverade i konjugation

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia ...

Determination of the Optimal Chromosomal Location(s) for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Determination of the Optimal Chromosomal Locations for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Bestämning av optimala kromosomala belägenheten för ett DNA-Element i Escherichia coli använder en ny metod för Transposon-medierad

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In ...

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

High Fat Diet utfodring och hög genomströmning Triacylglyceride test på Drosophila Melanogaster

Heart disease is the number one cause of human death worldwide. Numerous studies have shown strong connections between obesity and cardiac malfunction in ...

Sequence-specific and Selective Recognition of Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs by Chemically Modified Peptide Nucleic Acids

Sekvens-specifika och selektiv erkännande av dubbelsträngat RNA över enkelsträngat RNA av kemiskt modifierade peptid nukleinsyror

RNAs are emerging as important biomarkers and therapeutic targets. Thus, there is great potential in developing chemical probes and therapeutic ligands ...

Informatic Analysis of Sequence Data from Batch Yeast 2-Hybrid Screens

Datoriserad analys av sekvensdata från Batch jäst 2-Hybrid skärmar

We have adapted the yeast 2-hybrid assay to simultaneously uncover dozens of transient and static protein interactions within a single screen utilizing ...

Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing

Sekvensering av mRNA från helblod med Nanopore sekvensering

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, ...

Navigating MARRVEL, a Web-Based Tool that Integrates Human Genomics and Model Organism Genetics Information

Navigera i MARRVEL, ett webbaserat verktyg som integrerar Human Genomics och Modellorganismens gen etik information

Through whole-exome/genome sequencing, human geneticists identify rare variants that segregate with disease phenotypes. To assess if a specific variant is ...

Exploring Sequence Space to Identify Binding Sites for Regulatory RNA-Binding Proteins

Utforska Sekvensutrymme för att identifiera bindnings platser för regulatoriska RNA-bindande proteiner

Gene regulation plays an important role in all cells. Transcriptional, post-transcriptional (or RNA processing), translational, and post-translational ...