Name: autoradiography as a simple and powerful method for visualization and characterization of pharmacological targets
Uploaded: 2019-03-12T15:00:00
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这项工作得到了 lundbeck 基金会 (grant r133-a12270) 和 novo nordisk 基金会 (grant nnf0c0028664) 的支持。提交人感谢 alešmarek 博士提供的 [3h] 辐射寡核苷酸。

所有动物处理都是按照丹麦动物实验监察局的准则进行的。
注: 此处描述的协议包括组织准备 (即小鼠脑组织)、体外自动影像学检测, 以便在新的实验室中建立该方法、暴露于荧光粉成像板以及随后对自动影像学进行密度分析 (图 2), 目的是在不同的解剖结构中定位和定量放射性寡核苷酸结合。为了进行组织学比较, 包括了环己基紫罗兰色染?...

自体影像学检测的质量通常是由放射线的敏感性决定的。一个主要的促成因素是选定的放射性同位素, 它是根据已知配体的供应情况或特定标签技术产生具有适当特定活性 (即放射性的数量) 的配体的可行性得出的每单位摩尔的一个半径)23和有限的化学降解量。大量已知配体的放射性被贴上了9、10、24<sup...

自动摄影是一种提供放射性衰变图像的方法。该技术通常用于研究一种感兴趣的蛋白质在体外的组织分布, 其基础是放射性标记化合物与其靶点之间的特定药理相互作用。这提供了有关目标配体选择性的直接信息。体外自体影像学也可用于定量测定放射性药物的药理结合参数, 如离解常数 (kd) 和结合位点密度 (b最大值), 以及用于测定竞争配体1,2的抑制常数 (k i)。与传统的同质辐射结合相比, 自动影像学具有能够可视化空间解剖和给出区域表达模式简洁细节的优点 3。因此, 自体影像学方法是免疫细胞化学的相关替代方法, 尤其是在没有经过验证的抗体的情况下。在标准的放射性同位素实验室中, 由于有合适的放射位基因和所需的药理特异性, 可以使用用于制备组织切片的微孔低温恒温器, 以及适当的成像, 因此可以很容易地在标准的放射性同位素实验室进行自体测药能够分析各自组织切片中放射性分布的装置。值得注意的是, 辐射寡核苷酸的一个重要选择标准是与非目标地点的结合数量有限。这可以是其他蛋白质, 膜或材料, 如塑料或过滤器, 并统称为非特异性结合。通常情况下, 非特异性结合是不饱和的, 但如果它涉及特定的非目标蛋白, 则可以是饱和的。验证真正的特定结合的最佳方法是将缺乏目标的组织进行比较,例如基因工程 (淘汰赛) 组织4。
在这里, 该方法说明了与自交图表征的高亲和力结合位点的γ-羟基丁酸 (ghb) 在哺乳动物大脑中。了解 ghb 与其结合部位之间的药理作用具有重要意义, 因为 ghb 既是治疗嗜睡和酒精中毒的临床有用药物, 也是哺乳动物大脑的天然成分和娱乐药物6。高亲和力 ghb 结合位点首次被描述使用 [3h] ghb 结合大鼠大脑均质7。多年来, 进一步的自体影像学研究 [3h] ghb 和类似 [3h] ncs-382 已显示高密度结合位的前脑区域的大鼠 8,9,10, 小鼠9猪11和猴子人的大脑 12。然而, 这些结合位点的分子特性和确切的功能相关性仍然难以捉摸。
为了进一步确定结合位点的特征, 并便利对 ghb 的生理作用进行研究, 开发了含有不同亲和力的不同同位素的多种放射性寡头 ([3h] ghb, [3h] ncs-382、[3h] hopcca 和 [125i] bnoph-ghb)13、14、15、16(17 审查)(图 1)。选择性高亲和力放射性和非常高的组织密度的结合结合结合结合, 使使用荧光粉成像技术9,11的高质量图像得以产生。除了在建立自动摄影实验的实际要点和一个例子来说明细节的情况外, 讨论部分将强调 (一) 放射性核素的选择, (二) 检测条件的选择, 以及 (三) 荧光粉的使用成像板与 x 射线胶片的对比。本文的总体目标是提供有关自体影像学技术的技术、方法和科学细节, 以了解蛋白质靶的组织分布和药理分析。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Absolute ethanol</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>107017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BAS-TR2040 Imaging Plate</td>
			<td>GE Healthcare Life Science</td>
			<td>28956481</td>
			<td>20x40 cm - Sensitive to tritium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cresyl violet acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5042-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPX (non-aqueous mounting medium for microscopy)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>100579</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O.C.T. Compound, 12 x 125 mL</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td>Tissue-Tek</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>16005-1KG-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-9483</td>
			<td>microscope slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Manual Slide Staining Set</td>
			<td>Sakura Finetek Denmark ApS</td>
			<td>4451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tritium Standard on Glas</td>
			<td>American Radiolabeld Chemicals, Inc.</td>
			<td>ART 0123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene substitute</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5597</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

autoradiography as a simple and powerful method for visualization and characterization of pharmacological targets

体外自动摄影的目的是想象实验动物和人类对组织感兴趣的蛋白质的解剖分布。该方法是基于辐射寡核苷酸及其生物目标的特定结合。因此, 冷冻组织切片用辐射和溶液孵育, 然后通过检测放射性衰变来定位与目标的结合, 例如, 使用光敏膜或荧光粉成像板。由此产生的数字自动测底图显示出显著的空间分辨率, 从而能够在不同的解剖结构中对辐射寡核苷酸进行定量和定位。此外, 定量允许通过离解常数 (kd)、抑制常数 (k i) 以及选定组织中的结合位点密度 (b最大值) 对配体亲和力进行药理鉴定.因此, 该方法提供了有关目标定位和配体选择性的信息。在这里, 这项技术的例子是在哺乳动物脑组织中高亲和力γ-羟基丁酸 (ghb) 结合位点的自体成像表征, 特别强调了有关结合试验的方法学考虑。参数、辐射点的选择和检测方法。

使用所述协议, 利用小鼠大脑中的放射性 ghb 模拟 [3h] hocpca 对高亲和力 ghb 结合位点的解剖分布进行了可视化, 该模拟被切割成冠状、矢状和水平部分 (图 3).).在海马和皮层中观察到高度的结合, 在纹状体中较低的结合, 在小脑中没有发现结合, 这与以前报告的高亲和力 ghb 位点9、10的表达模式相对...

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Autoradiography as a Simple and Powerful Method for Visualization and Characterization of Pharmacological Targets

自体影像学作为一种简单而有力的药理靶标可视化和表征方法

自体影像学方法通常用于研究放射线与组织切片的结合, 以确定定性或定量药理学。

In vitro autoradiography aims to visualize the anatomical distribution of a protein of interest in tissue from experimental animals as well as humans. The ...

自动造影是一种强大而简单的技术，用于研究使用特定放射性基因在组织中蛋白质结合位点分布。它也是免疫基础化学的合适替代品。该技术通过比传统胶片曝光更快的数字图像，以空间分辨率可视化蛋白质表达。它也可用于蛋白质靶点的药理分析。该方法涉及安装在玻璃上的小鼠组织，但可以扩展到其他物种，甚至扩展到在盖玻片上生长的细胞。演示程序将由纳内格里姆-克雷，一个博士生在我的实验室。首先，将组织淹没在粉状干冰中，以捕捉冻结。将冷冻组织直接转移到温度设置为零下 20 摄氏度的低温恒温器。让组织在低温恒温器中适应零下20摄氏度20分钟。然后用低温恒温器外的嵌入介质覆盖组织支架，并快速将冷冻组织标本放在所需方向，而嵌入介质仍然是液体。将组织支架转回低温恒温器，将嵌入介质暴露在零下 10 摄氏度以下的温度下进行硬化。将组织支架放置到低温恒温器的微原子中。调整组织的方向以避免倾斜部分。在所需厚度部分的立体税图集的指导下切割组织，如有必要，用小刷子展开剖面。将截面安装到显微镜幻灯片上。然后按顺序从感兴趣的区域收集部分，以进行所需的技术重复。在进一步处理之前，让幻灯片上的部分风干一小时。在经过认证的放射性实验室中，使用铅笔将幻灯片与实验条件标记。水平将幻灯片放在塑料托盘中。小心地将调整到有关目标的 SA 缓冲区的适当卷应用于幻灯片上安装的部分。确保每个部分都完全覆盖。为确定非特异性结合，用相关浓度的未标记化合物补充SA缓冲液。然后用盖子盖住托盘，避免蒸发。在设定为 20 rpm 的板摇床上，在相关温度下预孵育 30 分钟。接下来，从每张幻灯片中倒出预孵化液，然后将幻灯片重新转移到塑料托盘中。立即用 SA 缓冲液的相关浓度完全覆盖各部分。为确定非特异性结合，补充放射性利甘溶液与相关浓度的未标记化合物。用盖子盖住托盘，并在所需条件下孵育，在 20 rpm 时持续轻轻摇晃。在此之后，倒掉孵化溶液，将幻灯片转移到显微镜幻灯片架中。立即清洗幻灯片。对于 GHB 协议，用冰冷 SA 缓冲液洗两次 20 秒，然后通过将滑动架浸入装满冰冷蒸馏水的托盘中冲洗两次。将滑梯垂直放置在机架中，风干至少一小时。然后将幻灯片转移到含有甲状甲醛的固定器中，在室温下进行隔夜固定。第二天，在室温下将幻灯片转移到含有硅胶的干燥器盒中。将幻灯片放在干燥器盒中三小时，以消除水分。首先，将部分放入辐射屏蔽成像板盒中，组织朝上。在每个盒式磁带中包括放射性微尺度，以便随后对放射性结合进行定量。在使用前，立即将钛敏感磷成像板加载到荧光成像机中，然后根据制造商的指示将其暴露在可见光下。然后从荧光成像机上取下成像板，并立即将其放在盒式磁带的截面上。确保盒式磁带完全关闭。将各部分暴露在荧光成像板上，在室温下优化曝光时间，同时屏蔽光线。曝光后，小心地在黑暗中打开盒式磁带，并立即将成像板转移到荧光成像仪的暗盒中。以尽可能高的分辨率扫描板以获得数字图像。首先，打开适当的图像分析程序。通过选择菜单项区域确定，确定每个校准标准的相对光学密度。选择用于区域创建的工具，并用它来为放射性微尺度的每个点选择大小相等的区域。单击菜单项标签下的数字，为每个选定区域分配一个数字。单击"文件导出"，然后单击 2D 区域报告，以导出校准标准每个点的 OD 值。在专有成像软件中，使用区域创建工具选择每个部分中感兴趣的区域并测量其 OD，以开始执行自动放射图的量化。通过为感兴趣区域创建模板，选择每个部分中的同一区域，并复制并调整其以适应每个自动放射图中大脑解剖学的细微变化。之后，单击"文件导出 2D 区域报告"将所选区域的 ROD 值和大小导出到电子表格中。确定文本协议中概述的无线电绑定。在这项研究中，高亲和力GHB结合位点的解剖分布与小鼠大脑中的放射性标记GHB模拟放射性 HOCPCA进行可视化，该分布被切成冠状、下垂和水平部分。在海马和皮层中可以看到高水平的结合，而在线状体中可以看到较低的结合水平，在小脑中未检测到结合。如这里所示，解剖结构可以使用不同的平面进行可视化，解剖完整性可能由紫红色染色支持。老鼠、老鼠和猪的代表性自动放射图说明了哺乳动物大脑中高亲和力GHB结合位点的进化保护。在所有三个物种中检测到放射性 HOCPCA 结合位点，从而比较它们之间的大脑解剖量。高亲和力GHB绑定站点使用GHB无线电基安，这些辐射点显示绑定站点的不同亲和力，但具有可比性的特定活动。放射性 HOCPCA 具有高灵敏度和出色的信噪比。由于放射性NCS-382的灵敏度较低，必须使用较高的放射性利甘浓度才能获得类似的结合水平。放射性 GHB 达到可比的结合水平，甚至更高的放射性利格和浓度也是必要的。然而，较高的放射性和浓度也会增加非特异性结合水平，从而降低信噪比。优化测定条件（如放射性浓度、洗涤和曝光时间）非常重要，以便获得最佳的信号与噪声比，并且记住之前擦除板也很重要。该过程可以扩展到体内条件，以获得关于活动物的化合物结合的想法，这可能对发现项目有用。记得在经过认证的全放射性物质实验室工作，在处理放射性或甲状甲醛时穿穿防护服。

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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