Name: autoradiography as a simple and powerful method for visualization and characterization of pharmacological targets
Uploaded: 2019-03-12T15:00:00
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Die Arbeit wurde von Lundbeck Stiftung (Grant R133-A12270) und der Novo Nordisk (Grant NNF0C0028664) unterstützt. Die Autoren danken Dr. Aleš Marek für die Lieferung von [3H] Radioligand.

Alle Tier Handhabung wurde nach den Richtlinien von der dänischen Tier Experimente Inspektion durchgeführt.
Hinweis: Die hier beschriebene Protokoll deckt Gewebe Vorbereitung (d.h.Maus Hirngewebe), die in-vitro- autoradiographischen Assay ausreichend detailliert für den Aufbau der Methode in ein neues Labor, die Exposition gegenüber Phosphor imaging-Platten sowie anschließenden densitometrischen Analyse der Autoradiograms (Abbildung 2) mit d...

Die Qualität einer autoradiographischen Assay wird am häufigsten durch die Empfindlichkeit der Radioligand bestimmt. Ein wichtiger Faktor ist die ausgewählte Radioisotop, die durch die Verfügbarkeit von bekannten Liganden oder durch die Machbarkeit von spezifischen Kennzeichnung Techniken Liganden mit entsprechenden spezifischen Aktivität (d. h., die Menge an Radioaktivität Ausbeute gegeben ist pro Einheit Mol ein Radioligand)23und mit begrenzten Mengen an chemischen Abbau. Eine gro...

Autoradiographie ist eine Methode, die Bilder des radioaktiven Zerfalls liefert. Die Technik wird routinemäßig eingesetzt, um die Gewebeverteilung eines Proteins des Interesses in Vitro basierend auf eine spezifische pharmakologische Interaktion zwischen einer radioaktiv Verbindung und ihr Ziel zu studieren. Dies bietet direkte Informationen über die Selektivität des Liganden für das Ziel. In-vitro- Autoradiographie kann auch verwendet werden, für die quantitative Bestimmung der pharmakologischen Bindungsparameter von Radioligands, wie z. B. die Dissoziationskonstante (K-d) und die Dichte der Bindungsstellen (Bmax), sowie für die Bestimmung die Hemmung-Konstante (Ki) von konkurrierenden Liganden1,2. Im Vergleich zu traditionellen Homogenat Radioligand Bindung, hat Autoradiographie den Vorteil des Seins in der Lage, räumliche Anatomie zu visualisieren und prägnante Angabe der regionalen Ausdruck Muster3. Die Methode der Autoradiographie ist daher eine entsprechende Alternative zu Immunocytochemistry, insbesondere in der Abwesenheit eines validierten Antikörpers. Autoradiographie ist in einem standard Radioisotop Labor angesichts der Verfügbarkeit von geeigneten Radioligand mit der erforderlichen pharmakologischen Spezifität, Zugriff auf ein Mikrotom Kryostat für die Zubereitung von Gewebeschnitten und eine geeignete Imaging einfach umsetzen. Gerät, das die Verteilung der Radioaktivität in den jeweiligen Gewebeschnitten analysieren kann. Bemerkenswert ist, ist ein wichtiges Auswahlkriterium für die Radioligand eine begrenzte Menge an Bindung an Nichtziel-Seiten. Dies kann an andere Proteine, Membranen oder Materialien wie Kunststoff oder Filter, und ist gemeinsam als unspezifische Bindung bezeichnet. In der Regel kann unspezifische Bindung ist nicht Humanserumproteine aber Humanserumproteine wenn es handelt sich um ein bestimmtes Ziel-Protein. Der beste Weg der Validierung wahre spezifische Bindung ist vergleichbar zu den Geweben fehlt das Ziel, z.B.genetisch (Knock-out) Gewebe4entwickelt.
Hier ist die Methode mit der autoradiographischen Charakterisierung der hohen Affinität Bindungsstelle für γ-Hydroxybutyric Säure (GHB) in das Gehirn von Säugetieren illustriert. Verständnis der pharmakologischen Wechselwirkung zwischen GHB und seine Bindungsstelle ist von Bedeutung, da GHB sowohl ein klinisch nützlich Medikament in der Behandlung von Narkolepsie und Alkoholismus5, sondern auch ein natürlicher Bestandteil der das Gehirn von Säugetieren und ein Erholungs-ist Droge-6. Hohe Affinität GHB Bindungsstellen wurden erstmals über [3H] GHB Bindung an Ratte Gehirn Homogenat7beschrieben. Im Laufe der Jahre weitere Autoradiographie Studien mit [3H] GHB und die analoge [3H] NCS-382 zeigte eine hohe Dichte an Bindungsstellen im Vorderhirn Regionen Ratte8,9,10, Maus9 ,11und Affe/Mensch Gehirn12Schwein. Jedoch blieben die molekulare Identität und genaue funktionelle Relevanz der diese Bindungsstellen schwer fassbaren.
Mit der Absicht, weiter die Bindungsstellen charakterisieren, und Studien über die physiologische Rolle von GHB zu erleichtern, wurden mehrere Radioligands mit verschiedenen Isotopen, ausgestattet mit verschiedenen Affinitäten entwickelt ([3H] GHB, [3 H] NCS-382, [3H] HOCPCA und [125ich] BnOPh GHB)13,14,15,16(rezensiert in17) (Abbildung 1). Die Kombination von selektiven High-Affinity Radioligands und eine sehr hohe Gewebe Dichte der Bindung, die Standorte für die Herstellung von qualitativ hochwertigen Bilder mit den Phosphor imaging Technik9,11erlaubt haben. Zusammen mit einen Überblick über die praktischen Punkte bei der Einrichtung ein autoradiographischen Experiment und eine Illustration zu Details zu veranschaulichen wird die Diskussion Abschnitt (i) die Wahl des Radionuklids, (Ii) die Wahl der Assay-Bedingungen und (Iii) die Verwendung von Phosphor betonen. Bildplatten versus Röntgenfilm. Das übergeordnete Ziel dieses Papiers ist es, die wissenschaftlichen, technischen und methodischen Details auf die Autoradiographie Technik zur Verfügung, für die Information über Gewebeverteilung und pharmakologische Analyse von Protein-Targets.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Absolute ethanol</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>107017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BAS-TR2040 Imaging Plate</td>
			<td>GE Healthcare Life Science</td>
			<td>28956481</td>
			<td>20x40 cm - Sensitive to tritium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cresyl violet acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5042-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPX (non-aqueous mounting medium for microscopy)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>100579</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O.C.T. Compound, 12 x 125 mL</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td>Tissue-Tek</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>16005-1KG-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-9483</td>
			<td>microscope slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Manual Slide Staining Set</td>
			<td>Sakura Finetek Denmark ApS</td>
			<td>4451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tritium Standard on Glas</td>
			<td>American Radiolabeld Chemicals, Inc.</td>
			<td>ART 0123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene substitute</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5597</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

autoradiography as a simple and powerful method for visualization and characterization of pharmacological targets

In-vitro- Autoradiographie zielt darauf ab, die anatomische Verteilung eines Proteins des Interesses an Gewebe von Versuchstieren sowie Menschen zu visualisieren. Die Methode basiert auf die spezifische Bindung von Radioligand zu seinem biologischen Ziel. Daher sind gefrorene Gewebeschnitte mit Radioligand Lösung inkubiert und die Bindung an das Ziel später lokalisiert ist durch den Nachweis des radioaktiven Zerfalls, z. B. mithilfe von lichtempfindlichen Film oder Phosphor imaging-Platten. Daraus resultierende digitale Autoradiograms zeigen bemerkenswerte räumlichen Auflösung, der Quantifizierung und Lokalisierung von Radioligand Bindung in unterschiedlichen anatomischen Strukturen ermöglicht. Darüber hinaus erlaubt die Quantifizierung für die pharmakologische Charakterisierung von Liganden Affinität durch Dissoziation konstanten (K-d), Hemmung konstanten (Kich) sowie die Dichte der Bindungsstellen (Bmax) in ausgewählten Geweben. So bietet die Methode Informationen über Ziel Lokalisierung und Liganden Selektivität. Hier ist die Technik mit autoradiographischen Charakterisierung der hohen Affinität γ-Hydroxybutyric Säure (GHB) Bindungsstellen im Gehirn von Säugetieren Gewebe, mit besonderem Schwerpunkt auf methodische Überlegungen bezüglich der verbindlichen Test beispielhaft dargestellt Parameter, die Wahl der Radioligand und das Nachweisverfahren.

Mit der beschriebenen Protokoll, die anatomische Verteilung der hohen Affinität GHB verbindliche Aufstellungsorte wurde visualisiert mit radioaktiv GHB analog [3H] HOCPCA im Gehirn der Maus, die in koronalen, sagittalen und horizontalen Abschnitte (Abbildung 3 geschnitten wurde ). Hohes Maß an Bindung im Hippocampus und Cortex beobachtet wurden, geringere Bindung im Striatum und keine Bindung war im Kleinhirn, entspricht früheren gemeldeten Expr...

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Autoradiography as a Simple and Powerful Method for Visualization and Characterization of Pharmacological Targets

Autoradiographie als eine einfache und leistungsfähige Methode zur Visualisierung und Charakterisierung von pharmakologischen Ziele

Die Methode der Autoradiographie wird routinemäßig zur Bindung von Radioligands an Gewebeschnitten zur Bestimmung der qualitativen oder quantitativen Pharmakologie zu studieren.

In vitro autoradiography aims to visualize the anatomical distribution of a protein of interest in tissue from experimental animals as well as humans. The ...

Autoradiographie ist eine leistungsstarke und einfache Technik, um die Verteilung von Proteinbindungsstellen in Geweben mit spezifischen Radioligand für das Ziel zu untersuchen. Es ist auch eine geeignete Alternative zur Immunhistochemie. Diese Technik visualisiert den Proteinausdruck mit räumlicher Auflösung über digitale Bilder, die schneller als herkömmliche Filmbelichtung ist.Es kann auch für die pharmakologische Analyse von Protein-Targets verwendet werden. Die Methode umfasst Mausgewebe, die auf Glas montiert sind, kann aber auf andere Arten oder sogar auf Zellen ausgedehnt werden, die auf Deckellipsen angebaut werden. Die Demonstration des Verfahrens wird von Nane Griem-Krey, einer Doktorandin in meinem Labor, sein.Um zu beginnen, tauchen Sie das Gewebe in pulverisiertes Trockeneis, um es zu fangen einfrieren. Übertragen Sie das gefrorene Gewebe direkt in einen Kryostat, der auf minus 20 Grad Celsius eingestellt ist. Lassen Sie das Gewebe auf minus 20 Grad Celsius im Kryostat für 20 Minuten akklimatisieren.Dann bedecken Sie den Gewebehalter mit einbettendem Medium außerhalb des Kryostats und legen Sie die gefrorene Gewebeprobe schnell in die gewünschte Ausrichtung, während das Einbettmedium noch flüssig ist. Den Gewebehalter zurück in den Kryostat geben und das Einbettmedium Temperaturen unter minus 10 Grad Celsius zur Verhärtung aussetzen. Positionieren Sie den Gewebehalter im Mikrotom des Kryostats.Passen Sie die Ausrichtung des Gewebes an, um geneigte Abschnitte zu vermeiden. Schneiden Sie das Gewebe unter Anleitung eines stereotaxic Atlas in Abschnitten der gewünschten Dicke und entfalten Sie den Abschnitt mit einem kleinen Pinsel, wenn nötig. Tauen Sie den Abschnitt auf einem Mikroskopschlitten montieren.Dann sammeln Sie sequenziell die Abschnitte aus dem Interessengebiet für die gewünschte technische Wiederholung. Lassen Sie die Abschnitte auf den Dias eine Stunde lang trocknen, bevor Sie weiterhand finden. Verwenden Sie in einem zertifizierten Radioaktivitätslabor einen Bleistift, um die Dias mit den experimentellen Bedingungen zu kennzeichnen.Platzieren Sie die Dias horizontal in Kunststoffschalen. Wenden Sie sorgfältig ein entsprechendes Volumen des sA-Puffers an, der an das betreffende Ziel angepasst ist, auf die auf den Folien montierten Abschnitte an. Stellen Sie sicher, dass jeder Abschnitt vollständig abgedeckt ist.Zur Bestimmung der unspezifischen Bindung, ergänzen SA Puffer mit einer relevanten Konzentration von unbeschrifteten Verbindung. Dann bedecken Sie die Schalen mit Deckeln, um Verdunstung zu vermeiden. Vorinkubieren bei einer relevanten Temperatur für 30 Minuten auf einem Plattenschütter auf 20 Rpm eingestellt.Als nächstes gießen Sie die Vorinkubationsflüssigkeit aus jedem Dia ab und übertragen Sie die Dias wieder in die Kunststoffschale. Die Abschnitte sofort vollständig mit der entsprechenden Konzentration von Radioligand im SA-Puffer abdecken. Zur Bestimmung der unspezifischen Bindung, ergänzen Radioligand-Lösung mit einer relevanten Konzentration von unbeschrifteter Verbindung.Bedecken Sie die Schalen mit Deckeln und brüten Unter den gewünschten Bedingungen mit konstantem sanftem Schütteln bei 20 U/min. Danach die Inkubationslösung abgießen und die Dias in ein Mikroskop-Dia-Rack übertragen. Waschen Sie die Dias sofort.Für das GHB-Protokoll zweimal mit eiskaltem SA-Puffer für 20 Sekunden waschen und dann zweimal abspülen, indem Sie das Schieberegal in Schalen tauchen, die mit eiskaltem destilliertem Wasser gefüllt sind. Positionieren Sie die Schlitten vertikal in Dengestellen und trocknen Sie sie mindestens eine Stunde lang. Dann übertragen Sie die Dias auf einen Fixator, der Paraformaldehyd zur nächtlichen Fixierung bei Raumtemperatur enthält.Übertragen Sie die Dias am nächsten Tag in eine Trockenbaubox mit Kieselgel bei Raumtemperatur. Lassen Sie die Dias in der Trockenzisator-Box für drei Stunden, um Feuchtigkeit zu beseitigen. Legen Sie die Abschnitte zunächst in eine strahlungsabgeschirmte Bildkassette mit nach oben gerichtetem Gewebe.Fügen Sie eine radioaktive Mikroskala in jede Kassette für die nachfolgende Quantifizierung der Radioligand-Bindung ein. Laden Sie die tritiumempfindliche Phosphor-Bildgebungsplatte unmittelbar vor dem Einsatz in die Phosphor-Bildgebungsmaschine und setzen Sie sie gemäß den Anweisungen des Herstellers sichtbarem Infrarotlicht aus, um sie zu löschen. Entfernen Sie dann die Bildplatte von der Phosphor-Bildgebungsmaschine und legen Sie sie sofort auf die Abschnitte in der Kassette.Stellen Sie sicher, dass die Kassette vollständig geschlossen ist. Setzen Sie die Abschnitte der Phosphor-Bildgebungsplatte für die optimierte Belichtungszeit bei Raumtemperatur aus, während sie vor Licht geschützt ist. Nach der Belichtung die Kassette im Dunkeln vorsichtig öffnen und die Bildplatte sofort in die dunkle Box eines Phosphor-Imagers übertragen.Scannen Sie die Platte mit der höchstmöglichen Auflösung, um ein digitales Bild zu erhalten. Öffnen Sie zunächst ein entsprechendes Bildanalyseprogramm. Bestimmen Sie die relativen optischen Dichten für jeden Kalibrierungsstandard, indem Sie die Bestimmung des Menüpunktbereichs auswählen.Wählen Sie das Werkzeug für die Regionserstellung aus, und verwenden Sie es, um einen Bereich gleicher Größe für jeden Punkt der radioaktiven Mikroskala auszuwählen. Weisen Sie jedem ausgewählten Bereich eine Nummer zu, indem Sie auf die Nummer unter der Menüelementbeschriftung klicken. Klicken Sie auf Dateiexport und dann auf 2D-Regionsbericht, um die OD-Werte für jeden Punkt des Kalibrierungsstandards zu exportieren.Verwenden Sie in der proprietären Imaging-Software ein Regionserstellungstool, um den Bereich auszuwählen, der für jeden Abschnitt von Interesse ist, und messen Sie seine ODs, um mit der Quantifizierung der Autoradiogramme zu beginnen. Wählen Sie in jedem Abschnitt den gleichen Bereich aus, indem Sie eine Vorlage für den Interessenbereich erstellen und kopieren und an kleinere Variationen der Gehirnanatomie in jedem Autoradiogramm anpassen. Klicken Sie anschließend auf Dateiexport-2D-Regionsbericht, um die ROD-Werte und -Größen ausgewählter Bereiche in eine Kalkulationstabelle zu exportieren.Bestimmen Sie die Bindung des Radioligands, wie im Textprotokoll beschrieben. In dieser Studie wird die anatomische Verteilung der hochaffinen GHB-Bindungsstellen mit dem radioaktiv markierten GHB analogen radioaktiven HOCPCA in einem Maushirn visualisiert, das in koronale, sagittale und horizontale Abschnitte geschnitten wurde. Hohe Bindungsraten sind im Hippocampus und Kortex zu beobachten, während niedrigere Bindungswerte im Striatum beobachtet werden und keine Bindung im Kleinhirn nachgewiesen wird.Wie hier gezeigt, können die anatomischen Strukturen mit verschiedenen Ebenen visualisiert werden und die anatomische Integrität kann durch kresylviolette Färbung unterstützt werden. Repräsentative Autoradiogramme einer Ratte, einer Maus und eines Schweins veranschaulichen die evolutionäre Erhaltung der hohen Affinitäts-GHB-Bindungsstellen im Säugetierhirn. Radioaktive HOCPCA-Bindungsstellen werden bei allen drei Arten nachgewiesen, die einen Vergleich der groben Hirnanatomie zwischen ihnen ermöglichen.Die hochaffinen GHB-Bindungsstellen werden mit GHB-Radioliganden untersucht, die unterschiedliche Affinitäten für die Bindungsstellen, aber vergleichbare spezifische Aktivitäten aufweisen. Radioaktives HOCPCA ist mit einer hohen Empfindlichkeit und einem ausgezeichneten Signal-Rausch-Verhältnis ausgestattet. Aufgrund der geringeren Empfindlichkeit des radioaktiven NCS-382 müssen höhere Radioligaandkonzentrationen verwendet werden, um ähnliche Bindungswerte zu erhalten.Noch höhere Radioligaand-Konzentrationen sind notwendig, damit radioaktive SGH B vergleichbare Bindungswerte erreichen können. Höhere Radioligand-Konzentrationen erhöhen jedoch auch den Grad der unspezifischen Bindung mit einem folglich niedrigeren Signal-Rausch-Verhältnis. Es ist wichtig, die Assay-Bedingungen wie die Radioligand-Konzentration, Wasch- und Belichtungszeit zu optimieren, um die besten Signal-Rausch-Verhältnisse zu erhalten, und es ist auch sehr wichtig, sich daran zu erinnern, die Platte vorher zu löschen.Das Verfahren kann auf in vivo-Bedingungen ausgedehnt werden, um eine Vorstellung von der Verbindungsbindung in einem lebenden Tier zu bekommen, die für Entdeckungsprojekte nützlich sein könnte. Denken Sie daran, in einem Labor mit zertifiziertem vollradioaktivem Material zu arbeiten und Schutzkleidung beim Umgang mit Radioaktivität oder Paraformaldehyd zu tragen.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Simple Composite Phenotype Scoring System for Evaluating Mouse Models of Cerebellar Ataxia

Eine einfache Composite-Phänotyp Scoring System für die Beurteilung von Mausmodellen zerebelläre Ataxie

We describe a protocol for the rapid and sensitive quantification of disease severity in mouse models of cerebella ataxia. It is derived from previously ...

Forschung

Neurowissenschaften

Novel Apparatus and Method for Drug Reinforcement

Neuartige Geräte und Verfahren zur Drug Reinforcement

Animal models of reinforcement have proven to be useful for understanding the neurobiological mechanisms underlying drug addiction.  Operant drug ...

The Vermicelli and Capellini Handling Tests: Simple quantitative measures of dexterous forepaw function in rats and mice

Die Vermicelli und Capellini Handhabung Tests: Einfache quantitative Maßnahmen der geschickten Vorderpfote Funktion bei Ratten und Mäusen

Previous characterizations of rodent eating behavior have revealed that they use coordinated forepaw movements to manipulate food pieces. We have extended ...

Automated Interactive Video Playback for Studies of Animal Communication

Automatisierte Interactive Video Playback für Studies of Animal Communication

Video playback is a widely-used technique for the controlled manipulation and presentation of visual signals in animal communication. In particular, ...

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

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Visualisierung von Propriozeptoren in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven und Puppen

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Visualisierung und genetische Manipulation von Dendriten und Dornen in der Maus Hirnrinde und im Hippocampus mit<em&gt; In utero</em&gt; Die Elektroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development

Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development

Ex utero Elektroporation und Whole Hemisphäre Explantate: A Simple Experimentelle Methode für Studien der frühen kortikalen Entwicklung

Cortical development involves complex interactions between neurons and non-neuronal elements including precursor cells, blood vessels, meninges and ...

A Simple and Inexpensive Method for Determining Cold Sensitivity and Adaptation in Mice

Eine einfache und kostengünstige Methode zur Bestimmung der Überempfindlichkeit auf Kälte und Anpassung an der Maus

Cold hypersensitivity is a serious clinical problem, affecting a broad subset of patients and causing significant decreases in quality of life.  The cold ...

Live Imaging of Nicotine Induced Calcium Signaling and Neurotransmitter Release Along Ventral Hippocampal Axons

Live-Imaging von Nikotin induzierte Calcium Signaling und Neurotransmitterausschüttung Zusammen Ventral Hippocampus Axone

Sustained enhancement of axonal signaling and increased neurotransmitter release by the activation of pre-synaptic nicotinic acetylcholine receptors ...

A Simple Alternative to Stereotactic Injection for Brain Specific Knockdown of miRNA

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MicroRNAs (miRNAs) are key regulators of gene expression.  In the brain, vital processes like neurodevelopment and neuronal functions depend on the ...