Name: autoradiography as a simple and powerful method for visualization and characterization of pharmacological targets
Uploaded: 2019-03-12T15:00:00
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Le travaux ont été subventionnés par la fondation de Lundbeck (Grant R133-A12270) et le Novo Nordisk Foundation (Grant NNF0C0028664). Les auteurs remercient Dr Aleš Marek pour la fourniture du radioligand [3H].

Tous les animaux de manutention a été réalisée en conformité avec les directives de l’inspection d’expérimentation animale danois.
Remarque : Le protocole décrit ici couvre la préparation du tissu (c.-à-d., tissu de cerveau de souris), l’essai in vitro autoradiographique avec suffisamment de détails pour mettre en place la méthode dans un nouveau laboratoire, l’exposition aux images de plaques au phosphore ainsi que analyse densitométrique subséquente d?...

La qualité d’un test autoradiographique est le plus souvent déterminée par la sensibilité au radioligand. Un facteur important est le radio-isotope sélectionné, qui est indiqué par la disponibilité de ligands connus ou de la faisabilité des techniques spécifiques de l’étiquetage à céder des ligands avec une activité spécifique appropriée (c'est-à-dire, la quantité de radioactivité par mole d’unité un radioligand)23et avec une quantité limitée de dégradation ch...

Autoradiographie est une méthode qui fournit des images de désintégration radioactive. La technique est couramment utilisée pour étudier la distribution tissulaire d’une protéine d’intérêt en vitro basée sur une interaction pharmacologique spécifique entre un composé radiomarqué et sa cible. Ceci fournit des informations directes sur la sélectivité du ligand pour la cible. In vitro autoradiographie peut également être utilisé pour la détermination quantitative des paramètres de liaison pharmacologique des radioligands, tels que la constante de dissociation (Kd) et la densité des sites de fixation (Bmax), ainsi que pour déterminer la constante d’inhibition (Ki) concurrentes des ligands1,2. Par rapport aux traditionnels homogénat radioligands, autoradiographie a l’avantage d’être en mesure de visualiser l’anatomie du spatial et donnant des détails succincts sur expression régionale modèles3. La méthode d’autoradiographie est donc une alternative pertinente à l’immunocytochimie, surtout en l’absence d’un anticorps validé. Autoradiographie est facilement mis en œuvre dans un laboratoire de radio-isotope standard compte tenu de la disponibilité d’un radioligand adapté avec la spécificité pharmacologique requise, l’accès à un cryostat microtome servant à préparer des sections de tissu et une imagerie adaptée appareil qui est capable d’analyser la répartition de la radioactivité dans les sections respectives de tissu. Notamment, un critère de sélection important pour radioligand est une quantité limitée de liaison aux sites non ciblés. Ceci peut être à d’autres protéines, les membranes ou les matériaux comme le plastique ou les filtres et est collectivement dénommé non-spécifiques. Habituellement, non-spécifiques est non saturable mais peut être saturable si il s’agit d’une protéine spécifique de la cible. Le meilleur moyen de validation véritable fixation spécifique est à comparer aux tissus manque la cible, par exemple, génétiquement machiné des tissus (knock-out)4.
Ici, la méthode est illustrée par la caractérisation autoradiographique du site de liaison de haute affinité pour l’acide gamma-hydroxybutyrique (GHB) dans le cerveau des mammifères. Comprendre l’interaction pharmacologique du GHB et son site de liaison est pertinent que le GHB est une drogue tant cliniquement utile dans le traitement de la narcolepsie et l’alcoolisme5, mais aussi un constituant naturel du cerveau mammifère et un loisir 6de drogue. Sites de liaison de haute affinité GHB ont été les premiers décrits à l’aide de la [3H] liant de GHB au cerveau de rat homogénat7. Au cours des années, poursuivre des études d’autoradiographie [3H] GHB et l’analogue de la [3H] NCS-382 a montré une forte densité de sites dans les régions du cerveau de rat8,9,10, souris9 de liaison ,11et singe/homme cerveau12de porc. Cependant, l’identité moléculaire et la pertinence fonctionnelle exact de ces sites de liaison sont restés insaisissables.
Avec l’intention de mieux caractériser les sites de liaison et à faciliter les études sur le rôle physiologique du GHB, multiples radioligands incorporant différents isotopes dotés d’affinités différentes ont été développés ([3H] GHB, [3 H] NCS-382, [3H] HOCPCA et [125j’ai] BnOPh-GHB)13,14,15,16(revu en17) (Figure 1). La combinaison des radioligands de haute affinité sélective et une densité de tissu très élevée de la liaison de sites ont permis pour la production d’images de haute qualité en utilisant la technique9,11-images au phosphore. Ainsi qu’un aperçu des points pratiques à mettre en place une expérience autoradiographique et une illustration pour illustrer les détails, la section discussion mettra l’accent sur i) le choix du radionucléide, ii) le choix des conditions expérimentales et iii) l’utilisation de phosphore plaques d’imagerie contre le film radiographique. L’objectif général de ce document est de fournir des détails techniques, méthodologiques et scientifiques sur la technique d’autoradiographie pour informer la distribution tissulaire et analyse pharmacologique des protéines cibles.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Absolute ethanol</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>107017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BAS-TR2040 Imaging Plate</td>
			<td>GE Healthcare Life Science</td>
			<td>28956481</td>
			<td>20x40 cm - Sensitive to tritium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cresyl violet acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5042-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPX (non-aqueous mounting medium for microscopy)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>100579</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O.C.T. Compound, 12 x 125 mL</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td>Tissue-Tek</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>16005-1KG-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-9483</td>
			<td>microscope slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Manual Slide Staining Set</td>
			<td>Sakura Finetek Denmark ApS</td>
			<td>4451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tritium Standard on Glas</td>
			<td>American Radiolabeld Chemicals, Inc.</td>
			<td>ART 0123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene substitute</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5597</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

autoradiography as a simple and powerful method for visualization and characterization of pharmacological targets

In vitro autoradiographie a pour but de visualiser la répartition anatomique d’une protéine d’intérêt dans les tissus des animaux de laboratoire ainsi que les êtres humains. La méthode est basée sur la liaison spécifique d’un radioligand vers sa cible biologique. C’est pourquoi, coupes de tissus congelés sont incubés avec solution radioligand, et la liaison à la cible est ensuite localisée par la détection de la radioactivité, par exemple, en utilisant le film photosensible ou plaques-images au phosphore. Autoradiogrammes numériques qui en résulte affichent une résolution spatiale remarquable, ce qui permet la quantification et la localisation des radioligands dans des structures anatomiques distinctes. En outre, quantification permet la caractérisation pharmacologique de l’affinité du ligand au moyen des constantes de dissociation (Kd), les constantes d’inhibition (Kj’ai) ainsi que la densité des sites de fixation (Bmax) dans les tissus choisis. Ainsi, la méthode fournit des informations sur la localisation de la cible tant de sélectivité de ligand. Ici, la technique est illustrée avec caractérisation autoradiographique de l’acide de haute affinité gamma-hydroxybutyrique (GHB) accepteurs dans le tissu de cerveau des mammifères, avec un accent particulier sur les considérations d’ordre méthodologiques concernant l’essai de liaison paramètres, le choix de la méthode de détection et de radioligand.

En utilisant le protocole décrit, la répartition anatomique des sites de liaison de haute affinité GHB a été visualisée avec l’analogue GHB radiomarqué [3H] HOCPCA dans le cerveau de souris, qui a été coupé en sections coronales, sagittales et horizontales (Figure 3 ). Des niveaux élevés de liaison ont été observés dans l’hippocampe et le cortex, une liaison plus faible dans le striatum et aucune liaison n’a été détectés da...

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Autoradiography as a Simple and Powerful Method for Visualization and Characterization of Pharmacological Targets

Autoradiographie comme une méthode Simple et puissante pour la visualisation et la caractérisation des cibles pharmacologiques

La méthode d’autoradiographie est systématiquement utilisée pour étudier la liaison des radioligands sections de tissu pour la détermination de la pharmacologie qualitative ou quantitative.

In vitro autoradiography aims to visualize the anatomical distribution of a protein of interest in tissue from experimental animals as well as humans. The ...

L’autoradiographie est une technique puissante et simple pour étudier la distribution des sites de liaison protéique dans les tissus à l’aide de radioligands spécifiques pour la cible. C’est aussi une alternative appropriée à l’immunohistochimie. Cette technique visualise l’expression protéique avec une résolution spatiale via des images numériques qui est plus rapide que l’exposition cinématographique traditionnelle.Il peut également être utilisé pour l’analyse pharmacologique des cibles protéiques. La méthode implique des tissus de souris montés sur le verre, mais peuvent être étendus à d’autres espèces ou même à des cellules cultivées sur des coverslips. Nane Griem-Krey, doctorante dans mon laboratoire, démontrera la procédure.Pour commencer, submergez le tissu dans de la glace sèche en poudre pour le congeler. Transférez le tissu congelé directement à un cryostat qui est réglé à moins 20 degrés Celsius. Laissez le tissu s’acclimater à moins 20 degrés Celsius dans le cryostat pendant 20 minutes.Couvrez ensuite le support tissulaire avec le milieu d’intégration à l’extérieur du cryostat et placez rapidement le spécimen de tissu congelé dans l’orientation désirée tandis que le milieu d’intégration est encore liquide. Transférez le porte-tissus au cryostat et exposez le milieu d’intégration à des températures inférieures à moins 10 degrés Celsius pour le durcissement. Placez le porte-tissus dans la microtome du cryostat.Ajustez l’orientation du tissu pour éviter les sections inclinées. Couper le tissu avec le guidage d’un atlas stéréotaxique dans les sections de l’épaisseur désirée et déplier la section avec une petite brosse si nécessaire. Décongeler la section sur une lame de microscope.Puis recueillir séquentiellement les sections de la région d’intérêt pour la répétition technique souhaitée. Laissez sécher les sections sur les glissières pendant une heure avant de les manipuler davantage. Dans un laboratoire de radioactivité certifié, utilisez un crayon pour étiqueter les diapositives avec les conditions expérimentales.Placez les glissières horizontalement dans des plateaux en plastique. Appliquez soigneusement un volume approprié de tampon SA ajusté à la cible en question sur les sections montées sur les glissières. Assurez-vous que chaque section est entièrement couverte.Pour la détermination de la liaison non spécifique, compléter sa tampon avec une concentration pertinente de composé non étiqueté. Couvrez ensuite les plateaux de couvercles pour éviter l’évaporation. Pré-incubation à une température pertinente pendant 30 minutes sur un shaker de plaque réglé à 20 rpm.Ensuite, versez le liquide de pré-incubation de chaque diapositive et transférez les glissières dans le plateau en plastique. Couvrez immédiatement les sections complètement avec la concentration pertinente de radioligand dans le tampon SA. Pour la détermination de la liaison non spécifique, compléter la solution radioligand avec une concentration pertinente de composé non étiqueté.Couvrir les plateaux de couvercles et incuber dans les conditions désirées avec des secousses douces constantes à 20 rpm. Après cela, versez la solution d’incubation et transférez les glissières dans un support de glissière de microscope. Lavez immédiatement les glissières.Pour le protocole GHB, lavez-le deux fois avec un tampon SA glacé pendant 20 secondes, puis rincez deux fois en trempant le bac à glissière dans des plateaux remplis d’eau distillée glacée. Placez les glissières verticalement dans des supports et séchez l’air pendant au moins une heure. Ensuite, transférez les glissières à un fixateur contenant du paraformaldéhyde pour une fixation pendant la nuit à température ambiante.Le lendemain, transférez les glissières dans une boîte de dessiccator contenant du gel de silice à température ambiante. Laissez les glissières dans la boîte de dessiccator pendant trois heures pour éliminer l’humidité. Tout d’abord, placez les sections dans une cassette de plaque d’imagerie blindée par rayonnement avec le tissu face vers le haut.Inclure une microécoque radioactive dans chaque cassette pour la quantification ultérieure de la liaison radioligand. Immédiatement avant l’utilisation, chargez la plaque d’imagerie au phosphore sensible au tritium dans la machine d’imagerie au phosphore et exposez-la à la lumière infrarouge visible selon les instructions du fabricant pour l’effacer. Retirez ensuite la plaque d’imagerie de la machine d’imagerie au phosphore et placez-la immédiatement sur les sections de la cassette.Assurez-vous que la cassette est complètement fermée. Exposez les sections à la plaque d’imagerie au phosphore pour le temps d’exposition optimisé à température ambiante tout en étant à l’abri de la lumière. Après l’exposition, ouvrez soigneusement la cassette dans l’obscurité et transférez immédiatement la plaque d’imagerie dans la boîte noire d’un imageur de phosphore.Numérisez la plaque à la plus haute résolution possible pour obtenir une image numérique. Pour commencer, ouvrez un programme d’analyse d’image approprié. Déterminez les densités optiques relatives pour chaque norme d’étalonnage en sélectionnant la détermination de la région de l’élément de menu.Sélectionnez l’outil pour la création de la région et utilisez-le pour sélectionner une zone de taille égale pour chaque point de la microscale radioactive. Attribuez un numéro à chaque zone sélectionnée en cliquant sur le numéro sous l’étiquette de l’élément de menu. Cliquez sur L’exportation de fichiers, puis le rapport de région 2D pour exporter les valeurs od pour chaque point de la norme d’étalonnage.Dans le logiciel d’imagerie propriétaire, utilisez un outil de création de région pour sélectionner la région d’intérêt dans chaque section et mesurer ses OD pour commencer à effectuer la quantification des autoradiogrammes. Sélectionnez la même région dans chaque section en créant un modèle pour la région d’intérêt et copiez-la et ajustez-la aux variations mineures de l’anatomie cérébrale dans chaque autoradiogramme. Par la suite, cliquez sur Rapport de région 2D d’exportation de fichiers pour exporter les valeurs et tailles ROD de zones sélectionnées dans une feuille de calcul.Déterminer la liaison du radioligand tel qu’il est décrit dans le protocole texte. Dans cette étude, la distribution anatomique des emplacements de liaison de GHB à haute affinité sont visualisées avec le GHB analogique radiolabeled HOCPCA radioactif dans un cerveau de souris qui a été coupé en sections coronal, sagittale, et horizontale. Des niveaux élevés de liaison sont observés dans l’hippocampe et le cortex tandis que des niveaux de liaison inférieurs sont observés dans le striatum et aucune liaison n’est détectée dans le cervelet.Comme indiqué ici, les structures anatomiques peuvent être visualisées à l’aide de différents plans et l’intégrité anatomique peut être soutenue par la coloration violette crésyle. Des autoradiogrammes représentatifs d’un rat, d’une souris et d’un porc illustrent la conservation évolutive des sites de liaison ghb à haute affinité dans le cerveau des mammifères. Des sites de liaison radioactifs hocpca sont détectés dans les trois espèces permettant la comparaison de l’anatomie brute du cerveau entre eux.Les sites de liaison ghb à forte affinité sont sondés avec des radioligands GHB qui présentent des affinités différentes pour les sites de liaison, mais des activités spécifiques comparables. Radioactive HOCPCA est doté d’une sensibilité élevée et d’un excellent rapport signal/bruit. En raison de la sensibilité plus faible du NCS-382 radioactif, des concentrations plus élevées de radioligand doivent être utilisées afin d’obtenir des niveaux similaires de liaison.Des concentrations de radioligands encore plus élevées sont nécessaires pour que le GHB radioactif atteigne des niveaux de liaison comparables. Toutefois, des concentrations plus élevées de radioligands augmentent également le niveau de liaison non spécifique avec un rapport signal/bruit par conséquent plus faible. Il est important d’optimiser les conditions d’analyse comme la concentration de radioligand, le lavage et le temps d’exposition afin d’obtenir le meilleur signal aux rapports de bruit et il est également très important de se rappeler d’effacer la plaque avant.La procédure peut être étendue à des conditions in vivo pour avoir une idée sur la liaison composée chez un animal vivant qui pourrait être utile pour des projets de découverte. N’oubliez pas de travailler dans un laboratoire avec des matières radioactives certifiées pleines et de porter des vêtements de protection lors de la manipulation de la radioactivité ou du paraformaldéhyde.

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