Name: autoradiography as a simple and powerful method for visualization and characterization of pharmacological targets
Uploaded: 2019-03-12T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Autoradiography as a Simple and Powerful Method for Visualization and Characterization of Pharmacological Targets at JoVE.com

Arbejdet var støttet af Lundbeckfonden (Grant R133-A12270) og Novo Nordisk Fonden (Grant NNF0C0028664). Forfatterne takke Dr. Aleš Marek for levering af [3H] radioligand.

Alle dyr håndtering blev udført i overensstemmelse med retningslinjerne fra den danske dyr eksperimenter inspektorat.
Bemærk: Protokollen beskrevet her dækker væv forberedelse (dvs., mus hjernevæv), in vitro- autoradiographic analysen i tilstrækkelige detaljer til at konfigurere metoden i en ny lab, eksponering for fosfor imaging plader samt efterfølgende densitometric analyse af autoradiograms (figur 2) med formålet at lokalisere og kva...

Kvaliteten af en autoradiographic analyse bestemmes oftest af følsomheden af radioligand. En stor medvirkende faktor er den valgte radioisotop, der er givet af tilgængeligheden af kendte ligander eller af gennemførligheden af specifik mærkning teknikker til at give ligander med passende specifikke aktivitet (dvs., mængden af radioaktivitet per enhed mol af en radioligand)23og med begrænsede mængder af kemiske nedbrydning. Et stort antal radioligands af kendte ligander er mærket me...

Autoradiografi er en metode, der giver billeder af radioaktivt henfald. Teknikken bruges rutinemæssigt til at studere væv distribution af et protein af interesse i vitro baseret på en specifik farmakologisk samspillet mellem en radioaktive stof og sit mål. Dette giver direkte oplysninger om selektivitet af liganden for målet. In vitro Autoradiografi kan også anvendes til kvantitativ bestemmelse af farmakologiske bindingsparametrene af radioligands, såsom dissociationskonstant (Kd) og tæthed af bindingssteder (Bmax), samt til bestemmelse af hæmning konstant (Kjeg) af konkurrerende ligander1,2. Sammenlignet med traditionelle homogenatet radioligand bindende, har Autoradiografi fordelen at være i stand til at visualisere rumlige anatomi og med kortfattet angivelse af regionale udtryk mønstre3. Metoden til Autoradiografi er derfor et relevant alternativ til immuncytokemi, især i mangel af en valideret antistof. Autoradiografi er nemt at implementere i en standard radioisotop laboratorium givet tilgængeligheden af en passende radioligand med den påkrævede farmakologiske specificitet, adgang til en mikrotom kryostaterne til forberedelse af væv sektioner, og en egnet imaging enhed, der er i stand til at analysere fordelingen af radioaktivitet i afsnittene respektive væv. Navnlig er en vigtig udvælgelseskriterium for radioligand en begrænset mængde af binding til ikke-målarter websteder. Dette kan være at andre proteiner, membraner eller materialer som plast eller filtre, og er kollektivt benævnt ikke-specifik binding. Normalt, ikke-specifik binding er ikke-mættet men kan være mættet, hvis det drejer sig om en bestemt ud-target protein. Den bedste måde at validere sande specifikke bindende er at sammenligne med væv mangler mål, fxgenetisk manipuleret (knock-out) væv4.
Her, er metoden, der illustreret med en autoradiographic karakterisering af høj-affinitet bindingssted for γ-hydroxybutyric syre (GHB) i hjernen, pattedyr. Forstå den farmakologiske interaktion mellem GHB og sit bindingssted er relevant som GHB er både et klinisk nyttigt lægemiddel i behandling af narkolepsi og alkoholisme5, men også en naturlig bestanddel af pattedyr hjernen og et rekreativt Drug6. Høj-affinitet GHB bindingssteder blev først beskrevet ved hjælp af [3H] GHB binding til rotte hjernen homogenatet7. I år, yderligere Autoradiografi undersøgelser med [3H] GHB og analog [3H] NCS-382 har viste en høj tæthed af bindende websteder i forhjernen regioner af rotte8,9,10, mus9 , gris11og abe/menneske hjernen12. Imidlertid har den molekylære identitet og nøjagtige funktionelle relevansen af disse bindingssteder forblev undvigende.
Med hensigten yderligere karakterisere bindingsstederne og lette undersøgelser på den fysiologiske rolle af GHB, flere radioligands inkorporerer forskellige isotoper begavet med forskellige tilhørsforhold har udviklet ([3H] GHB, [3 H] NCS-382, [3H] HOCPCA og [125jeg] BnOPh-GHB)13,14,15,16(revideret i17) (figur 1). Kombination af selektiv høj-affinitet radioligands og en meget høj væv tæthed af bindingen websteder har tilladt til fremstilling af billeder i høj kvalitet ved hjælp af fosfor imaging teknik9,11. Sammen med en skitse af de praktiske punkter i oprettelsen af et autoradiographic eksperiment og en illustration til at eksemplificere detaljer, vil afsnittet diskussion understrege i) valget af radionuklid, ii) valget af assay betingelser og iii) anvendelse af fosfor Imaging plader versus X-ray film. Det overordnede mål med dette papir er at give videnskabelige, tekniske og metodiske detaljer på Autoradiografi teknik for at informere om væv distribution og farmakologiske analyse af protein mål.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Absolute ethanol</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>107017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BAS-TR2040 Imaging Plate</td>
			<td>GE Healthcare Life Science</td>
			<td>28956481</td>
			<td>20x40 cm - Sensitive to tritium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cresyl violet acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5042-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPX (non-aqueous mounting medium for microscopy)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>100579</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O.C.T. Compound, 12 x 125 mL</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td>Tissue-Tek</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>16005-1KG-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-9483</td>
			<td>microscope slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Manual Slide Staining Set</td>
			<td>Sakura Finetek Denmark ApS</td>
			<td>4451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tritium Standard on Glas</td>
			<td>American Radiolabeld Chemicals, Inc.</td>
			<td>ART 0123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene substitute</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5597</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

autoradiography as a simple and powerful method for visualization and characterization of pharmacological targets

In vitro Autoradiografi sigter mod at visualisere anatomiske fordelingen af en protein af interesse i væv fra såvel forsøgsdyr som mennesker. Metoden er baseret på specifikke bindingen af en radioligand til sine biologiske mål. Derfor, frossen væv sektioner inkuberes med radioligand løsning, og bindingen til målet er efterfølgende lokaliseret ved påvisning af radioaktivt henfald, for eksempel ved hjælp af lysfølsomme film eller fosfor imaging plader. Resulterende digital autoradiograms vise bemærkelsesværdige rumlige opløsning, der giver mulighed for kvantificering og lokalisering af radioligand binding i forskellige anatomiske strukturer. Derudover kvantificering giver mulighed for den farmakologiske karakterisering af ligand affinitet med dissociation konstanter (Kd) samt hæmning konstanter (Kjeg) og massefylden af bindingssteder (Bmax) i udvalgte væv. Således giver metoden, der oplysninger om både målet lokalisering og ligand selektivitet. Her, er teknikken eksemplificeret med autoradiographic karakterisering af høj-affinitet γ-hydroxybutyric syre (GHB) bindende websteder i pattedyr hjernevæv, med særlig vægt på metodiske overvejelser vedrørende bindende assay parametre, valget af radioligand og påvisningsmetoden.

Ved hjælp af beskrevet protokollen, anatomiske fordelingen af høj-affinitet GHB bindingssteder blev visualiseret med det radioaktive GHB analoge [3H] HOCPCA i mus hjerne, som var skåret i vandrette, koronal og sagittal sektioner (figur 3 ). Høje niveauer af bindende blev observeret i hippocampus og cortex, lavere bindende i striatum og ingen bindende blev opdaget i lillehjernen, svarende til tidligere rapporteret udtryk mønstre af høj-affinit...

Watch this Scientific Journal Video about Autoradiography as a Simple and Powerful Method for Visualization and Characterization of Pharmacological Targets at JoVE.com

Autoradiography as a Simple and Powerful Method for Visualization and Characterization of Pharmacological Targets

Autoradiografi som en enkel og kraftfuld metode for visualisering og karakterisering af farmakologiske mål

Metoden for Autoradiografi bruges rutinemæssigt til at studere bindingen af radioligands til væv sektioner for bestemmelse af kvalitative eller kvantitative farmakologi.

In vitro autoradiography aims to visualize the anatomical distribution of a protein of interest in tissue from experimental animals as well as humans. The ...

Autoradiografi er en kraftfuld og enkel teknik til at studere distribution af proteinbindingssteder i væv ved hjælp af specifikke radioligand til målet. Det er også velegnet alternativ til immunhisistokemi. Denne teknik visualiserer proteinudtryk med rumlig opløsning via digitale billeder, som er hurtigere end traditionel filmeksponering.Det kan også anvendes til farmakologisk analyse af proteinmål. Metoden indebærer musevæv monteret på glas, men kan udvides til andre arter eller endda til celler dyrket på dækslæber. Demonstration af proceduren vil være af Nane Griem-Krey, en ph.d.-studerende i mit laboratorium.Til at begynde, nedsænkes vævet i pulveriseret tøris til snap fryse det. Overfør det frosne væv direkte til en kryostat, der er indstillet til minus 20 grader Celsius. Lad vævet akklimatisere til minus 20 grader Celsius i kryostaten i 20 minutter.Dæk derefter vævsholderen med indlejringsmedium uden for kryostaten, og anstænkningsprøven skal hurtigt sættes i den ønskede retning, mens indlejringsmediet stadig er flydende. Vævsholderen overføres tilbage til kryostaten, og indlejringsmediet udsættes for temperaturer under minus 10 grader Celsius til hærdning. Placer vævsholderen i kryostatens mikrotom.Juster vævets retning for at undgå skrånende sektioner. Skær vævet med vejledning af et stereotaxisk atlas i dele af den ønskede tykkelse og fold sektionen ud med en lille børste, hvis det er nødvendigt. Tø op med at montere sektionen på et mikroskopslid.Derefter sekventielt indsamle sektioner fra regionen af interesse for den ønskede tekniske gentagelse. Lad sektionerne på objektglassene lufttørre i en time, før de håndteres yderligere. I et certificeret radioaktivitetslaboratorium skal du bruge en blyant til at mærke objektglassene med forsøgsbetingelserne.Placer objektglassene vandret i plastikbakkerne. Anvend forsigtigt en passende mængde SA-buffer, der er justeret på det pågældende mål, på de sektioner, der er monteret på objektglassene. Sørg for, at hver sektion er helt dækket.Til bestemmelse af ikke-specifik binding suppleres SA-bufferen med en relevant koncentration af umærket forbindelse. Derefter dække bakkerne med låg for at undgå fordampning. Forinkuberes ved en relevant temperatur i 30 minutter på en pladeryser, der er indstillet til 20 omdr./min.Hæld derefter forinkubationsvæsken af fra hvert dias og overfør diasene tilbage i plastbakken. Dækker straks sektionerne helt med den relevante koncentration af radioligand i SA buffer. Til bestemmelse af ikke-specifik binding suppleres radioligandopløsningen med en relevant koncentration af umærket forbindelse.Dæk bakkerne med låg og inkuber under de ønskede forhold med konstant skånsom omrystning ved 20 omdrejninger i minuttet. Derefter hældes inkubationsopløsningen af, og objektglassene overføres til et mikroskopslider. Vask straks rutsjebanerne.Til GHB-protokollen vaskes to gange med iskold SA-buffer i 20 sekunder, og skyl derefter to gange ved at dyppe glideristen i bakker fyldt med iskoldt destilleret vand. Placer objektglassene lodret i stativer og lufttørre i mindst en time. Overfør derefter objektglassene til en fiksator, der indeholder paraformaldehyd til natfiksering ved stuetemperatur.Den næste dag, overføre dias til en ekssiccator boks, der indeholder silica gel ved stuetemperatur. Lad objektglassene være i ekssiccatorboksen i tre timer for at fjerne fugt. Først skal du placere sektionerne i en strålingafskærmet billedpladekassette med vævet opad.Medtag en radioaktiv mikroskala i hver kassette til efterfølgende kvantificering af radiolig og bindende. Umiddelbart før brug skal den tritiumfølsomme fosforbilledplade indlæses i phosphor-billeddannelsesmaskinen, og den udsættes for synligt infrarødt lys i henhold til producentens anvisninger om at slette den. Fjern derefter billedpladen fra fosforbilledmaskinen, og placer den straks på sektionerne i kassetten.Sørg for, at kassetten er helt lukket. Udsæt sektionerne på fosforbilledpladen for den optimerede eksponeringstid ved stuetemperatur, mens de er afskærmet fra lys. Efter eksponering skal kassetten åbnes forsigtigt i mørke og straks overføre billedpladen til den mørke kasse med en fosforbilled.Scan pladen med den højest mulige opløsning for at få et digitalt billede. Til at begynde med skal du åbne et passende billedanalyseprogram. Bestem de relative optiske tætheder for hver kalibreringsstandard ved at vælge bestemmelsen af menupunktsområdet.Vælg værktøjet til oprettelse af områder, og brug det til at vælge et område af samme størrelse for hvert punkt i det radioaktive mikroskala. Tildel et tal til hvert markeret område ved at klikke på tal under menupunktets etiket. Klik på Fileksport og derefter på 2D-områderapport for at eksportere OD-værdierne for hvert punkt i kalibreringsstandarden.I den proprietære billedbehandlingssoftware skal du bruge et områdeoprettelsesværktøj til at vælge det område, der interesserer sig for hvert afsnit, og måle dets OD'er for at begynde at udføre kvantificering af autoradiogram. Vælg den samme region i hver sektion ved at oprette en skabelon for området af interesse og kopiere og justere det til mindre variationer i hjernens anatomi i hvert autoradiogram. Derefter skal du klikke på Rapport over fileksport 2D-område for at eksportere ROD-værdierne og -størrelsen på markerede områder til et regneark.Bestemme indbindingen af radioligand som beskrevet i tekstprotokollen. I denne undersøgelse visualiseres den anatomiske fordeling af ghb-bindingsstederne med høj affinitetsgrader med de radioaktivt mærkede GHB-analoge radioaktive HOCPCA i en musehjerne, som blev skåret i koronal, sagittal og vandrette sektioner. Høje niveauer af binding ses i hippocampus og cortex, mens lavere bindende niveauer ses i striatum og ingen binding påvises i lillehjernen.Som vist her, de anatomiske strukturer kan visualiseres ved hjælp af forskellige planer og anatomiske integritet kan understøttes af cresyl violet farvning. Repræsentative autoradiogram af en rotte, en mus og en gris illustrerer den evolutionære bevarelse af den høje affinitet GHB bindende steder i pattedyr hjernen. Radioaktive HOCPCA-bindingssteder påvises i alle tre arter, der gør det muligt at sammenligne grovhjernens anatomi mellem dem.Ghb-bindingsstederne med høj affinitet undersøges med GHB-radioligands, som udviser forskellige tilhørsforhold til bindingsstederne, men sammenlignelige specifikke aktiviteter. Radioaktiv HOCPCA er udstyret med en høj følsomhed og fremragende signal til støj forhold. På grund af den radioaktive NCS-382's lavere følsomhed skal der anvendes højere radioligandkoncentrationer for at opnå tilsvarende bindingsniveauer.Endnu højere radioligand koncentrationer er nødvendige for radioaktive GHB at opnå sammenlignelige bindende niveauer. Højere radioligandkoncentrationer øger imidlertid også niveauet for ikke-specifik binding med et dermed lavere signal-støjforhold. Det er vigtigt at optimere analysen betingelser som radioligand koncentration, vask og eksponering tid for at få det bedste signal til støj forhold, og det er også meget vigtigt at huske at slette pladen før.Proceduren kan udvides til at omfatte under vivo-forhold for at få en idé om sammensatte bindinger i et levende dyr, som kan være nyttige for opdagelsesprojekter. Husk at arbejde i et laboratorium med certificeret fuldt radioaktivt materiale og at bære beskyttelsesbeklædning ved håndtering af radioaktivitet eller paraformaldehyd.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Simple Composite Phenotype Scoring System for Evaluating Mouse Models of Cerebellar Ataxia

We describe a protocol for the rapid and sensitive quantification of disease severity in mouse models of cerebella ataxia. It is derived from previously ...

Novel Apparatus and Method for Drug Reinforcement

Animal models of reinforcement have proven to be useful for understanding the neurobiological mechanisms underlying drug addiction.  Operant drug ...

The Vermicelli and Capellini Handling Tests: Simple quantitative measures of dexterous forepaw function in rats and mice

Previous characterizations of rodent eating behavior have revealed that they use coordinated forepaw movements to manipulate food pieces. We have extended ...

Automated Interactive Video Playback for Studies of Animal Communication

Video playback is a widely-used technique for the controlled manipulation and presentation of visual signals in animal communication. In particular, ...

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Visualisering af proprioceptorer i<em&gt; Drosophila</em&gt; Larver og pupper

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Visualisering og genetisk manipulering af dendritter og udløberne i mus cerebrale cortex og hippocampus under anvendelse<em&gt; I utero</em&gt; Elektroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development

Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development

Ex utero Elektroporation og Whole halvkugle Eksplantater: A Simple eksperimentel metode til Studier af tidlig Cortical Development

Cortical development involves complex interactions between neurons and non-neuronal elements including precursor cells, blood vessels, meninges and ...

A Simple and Inexpensive Method for Determining Cold Sensitivity and Adaptation in Mice

En enkel og billig metode til bestemmelse Kolde Følsomhed og tilpasning i mus

Cold hypersensitivity is a serious clinical problem, affecting a broad subset of patients and causing significant decreases in quality of life.  The cold ...

Live Imaging of Nicotine Induced Calcium Signaling and Neurotransmitter Release Along Ventral Hippocampal Axons

Live-Imaging af Nikotin induceret Calcium Signaling og neurotransmitterfrigivelse Langs ventrale Hippocampale Axoner

Sustained enhancement of axonal signaling and increased neurotransmitter release by the activation of pre-synaptic nicotinic acetylcholine receptors ...

A Simple Alternative to Stereotactic Injection for Brain Specific Knockdown of miRNA

En simpel alternativ til Stereotaktisk Injection til Brain Specifik Knockdown af miRNA

MicroRNAs (miRNAs) are key regulators of gene expression.  In the brain, vital processes like neurodevelopment and neuronal functions depend on the ...