Name: autoradiography as a simple and powerful method for visualization and characterization of pharmacological targets
Uploaded: 2019-03-12T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Autoradiography as a Simple and Powerful Method for Visualization and Characterization of Pharmacological Targets at JoVE.com

Het werk werd gesteund door de Lundbeck Foundation (Grant R133-A12270) en de Novo Nordisk Foundation (Grant NNF0C0028664). De auteurs bedanken Dr. Aleš Marek voor de levering van [3H] radioligand.

Alle dier behandeling werd uitgevoerd in overeenstemming met de richtsnoeren van de Deense dier experimenten inspectie.
Opmerking: Het protocol hier beschreven dekt weefsel voorbereiding (d.w.z., muis hersenweefsel), de in vitro autoradiografie assay in voldoende detail voor het opzetten van de methode in een nieuw lab, de blootstelling aan fosfor imaging platen, evenals Na diverse densitometric analyses van autoradiograms (Figuur 2) met als doel...

De kwaliteit van een autoradiografie bepaling wordt meestal bepaald door de gevoeligheid van de radioligand. Een belangrijke factor is de geselecteerde isotoop, dat wordt gegeven door de beschikbaarheid van bekende liganden of het haalbaar is specifieke etikettering technieken aan opbrengst liganden met passende specifieke activiteit (dat wil zeggen, de hoeveelheid radioactiviteit per eenheid mol van een radioligand)23en met een beperkte hoeveelheid chemische aantasting. Een groot aantal ...

Autoradiografie is een methode waarmee beelden van radioactief verval. De techniek is routinematig gebruikt om de studie van de verdeling van de weefsel van een proteïne van belang in vitro op basis van een specifieke farmacologische interactie tussen een radioactief gelabelde stof en haar doelstelling. Dit voorziet rechtstreekse informatie over de selectiviteit van het ligand in het doel. In vitro autoradiografie kan ook worden gebruikt voor de kwantitatieve bepaling van farmacologische bindende parameters van radioligands, zoals de dissociatieconstante (Kd) en de dichtheid van bandplaatsen (Bmax), alsmede voor het bepalen van de remming constante (Ki) van concurrerende liganden1,2. Vergeleken met traditionele homogenaat radioligand binding, heeft autoradiografie het voordeel van kunnend visualiseren ruimtelijke anatomie en beknopte vermelding van regionale expressie patronen3. De methode van autoradiografie is daarom een relevante alternatief voor immunocytochemie, met name in het ontbreken van een gevalideerde antilichaam. Autoradiografie is eenvoudig toe te passen in een standaard isotoop laboratorium gegeven van de beschikbaarheid van een geschikte radioligand met de vereiste farmacologische specificiteit, toegang tot een microtoom cryostaat voor het voorbereiden van weefselsecties, en een geschikte beeldvorming apparaat welk vermag de verdeling van de radioactiviteit in de respectieve weefselsecties analyseren. Met name is een belangrijk selectiecriterium voor de radioligand een beperkte hoeveelheid binding aan doelsoort sites. Dit kan naar andere eiwitten, membranen of materialen zoals plastic of filters, en wordt gezamenlijk aangeduid als niet-specifieke binding. Meestal kan niet-specifieke binding is niet-verzadigbare maar verzadigbare als het gaat om een specifieke uit-target proteïne. De beste manier van valideren waar specifieke binding is te vergelijken met weefsels ontbreekt het doel, bijvoorbeeldgenetisch gemanipuleerde (knock-out) weefsel4.
De methodologie is hier, geïllustreerd met de autoradiografie karakterisering van de hoge-affiniteit bindende site voor zuur van γ-hydroxybutyraat (GHB) in de hersenen van zoogdieren. Inzicht in de farmacologische interactie tussen GHB en zijn bindende plaats is van belang als GHB zowel een klinisch nuttig drug in de behandeling van narcolepsie en alcoholisme5, maar ook een natuurlijk bestanddeel van de zoogdieren hersenen en een recreatieve is drug6. Hoge-affiniteit GHB bandplaatsen waren eerst beschreven met behulp van [3H] GHB binding aan de rat hersenen homogenaat7. Door de jaren heen, verder autoradiografie studies met [3H] GHB en de analoge [3H] NCS-382 heeft een hoge dichtheid van bindende sites in reukkolf gebieden van rat8,9,10, muis9 , varken11en aap/mens hersenen12. De moleculaire identiteit en exacte functionele relevantie van deze bandplaatsen hebben bleef echter ongrijpbaar.
Met de bedoeling om te verder karakteriseren de bandplaatsen en te vergemakkelijken van studies over de fysiologische rol van GHB, meerdere radioligands integratie van verschillende isotopen begiftigd met verschillende affiniteiten zijn ontwikkeld ([3H] GHB, [3 H] NCS-382, [3H] HOCPCA en [125ik] BnOPh-GHB)13,14,15,16(herzien in17) (figuur 1). De combinatie van selectieve hoge-affiniteit radioligands inwoners en een bevolkingsdichtheid van de zeer hoge weefsel van de binding sites hebben toegestaan voor de productie van hoge-kwaliteit beelden met behulp van de fosfor imaging techniek9,11. Samen met een overzicht van de praktische punten bij het opzetten van een autoradiografie experiment en een illustratie te illustreren details, zal de sectie discussie benadrukken i) de keuze van de radionuclide, ii) de keuze van assay voorwaarden, en iii) het gebruik van fosfor Imaging platen versus X-ray film. Het algemene doel van deze paper is te voorzien in technische, methodologische en wetenschappelijke bijzonderheden over de techniek van autoradiografie informeren over weefsel distributie en farmacologische analyse van eiwit doelen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Absolute ethanol</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>107017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BAS-TR2040 Imaging Plate</td>
			<td>GE Healthcare Life Science</td>
			<td>28956481</td>
			<td>20x40 cm - Sensitive to tritium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cresyl violet acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5042-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPX (non-aqueous mounting medium for microscopy)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>100579</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O.C.T. Compound, 12 x 125 mL</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td>Tissue-Tek</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>16005-1KG-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-9483</td>
			<td>microscope slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Manual Slide Staining Set</td>
			<td>Sakura Finetek Denmark ApS</td>
			<td>4451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tritium Standard on Glas</td>
			<td>American Radiolabeld Chemicals, Inc.</td>
			<td>ART 0123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene substitute</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5597</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

autoradiography as a simple and powerful method for visualization and characterization of pharmacological targets

In vitro autoradiografie is gericht op het visualiseren van de anatomische distributie van een proteïne van belang in weefsel van proefdieren evenals mensen. De methode is gebaseerd op de specifieke binding van een radioligand naar haar biologische doel. Daarom, bevroren weefselsecties worden geïncubeerd met radioligand oplossing, en de binding aan de doelstelling vervolgens is gelokaliseerd door de detectie van radioactief verval, bijvoorbeeld met behulp van lichtgevoelige film of fosfor imaging platen. Resulterende digitale autoradiograms weer opmerkelijke ruimtelijke resolutie, waarmee de kwantificering en localisatie van radioligand binding in verschillende anatomische structuren. Bovendien voorziet kwantificering de farmacologische karakterisering van ligand affiniteit op door middel van dissociatieconstanten (Kd), remming-constanten zijn (Kik), alsmede de dichtheid van bandplaatsen (Bmax) in geselecteerde weefsels. De methode biedt dus informatie over zowel de doel lokalisatie en de selectiviteit van het ligand. Hier, wordt de techniek geïllustreerd met autoradiografie karakterisering van het zuur met hoge-affiniteit γ-hydroxybutyraat (GHB) bindend sites in zoogdieren hersenweefsel, met speciale nadruk op methodologische overwegingen met betrekking tot de bepaling van de bindende parameters, de keuze van de radioligand en de detectiemethode.

Met behulp van het protocol beschreven, was de anatomische distributie van de hoge-affiniteit GHB bandplaatsen gevisualiseerd met de hoeveelheid radioactief gemerkte GHB analoge [3H] HOCPCA in de hersenen van de muis, die werd gesneden in coronale, Sagittaal en horizontale secties (Figuur 3 ). Hoge niveaus van bindende werden waargenomen in de hippocampus en de cortex, lagere binding in het striatum en geen bindende werd ontdekt in het cerebellum, ...

Watch this Scientific Journal Video about Autoradiography as a Simple and Powerful Method for Visualization and Characterization of Pharmacological Targets at JoVE.com

Autoradiography as a Simple and Powerful Method for Visualization and Characterization of Pharmacological Targets

Autoradiografie als een eenvoudige en krachtige methode voor visualisatie en karakterisering van farmacologische doelstellingen

De methode van autoradiografie is routinematig gebruikt om de binding van radioligands aan weefselsecties voor bepaling van de farmacologie van kwalitatieve of kwantitatieve studie.

In vitro autoradiography aims to visualize the anatomical distribution of a protein of interest in tissue from experimental animals as well as humans. The ...

Autoradiografie is een krachtige en eenvoudige techniek om de verspreiding van eiwitbindende sites in weefsels te bestuderen met behulp van specifieke radioligen voor het doel. Het is ook een geschikt alternatief voor immunohistochemie. Deze techniek visualiseert eiwitexpressie met ruimtelijke resolutie via digitale beelden die sneller zijn dan traditionele filmbelichting.Het kan ook worden gebruikt voor farmacologische analyse van eiwitdoelen. De methode omvat muisweefsels gemonteerd op glas, maar kan worden uitgebreid tot andere soorten of zelfs tot cellen geteeld op coverslips. Het demonstreren van de procedure zal worden door Nane Griem-Krey, een promovendus in mijn laboratorium.Om te beginnen dompelt u het weefsel onder in droog ijs in poedervorm om het te bevriezen. Breng het bevroren weefsel rechtstreeks naar een cryostat die is ingesteld op min 20 graden Celsius. Laat het weefsel 20 minuten wennen tot min 20 graden Celsius in de cryostat.Bedek vervolgens de weefselhouder met inbeddingsmedium buiten de cryostat en plaats het bevroren weefselmonster snel in de gewenste oriëntatie terwijl het inbeddingsmedium nog vloeibaar is. Breng de weefselhouder terug naar de cryostat en stel het inbeddingsmedium bloot tot temperaturen onder min 10 graden Celsius voor verharding. Plaats de weefselhouder in het microtome van de cryostat.Pas de oriëntatie van het weefsel aan om schuine secties te voorkomen. Snijd het weefsel met de begeleiding van een stereotaxic atlas in secties van de gewenste dikte en ontvouwen de sectie met een kleine borstel indien nodig. Dooi zet het gedeelte op een microscoopplaat.Dan achtereenvolgens verzamelen van de secties uit de regio van belang voor de gewenste technische herhaling. Laat de secties op de glijbanen een uur drogen voordat u verder worden behandeld. Gebruik in een gecertificeerd radioactiviteitslaboratorium een potlood om de dia's te labelen met de experimentele omstandigheden.Plaats de glijbanen horizontaal in plastic trays. Breng zorgvuldig een passend volume SA-buffer toe dat is aangepast aan het doel in kwestie op de secties die op de dia's zijn gemonteerd. Zorg ervoor dat elke sectie volledig is afgedekt.Voor de bepaling van niet-specifieke binding, vul SA buffer met een relevante concentratie van niet-gelabelde verbinding. Bedek vervolgens de trays met deksels om verdamping te voorkomen. Pre-incubeer bij een relevante temperatuur gedurende 30 minuten op een plaatshaker ingesteld op 20 rpm.Giet vervolgens de pre-incubatievloeistof van elke dia af en breng de dia's terug in de plastic lade. Bedek de secties onmiddellijk volledig met de relevante concentratie van radioligen in SA-buffer. Voor de bepaling van niet-specifieke binding, aanvulling radioligen oplossing met een relevante concentratie van niet-gelabelde verbinding.Bedek de trays met deksels en uitbroed onder de gewenste omstandigheden met constant zacht schudden bij 20 tpm. Giet hierna de incubatieoplossing af en breng de dia's in een microscoopdiarek. Was onmiddellijk de glijbanen.Voor het GHB-protocol, was twee keer met ijskoude SA buffer gedurende 20 seconden en spoel vervolgens twee keer door het dompelen van de schuifrek in trays gevuld met ijskoud gedestilleerd water. Plaats de glijbanen minstens een uur verticaal in rekken en de lucht drogen. Breng de dia's vervolgens over naar een fixator met paraformaldehyde voor nachtelijke fixatie bij kamertemperatuur.Breng de dia's de volgende dag over op een desiccatorbox met silicagel op kamertemperatuur. Laat de glijbanen drie uur in de desiccatorbox staan om vocht te elimineren. Plaats eerst de secties in een stralingsafschermde imagingplaatcassette met het weefsel naar boven gericht.Neem een radioactieve microschaal op in elke cassette voor latere kwantificering van radioligen binding. Laad onmiddellijk voor gebruik de tritiumgevoelige fosforbeeldplaat in de fosforbeeldmachine en stel deze bloot aan zichtbaar infrarood licht volgens de instructies van de fabrikant om het te wissen. Verwijder vervolgens de beeldplaat van de fosforbeeldmachine en plaats deze onmiddellijk op de delen in de cassette.Zorg ervoor dat de cassette volledig gesloten is. Stel de secties bloot aan de fosforbeeldvormingsplaat voor de geoptimaliseerde belichtingstijd bij kamertemperatuur terwijl ze zijn afgeschermd van licht. Na blootstelling, open de cassette voorzichtig in het donker en breng de beeldplaat onmiddellijk over in de donkere doos van een fosforbeeldcamera.Scan de plaat met de hoogst mogelijke resolutie om een digitaal beeld te verkrijgen. Open om te beginnen een geschikt beeldanalyseprogramma. Bepaal de relatieve optische dichtheden voor elke kalibratiestandaard door de bepaling van het menu-itemgebied te selecteren.Selecteer het gereedschap voor het maken van regio's en gebruik het om een gebied van gelijke grootte te selecteren voor elk punt van de radioactieve microschaal. Wijs een getal toe aan elk geselecteerd gebied door op nummer onder het menu-itemlabel te klikken. Klik op Bestandsexport en vervolgens op 2D-regiorapport om de OD-waarden voor elk punt van de kalibratienorm te exporteren.Gebruik in de gepatenteerde beeldvormingssoftware een regiocreatietool om het interessegebied in elke sectie te selecteren en de ED's te meten om te beginnen met het uitvoeren van kwantificering van de autoradiogrammen. Selecteer hetzelfde gebied in elke sectie door een sjabloon te maken voor het gebied van belang en kopieer en pas deze aan kleine variaties in de anatomie van de hersenen in elk autoradiogram. Klik hierna op 2D-regiorapport bestand exporteren om de STAAFwaarden en -grootte van geselecteerde gebieden naar een spreadsheet te exporteren.Bepaal de binding van de radioligen zoals beschreven in het tekstprotocol. In deze studie, de anatomische verdeling van de hoge affiniteit GHB binding sites worden gevisualiseerd met de radiogelabelde GHB analoge radioactieve HOCPCA in een muis hersenen die werd gesneden in coronale, sagittale, en horizontale secties. Hoge bindingsniveaus worden gezien in de hippocampus en cortex, terwijl lagere bindingsniveaus worden gezien in het striatum en er geen binding wordt gedetecteerd in het cerebellum.Zoals hier getoond, kunnen de anatomische structuren worden gevisualiseerd met behulp van verschillende vlakken en anatomische integriteit kan worden ondersteund door cresyl violette kleuring. Representatieve autoradiogrammen van een rat, een muis en een varken illustreren het evolutionaire behoud van de hoge affiniteit GHB bindende sites in het zoogdierbrein. Radioactieve HOCPCA binding sites worden gedetecteerd in alle drie de soorten waardoor vergelijking van de bruto hersenen anatomie tussen hen.De hoge affiniteit GHB binding sites zijn onderzocht met GHB radioligands die verschillende affiniteiten voor de binding sites, maar vergelijkbare specifieke activiteiten weer te geven. Radioactieve HOCPCA is begiftigd met een hoge gevoeligheid en een uitstekende signaal-ruisverhouding. Vanwege de lagere gevoeligheid van radioactieve NCS-382 moeten hogere radioligen concentraties en concentraties worden gebruikt om vergelijkbare bindingsniveaus te verkrijgen.Nog hogere radioligen concentraties zijn nodig om radioactieve GHB vergelijkbare bindingsniveaus te bereiken. Hogere radioligies en concentraties verhogen echter ook het niveau van niet-specifieke binding met een bijgevolg lagere signaal-ruisverhouding. Het is belangrijk om de testomstandigheden zoals de radioligen concentratie, was- en belichtingstijd te optimaliseren om de beste signaal-ruisverhoudingen te krijgen en het is ook erg belangrijk om te onthouden om de plaat eerder te wissen.De procedure kan worden uitgebreid tot in vivo omstandigheden om een idee te krijgen over verbindingsbinding in een levend dier, wat nuttig kan zijn voor ontdekkingsprojecten. Vergeet niet om te werken in een laboratorium met gecertificeerd volledig radioactief materiaal en om beschermende kleding te dragen bij het hanteren van radioactiviteit of paraformaldehyde.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Simple Composite Phenotype Scoring System for Evaluating Mouse Models of Cerebellar Ataxia

A Simple Composite Fenotype Scoring System voor het evalueren van muismodellen van cerebellaire ataxie

We describe a protocol for the rapid and sensitive quantification of disease severity in mouse models of cerebella ataxia. It is derived from previously ...

Novel Apparatus and Method for Drug Reinforcement

Nieuwe inrichting en werkwijze voor Drug Reinforcement

Animal models of reinforcement have proven to be useful for understanding the neurobiological mechanisms underlying drug addiction.  Operant drug ...

The Vermicelli and Capellini Handling Tests: Simple quantitative measures of dexterous forepaw function in rats and mice

De Vermicelli en Capellini Handling Tests: Eenvoudige kwantitatieve metingen van behendige voorpootje functie in ratten en muizen

Previous characterizations of rodent eating behavior have revealed that they use coordinated forepaw movements to manipulate food pieces. We have extended ...

Automated Interactive Video Playback for Studies of Animal Communication

Geautomatiseerde Interactive Video Playback voor Studies van Animal Communication

Video playback is a widely-used technique for the controlled manipulation and presentation of visual signals in animal communication. In particular, ...

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Visualisatie van proprioceptoren in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven en poppen

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Visualisatie en genetische manipulatie van dendrieten en stekels in de muis Cerebral cortex en de hippocampus met behulp van<em&gt; In utero</em&gt; Elektroporatie

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development

Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development

Ex utero elektroporatie en Whole halfrond Explantaten: Een eenvoudige experimentele methode voor bestudering van vroege corticale ontwikkeling

Cortical development involves complex interactions between neurons and non-neuronal elements including precursor cells, blood vessels, meninges and ...

A Simple and Inexpensive Method for Determining Cold Sensitivity and Adaptation in Mice

Een eenvoudige en goedkope methode voor het bepalen Koude Gevoeligheid en aanpassing in Muizen

Cold hypersensitivity is a serious clinical problem, affecting a broad subset of patients and causing significant decreases in quality of life.  The cold ...

Live Imaging of Nicotine Induced Calcium Signaling and Neurotransmitter Release Along Ventral Hippocampal Axons

Live-Imaging van Nicotine Induced Calcium Signaling en neurotransmitterafgifte Samen ventrale hippocampus Axons

Sustained enhancement of axonal signaling and increased neurotransmitter release by the activation of pre-synaptic nicotinic acetylcholine receptors ...

A Simple Alternative to Stereotactic Injection for Brain Specific Knockdown of miRNA

Een eenvoudig alternatief voor stereotactische Injectie voor Brain Specifieke Knockdown van miRNA

MicroRNAs (miRNAs) are key regulators of gene expression.  In the brain, vital processes like neurodevelopment and neuronal functions depend on the ...