Name: autoradiography as a simple and powerful method for visualization and characterization of pharmacological targets
Uploaded: 2019-03-12T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Autoradiography as a Simple and Powerful Method for Visualization and Characterization of Pharmacological Targets at JoVE.com

وكان دعم العمل مؤسسة Lundbeck (منحة R133-A12270) ومؤسسة نوفو نورديسك (منحة NNF0C0028664). يشكر المؤلفون الدكتور أليس ماريك لتوريد راديوليجاند [ح]3.

وأجرى جميع الحيوانات التعامل مع امتثالا للمبادئ التوجيهية من "الحيوان الدنماركي التجريب المفتشية".
ملاحظة: بروتوكول وصف هنا تغطي إعداد الأنسجة (أيأنسجة المخ الماوس)، في المختبر أوتوراديوجرافيك المقايسة بتفصيل كاف لإعداد الأسلوب في مختبر جديد، والتعرض فوسفور imagin...

في أغلب الأحيان تتحدد نوعية الإنزيم أوتوراديوجرافيك حساسية راديوليجاند. عاملاً مساهما رئيسيا هو النظائر المشعة المحددة، التي تعطي بتوافر يغاندس المعروفة أو بجدوى تقنيات وضع العلامات المحددة للعائد يغاندس مع النشاط المحدد المناسب (أي، ومقدار النشاط الإشعاعي كل وحدة مول من راديوليج...

أوتوراديوجرافي الطريقة التي توفر صوراً اضمحلال الإشعاعي. يتم استخدام التقنية بشكل روتيني لدراسة توزيع الأنسجة من البروتين من الفائدة في المختبر يقوم على تفاعل معينة الدوائي بين مجمع راديولابيليد وهدفها. وهذا يوفر معلومات مباشرة حول الانتقائية ليجند للهدف. ويمكن أيضا استخدام أوتوراديوجرافي في المختبر لتحديد الكمية من معلمات الربط الدوائي من راديوليجاندس، مثل ثابت التفكك (كد) وكثافة من مواقع الربط (بكحد أقصى)، وكذلك لتحديد تثبيط الثابت (Ki)1،يغاندس المتنافسة2. بالمقارنة مع الربط راديوليجاند هوموجيناتي التقليدية، قد أوتوراديوجرافي بميزة القدرة على تصور التشريح المكانية وتفاصيل مقتضبة عن أنماط التعبير الإقليمي3. ولذلك طريقة autoradiography بديل ذات صلة إلى إيمونوسيتوتشيميستري، لا سيما في حالة عدم وجود جسم تم التحقق من صحتها. Autoradiography وينفذ بسهولة في مختبر النظائر المشعة قياسية نظراً لتوافر راديوليجاند مناسبة مع خصوصية الدوائية المطلوبة، الوصول إلى كريوستات مبضع إعداد أقسام الأنسجة، وتصوير مناسبة جهاز قادر على تحليل توزيع النشاط الإشعاعي في أقسام الأنسجة الخاصة بكل منها. جدير بالذكر أن معيار تحديد مهم راديوليجاند كمية محدودة من الربط بالمواقع غير المستهدفة. هذا يمكن أن يكون للبروتينات، الأغشية أو مواد مثل البلاستيك أو عوامل أخرى، وهو يشار إليها باسم الربط غير محددة. عادة، غير محددة ملزمة غير ستثربل لكن يمكن أن تكون ستثربل إذا كان ذلك ينطوي على بروتين خارج الهدف محدد. أفضل طريقة للتحقق من صحة ملزمة محددة الحقيقية مقارنة بالانسجة التي تفتقر إلى الهدف، مثلاً، وراثيا هندسة الأنسجة (المغلوب)4.
هنا، يوضح المنهجية مع وصف الموقع عالية تقارب ملزمة لحمض هيدروكسيبيوتريك γ (GHB) في الدماغ الثدييات أوتوراديوجرافيك. فهم التفاعل الدوائي بين GHB وموقعها ملزمة صلة GHB دواء سريرياً مفيدة في علاج الخدار وإدمان الكحول5، ولكن أيضا مكوناً طبيعية من الدماغ الثدييات وترفيهية 6من المخدرات. ووصفت مواقع الربط GHB عالية تقارب أولاً استخدام [ح]3[GHB ملزمة للفئران الدماغ هوموجيناتي7. على مر السنوات، مواصلة الدراسات أوتوراديوجرافي مع [ح]3[GHB والتماثلية [ح]3[قد أظهرت سي إس-382 بكثافة عالية لربط مواقع في مناطق فوريبرين من الفئران8،9،10،9 من الماوس ، خنزير الدماغ11والإنسان القرد12. ومع ذلك، ظلت هوية الجزيئية وأهميتها الفنية الدقيقة من مواقع الربط هذه بعيد المنال.
ووضعت مع نية لزيادة تمييز مواقع الربط، وتيسيرا لدراسات عن دور GHB الفسيولوجية، راديوليجاندس متعددة تتضمن نظائر مختلفة تتمتع بمختلف الانتماءات ([ح]3[GHB، [3 ح] سي إس-382، [ح]3[هوكبكا و [125أنا] بنوف-GHB)14،13،،من1516(استعرض في17) (الشكل 1). تركيبة انتقائية عالية تقارب راديوليجاندس وكثافة أنسجة عالية جداً لربط مواقع قد سمحت لإنتاج صور عالية الجودة باستخدام الفوسفور التصوير تقنية9،11. جنبا إلى جنب مع موجز للنقاط العملية في إعداد تجربة أوتوراديوجرافيك ومثالا لتجسيد التفاصيل، سيركز القسم مناقشة ط) اختيار النويدات المشعة، وثانيا) اختيار شروط المقايسة، والثالث) استخدام الفوسفور لوحات التصوير مقابل فيلم الأشعة السينية. والهدف العام من هذه الورقة تقديم التفاصيل التقنية والمنهجية والعلمية على تقنية أوتوراديوجرافي لإعلام حول توزيع الأنسجة وتحليل الأهداف البروتين الدوائي.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Absolute ethanol</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>107017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BAS-TR2040 Imaging Plate</td>
			<td>GE Healthcare Life Science</td>
			<td>28956481</td>
			<td>20x40 cm - Sensitive to tritium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cresyl violet acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5042-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPX (non-aqueous mounting medium for microscopy)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>100579</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O.C.T. Compound, 12 x 125 mL</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td>Tissue-Tek</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>16005-1KG-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-9483</td>
			<td>microscope slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Manual Slide Staining Set</td>
			<td>Sakura Finetek Denmark ApS</td>
			<td>4451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tritium Standard on Glas</td>
			<td>American Radiolabeld Chemicals, Inc.</td>
			<td>ART 0123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene substitute</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5597</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

autoradiography as a simple and powerful method for visualization and characterization of pharmacological targets

في المختبر autoradiography يهدف إلى تصور توزيع تشريحية من بروتين فائدة في الأنسجة من الحيوانات التجريبية، فضلا عن البشر. ويستند الأسلوب ملزمة محددة من راديوليجاند إلى هدفها البيولوجية. لذلك، أقسام الأنسجة المجمدة هي المحتضنة مع راديوليجاند الحل والربط إلى الهدف بعد ذلك مترجمة قبل الكشف عن تسوس المشعة، على سبيل المثال، باستخدام فيلم حساس أو فوسفور imaging لوحات. عرض أوتوراديوجرامس الرقمية الناتجة عن القرار المكانية الرائع، الذي يتيح للقياس الكمي والتعريب لربط راديوليجاند في هياكل تشريحية متميزة. وعلاوة على ذلك، يسمح التحديد الكمي لتوصيف الدوائية ليجند تقارب عن طريق الانفصال من الثوابت (كد)، الثوابت تثبيط (كأنا)، فضلا عن كثافة مواقع الربط (بكحد أقصى) في الأنسجة المحددة. وهكذا، الأسلوب يوفر معلومات حول هدف التعريب ويجند الانتقائية. هنا، يتمثل الأسلوب مع الوصف أوتوراديوجرافيك من حمض عالية تقارب γ-هيدروكسيبيوتريك (GHB) مواقع في أنسجة المخ الثدييات، مع التركيز بوجه خاص على اعتبارات منهجية فيما يتعلق بمقايسة الربط الربط معلمات، الاختيار في راديوليجاند وطريقة الكشف.

باستخدام بروتوكول وصف، كان تصور التشريحية توزيع مواقع الربط GHB عالية تقارب مع GHB التناظرية [ح]3[راديولابيليد هوكبكا في الدماغ الماوس، والتي قطعت إلى أقسام الاكليلية، السهمي والأفقية (الرقم 3 ). ولوحظت مستويات عالية من الربط في قرن آمون وقشرة، ملزمة أق...

Watch this Scientific Journal Video about Autoradiography as a Simple and Powerful Method for Visualization and Characterization of Pharmacological Targets at JoVE.com

Autoradiography as a Simple and Powerful Method for Visualization and Characterization of Pharmacological Targets

أوتوراديوجرافي كطريقة بسيطة وقوية للتصور وتوصيف الأهداف الدوائية

يتم استخدام أسلوب أوتوراديوجرافي بشكل روتيني لدراسة ملزمة راديوليجاندس إلى أقسام الأنسجة لتحديد الأدوية النوعية أو الكمية.

In vitro autoradiography aims to visualize the anatomical distribution of a protein of interest in tissue from experimental animals as well as humans. The ...

التصوير الآلي هو تقنية قوية وبسيطة لدراسة توزيع مواقع ربط البروتين في الأنسجة باستخدام الراديوغند المحدد للهدف. كما أنها بديل مناسب للكيمياء المناعية. هذه التقنية تصور التعبير البروتين مع القرار المكاني عبر الصور الرقمية التي هي أسرع من التعرض للفيلم التقليدي.ويمكن أيضا أن تستخدم للتحليل الدوائية من أهداف البروتين. وتنطوي هذه الطريقة على أنسجة الماوس التي شنت على الزجاج ولكن يمكن تمديدها إلى أنواع أخرى أو حتى إلى الخلايا التي تزرع على الأغطية. إثبات الإجراء سيكون من قبل نان غريم كراي، طالب دكتوراه في مختبري.للبدء، غمر الأنسجة في مسحوق الجليد الجاف لتجميده. نقل الأنسجة المجمدة مباشرة إلى التبريد الذي تم تعيينه إلى ناقص 20 درجة مئوية. اسمحوا الأنسجة تتأقلم إلى ناقص 20 درجة مئوية في التبريد لمدة 20 دقيقة.ثم تغطية حامل الأنسجة مع تضمين المتوسطة خارج التبريد ووضع بسرعة عينة الأنسجة المجمدة في الاتجاه المطلوب في حين أن المتوسطة embedding لا يزال السائل. نقل حامل الأنسجة مرة أخرى إلى التبريد وفضح المتوسطة تضمين لدرجات حرارة أقل من ناقص 10 درجة مئوية لتصلب. ضع حامل الأنسجة في الدقيقة من التبريد.ضبط اتجاه الأنسجة لتجنب المقاطع المنحدرة. قطع الأنسجة مع توجيه من أطلس stereotaxic في أقسام من سمك المطلوب وتتكشف القسم مع فرشاة صغيرة إذا لزم الأمر. ذوبان جبل القسم على شريحة المجهر.ثم جمع تسلسليا المقاطع من المنطقة ذات الأهمية للتكرار التقني المطلوب. السماح لأقسام على الشرائح لتجف الهواء لمدة ساعة واحدة قبل مزيد من التعامل معها. في مختبر النشاط الإشعاعي المعتمد، استخدم قلم رصاص لتسمية الشرائح بالظروف التجريبية.ضع الشرائح أفقيًا في الصواني البلاستيكية. تطبيق وحدة تخزين مناسبة من المخزن المؤقت SA تعديل إلى الهدف في السؤال إلى المقاطع المحملة على الشرائح. تأكد من أن كل قسم مغطى بالكامل.لتحديد الربط غير المحدد، ملحق SA العازلة مع تركيز ذات الصلة من مركب غير يسمى. ثم تغطية الصواني مع الأغطية لتجنب التبخر. قبل احتضان في درجة حرارة ذات الصلة لمدة 30 دقيقة على لوحة شاكر تعيين إلى 20 دورة في الدقيقة.بعد ذلك، قم بسكب سائل ما قبل الحضانة من كل شريحة ونقل الشرائح مرة أخرى إلى صينية بلاستيكية. تغطية على الفور أقسام تماما مع تركيز ذات الصلة من radioligand في SA العازلة. لتحديد غير محددة ملزمة، تكملة حل الligand radioligand مع تركيز ذات الصلة من مركب غير محدد.غطي الصواني بالأغطية وتجني تحت الظروف المرغوبة مع اهتزاز خفيف مستمر عند 20 دورة في الدقيقة. بعد ذلك، صب قبالة حل الحضانة ونقل الشرائح إلى رف شريحة المجهر. غسل الشرائح على الفور.بالنسبة لبروتوكول GHB، اغسل مرتين بمخزن SA بارد للثلج لمدة 20 ثانية ثم شطف مرتين عن طريق غمس رف الشريحة في صواني مملوءة بالماء المقطر البارد المثلج. ضع الشرائح عموديًا في الرفوف وتجف الهواء لمدة ساعة واحدة على الأقل. ثم نقل الشرائح إلى المثبت يحتوي على paraformaldehyde لتثبيت بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة.في اليوم التالي، نقل الشرائح إلى مربع مجفف يحتوي على هلام السيليكا في درجة حرارة الغرفة. اترك الشرائح في مربع القضيّات لمدة ثلاث ساعات للقضاء على الرطوبة. أولاً، ضع المقاطع في لوحة تصوير محمية بالإشعاع مع مواجهة الأنسجة لأعلى.إدراج مقياس صغير مشع في كل كاسيت من أجل التحديد الكمي اللاحق للربط في علم الشرائط الإشعاعية. قبل الاستخدام مباشرة، قم بتحميل لوحة التصوير الفوسفورية الحساسة التريتيوم في آلة التصوير الفوسفوري وتعريضها لضوء الأشعة تحت الحمراء المرئية وفقا لتعليمات الشركة المصنعة لمحوه. ثم قم بإزالة لوحة التصوير من آلة التصوير الفوسفورية ووضعها على الفور على الأقسام في الكاسيت.تأكد من أن الكاسيت مغلق تماماً. عرض المقاطع لصفيحة التصوير الفوسفوري للحصول على وقت التعرض الأمثل في درجة حرارة الغرفة بينما تكون محمية من الضوء. بعد التعرض، قم بفتح الكاسيت بعناية في الظلام ونقل لوحة التصوير على الفور إلى الصندوق المظلم لصورة الفوسفور.مسح لوحة في أعلى دقة ممكنة للحصول على صورة رقمية. للبدء، افتح برنامج تحليل الصور المناسب. حدد الكثافة البصرية النسبية لكل معيار معايرة عن طريق تحديد منطقة عنصر القائمة.حدد أداة إنشاء المنطقة واستخدامها لتحديد منطقة متساوية الحجم لكل نقطة من المقياس الصغير المشع. تعيين رقم لكل منطقة محددة بالنقر فوق الرقم تحت تسمية عنصر القائمة. انقر فوق تصدير الملف ثم تقرير المنطقة 2D لتصدير قيم OD لكل نقطة من معيار المعايرة.في برامج التصوير الخاصة، استخدم أداة إنشاء منطقة لتحديد المنطقة ذات الاهتمام في كل قسم وقياس لديها ODs لبدء تنفيذ القياس الكمي للوراميات. حدد نفس المنطقة في كل قسم عن طريق إنشاء قالب لمنطقة الاهتمام ونسخه وضبطه مع الاختلافات الطفيفة في تشريح الدماغ في كل مخطط تلقائي. بعد ذلك، انقر فوق تقرير منطقة تصدير الملف 2D لتصدير قيم ROD وأحجام المناطق المحددة في جدول بيانات.تحديد ربط من الligand radioligand كما هو موضح في بروتوكول النص. في هذه الدراسة، يتم تصور التوزيع التشريحي لـ مواقع الربط GHB عالية التقارب مع GHB المشعة التناظرية HOCPCA في الدماغ الماوس الذي تم قطعه إلى أقسام الإكلالي، القوس، والأفقي. وينظر إلى مستويات عالية من الربط في قرن آمون والقشرة في حين ينظر إلى مستويات الربط أقل في المخطط ويتم الكشف عن أي ربط في المخيخ.كما هو مبين هنا، يمكن تصور الهياكل التشريحية باستخدام طائرات مختلفة ويمكن دعم سلامة التشريحية من قبل تلطيخ البنفسج الكريسيل. توضح الصور التلقائية التمثيلية الجرذان والفأر والخنزير الحفظ التطوري لمواقع الربط GHB العالية في الدماغ الثديي. يتم الكشف عن مواقع الربط هتكينغ المشعة في جميع الأنواع الثلاثة مما يتيح مقارنة تشريح الدماغ الإجمالي بينهما.يتم بحث مواقع الربط GHB عالية التقارب مع الأقليات الإشعاعية GHB التي تظهر تقاربات مختلفة لمواقع ملزمة ولكن أنشطة محددة قابلة للمقارنة. وهبت HOCPCA المشعة مع حساسية عالية وإشارة ممتازة إلى نسبة الضوضاء. ونظراً لانخفاض حساسية NCS-382 المشعة، يجب استخدام تركيزات أعلى من الغرزة الإشعاعية من أجل الحصول على مستويات مماثلة من الربط.بل إن التركيزات الأعلى في الغرابات الإشعاعية ضرورية للتوصل إلى مستويات ربط مماثلة. ومع ذلك، فإن التركيزات العالية في الغرزية الإشعاعية تزيد أيضاً من مستوى الربط غير المحدد، وبالتالي تنخفض نسبة الإشارة إلى الضوضاء. من المهم تحسين ظروف الفحص مثل تركيز الألواح الإشعاعية ، والغسيل ووقت التعرض من أجل الحصول على أفضل إشارة إلى نسب الضوضاء ، ومن المهم جدًا أيضًا أن تتذكر أن تتذكر أن تمحو اللوحة من قبل.ويمكن توسيع هذا الإجراء إلى الظروف في الجسم الحي للحصول على فكرة عن مجمع ملزم في حي والتي يمكن أن تكون مفيدة لمشاريع اكتشاف. تذكر أن تعمل في مختبر مع مواد مشعة كاملة معتمدة وأن ترتدي ملابس واقية عند التعامل مع النشاط الإشعاعي أو شبه شكلي.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Simple Composite Phenotype Scoring System for Evaluating Mouse Models of Cerebellar Ataxia

سجل النمط الظاهري بسيط مركب نظام لتقييم نماذج الماوس من رنح مخيخي

We describe a protocol for the rapid and sensitive quantification of disease severity in mouse models of cerebella ataxia. It is derived from previously ...

Novel Apparatus and Method for Drug Reinforcement

رواية جهاز وطريقة لتدعيم المخدرات

Animal models of reinforcement have proven to be useful for understanding the neurobiological mechanisms underlying drug addiction.  Operant drug ...

The Vermicelli and Capellini Handling Tests: Simple quantitative measures of dexterous forepaw function in rats and mice

والشعيرية والتعامل مع الاختبارات Capellini : تدابير كمية بسيطة من وظيفة forepaw حاذق في الجرذان والفئران

Previous characterizations of rodent eating behavior have revealed that they use coordinated forepaw movements to manipulate food pieces. We have extended ...

Automated Interactive Video Playback for Studies of Animal Communication

المؤتمتة عرض الفيديو التفاعلي للدراسات الاتصالات الحيوانية

Video playback is a widely-used technique for the controlled manipulation and presentation of visual signals in animal communication. In particular, ...

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

تصور في Proprioceptors<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; يرقات وشرانق

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

التصور والتلاعب الجيني من التشعبات والاعمده الفقريه في قشرة الدماغ والحصين ماوس باستخدام<em&gt; في الرحم</em&gt; Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development

Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development

بحكم الرحم الصعق الكهربائي وإإكسبلنتس نصف الكرة المجموع: طريقة بسيطة للدراسات التجريبية التنمية القشرية في وقت مبكر

Cortical development involves complex interactions between neurons and non-neuronal elements including precursor cells, blood vessels, meninges and ...

A Simple and Inexpensive Method for Determining Cold Sensitivity and Adaptation in Mice

طريقة بسيطة وغير مكلفة لتحديد الباردة الحساسية والتكيف في الفئران

Cold hypersensitivity is a serious clinical problem, affecting a broad subset of patients and causing significant decreases in quality of life.  The cold ...

Live Imaging of Nicotine Induced Calcium Signaling and Neurotransmitter Release Along Ventral Hippocampal Axons

تصوير لايف من النيكوتين المستحثة اشارة الكالسيوم وناقل عصبي الإصدار جنبا إلى جنب بطني الحصين المحاوير

Sustained enhancement of axonal signaling and increased neurotransmitter release by the activation of pre-synaptic nicotinic acetylcholine receptors ...

A Simple Alternative to Stereotactic Injection for Brain Specific Knockdown of miRNA

بديل بسيط لحقن المجسم لالدماغ ضربة قاضية محددة من ميرنا

MicroRNAs (miRNAs) are key regulators of gene expression.  In the brain, vital processes like neurodevelopment and neuronal functions depend on the ...