Name: autoradiography as a simple and powerful method for visualization and characterization of pharmacological targets
Uploaded: 2019-03-12T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Autoradiography as a Simple and Powerful Method for Visualization and Characterization of Pharmacological Targets at JoVE.com

העבודה נתמכה על ידי קרן לונדבק (גרנט R133-A12270) ושל קרן נורדיסק Novo (גרנט NNF0C0028664). המחברים מודים ד ר עופר בר מארק על אספקת radioligand [3H].

לטיפול בבעלי חיים כל בוצעה בהתאם להנחיות של Inspectorate ניסויים בבעלי חיים דנית.
הערה: פרוטוקול המתוארים כאן מכסה רקמות הכנה (קרי, רקמת מוח העכבר), במבחנה autoradiographic וזמינותו בפירוט מספיק עבור הגדרת השיטה במעבדה החדשה, את החשיפה פוספור הדמיה הצלחות כמו גם לאחר מכן ניתוח den...

איכות autoradiographic assay נקבעת בדרך כלל לפי הרגישות של radioligand. גורם תורם מרכזי הוא radioisotope הנבחר, אשר ניתנת על-ידי הזמינות של ליגנדים ידוע או את הכדאיות של טכניקות ספציפיות labelling להניב ליגנדים עם פעילות ספציפית המתאימה (קרי, את כמות הרדיואקטיביות לכל יחידת השומה של radioligand)23, עם כמו...

Autoradiography היא שיטה אשר מספק תמונות של דעיכה רדיואקטיבית. הטכניקה משמשת באופן שגרתי ללמוד התפלגות רקמת חלבון של עניין במבחנה המבוססת על אינטראקציה עם תרופתי ספציפי בין תרכובת radiolabelled המטרה שלו. זה מספק מידע ישיר על סלקטיביות ליגנד המטרה. במבחנה autoradiography עשוי לשמש גם קביעה כמותית של איגוד תרופתי הפרמטרים של radioligands, כגון קבוע דיסוציאציה (דK), צפיפות של אתרי קישור (Bmax), כמו גם לקביעת עיכוב הקבוע (Ki) של ליגנדים מתחרות1,2. בהשוואה לאיגוד radioligand homogenate מסורתיים, autoradiography יש את היתרון של מסוגל לדמיין אנטומיה המרחבי ולתת פרטים תמציתי של דפוסי ביטוי אזוריים3. השיטה של autoradiography לכן חלופה רלוונטי immunocytochemistry, במיוחד בהעדר נוגדן המאומת. Autoradiography מיושם בקלות בתוך מעבדה סטנדרטיים radioisotope קיבלו את הזמינות של radioligand מתאים עם יחודיות תרופתי הנדרש, גישה cryostat מיקרוטום עבור הכנת רקמות, ומקטעים של הדמיה מתאימים המכשיר כי הוא מסוגל לנתח את ההפצה של רדיואקטיביות בסעיפים המתאימים רקמות. ראוי לציין, קריטריון הבחירה חשובה עבור radioligand הוא כמות מוגבלת של איגוד לאתרים שאינם-יעד. זה יכול להיות חלבונים, ריריות או חומרים כגון פלסטיק או מסננים אחרים, הוא המכונות במקובץ מחייב שאינם ספציפיים. בדרך כלל, לא ספציפית מחייבת היא אי-saturable אבל יכול להיות saturable אם זה קשור חלבון חופש-יעד ספציפי. הדרך הטובה ביותר של אימות נכון מחייב ספציפית היא להשוות בין רקמות חסר המטרה, למשל, גנטית מהונדסים רקמות (הנוק-אאוט)4.
. הנה, המתודולוגיה מודגם עם אפיון האתר גבוהה-זיקה מחייב עבור חומצה γ-hydroxybutyric (אסיד) במוח של יונקים autoradiographic. הבנת האינטראקציה תרופתי בין אסיד לבין אתר איגוד שלו הוא מידת הרלוונטיות וכן אסיד שני תרופה שימושי קלינית לטיפול narcolepsy אלכוהוליזם5, אלא גם נתין הטבעי של המוח יונקים ו של פנאי סמים6. אתרי קישור אסיד גבוה-זיקה תוארו לראשונה באמצעות קשירה אסיד [3H] rat-המוח-homogenate-7. במהלך השנים, לקדם מחקרים autoradiography עם [3H] אסיד ופניות של [3H] רכיבי NC-382, הראה צפיפות גבוהה של איגוד אתרי באזורים הקדמי של עכברוש8,9,10, עכבר9 , חזיר המוח של11וקוף אדם-12. עם זאת, זהות מולקולרית והרלוונטיות המדויק פונקציונלי של אתרים אלה מחייב נשארו חמקמק.
עם כוונה לאפיין נוספת של אתרי קשירה, וכדי להקל על מחקרים על תפקיד פיזיולוגי של אסיד, פותחו מרובים radioligands שילוב איזוטופים שונים ניחן הזיקות השונות ([3H] GHB, [3 H] רכיבי NC-382 [3H] HOCPCA, [125אני] BnOPh-GHB)13,14,15,16(נבדקה17) (איור 1). השילוב של radioligands גבוהה-זיקה סלקטיבית, צפיפות רקמת גבוהה מאוד של האיגוד אתרי אפשרו לייצור של תמונות באיכות גבוהה באמצעות הזרחן הדמיה טכניקה9,11. יחד עם חלוקה לרמות של נקודות מעשיות בהגדרת ניסוי autoradiographic ואיור לצורך המחשה פרטים, המקטע לדיון ידגיש i) הבחירה של רדיונוקלידים ii) בחירה וזמינותו תנאי, iii) השימוש פוספור הדמיה צלחות לעומת לסרטי רנטגן. המטרה הכוללת של מאמר זה נועד לספק פרטים טכניים, מתודולוגי ומדעיים על טכניקת autoradiography בשביל לידע על רקמות הפצה וניתוח תרופתי של חלבון מטרות.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Absolute ethanol</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>107017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BAS-TR2040 Imaging Plate</td>
			<td>GE Healthcare Life Science</td>
			<td>28956481</td>
			<td>20x40 cm - Sensitive to tritium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cresyl violet acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5042-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPX (non-aqueous mounting medium for microscopy)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>100579</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O.C.T. Compound, 12 x 125 mL</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td>Tissue-Tek</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>16005-1KG-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-9483</td>
			<td>microscope slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Manual Slide Staining Set</td>
			<td>Sakura Finetek Denmark ApS</td>
			<td>4451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tritium Standard on Glas</td>
			<td>American Radiolabeld Chemicals, Inc.</td>
			<td>ART 0123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene substitute</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5597</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

autoradiography as a simple and powerful method for visualization and characterization of pharmacological targets

במבחנה autoradiography נועד להמחיש את התפלגות האנטומי של חלבון עניין ברקמות חיות ניסוי, כמו גם בני אדם. השיטה מבוססת על הכריכה ספציפי של radioligand למטרה הביולוגי שלו. לכן, מקטעי רקמת קפוא מודגרת עם פתרון radioligand, האיגוד אל המטרה הוא לאחר מכן מקומי על ידי הגילוי של דעיכה רדיואקטיבית, לדוגמה, באמצעות סרט פוטוסנסיטיבית או זרחן הדמיה צלחות. Autoradiograms דיגיטלי שנוצר להציג רזולוציה מרחבית יוצא דופן, אשר מאפשרת כימות ולוקליזציה של איגוד radioligand במבנים אנטומיים ברורים. יתר על כן, כימות מאפשרת אפיון ליגנד זיקה תרופתי באמצעות קבועי דיסוציאציה (דK), עיכוב קבועים (Kאני), כמו גם הצפיפות של אתרי קישור (Bmax) ברקמות שנבחרו. לכן, השיטה מספקת מידע אודות המטרה לוקליזציה והן ליגנד סלקטיביות. כאן, הטכניקה היא ביטוי עם אפיון autoradiographic של החומצה גבוה-זיקה γ-hydroxybutyric (אסיד) מחייב אתרי ברקמת המוח יונקים, תוך שימת דגש מיוחד על שיקולים מתודולוגי בנוגע וזמינותו מחייבת פרמטרים, הבחירה של radioligand ואת שיטת זיהוי.

התפלגות האנטומי של האתרים מחייב אסיד גבוה-זיקה באמצעות פרוטוקול המתואר, היה דמיינו את אנלוגי אסיד radiolabelled [3H] HOCPCA במוח העכבר, אשר נקטעה למקטעים הילתית, הווריד, אופקי (איור 3 ). רמות גבוהות של איגוד נצפתה היפוקמפוס, קליפת המוח, איגוד נמוך ב סטריאטום ואיג?...

Watch this Scientific Journal Video about Autoradiography as a Simple and Powerful Method for Visualization and Characterization of Pharmacological Targets at JoVE.com

Autoradiography as a Simple and Powerful Method for Visualization and Characterization of Pharmacological Targets

Autoradiography כאל שיטה פשוטה ורבת -עוצמה עבור ויזואליזציה ואפיון של מטרות תרופתי

השיטה של autoradiography נמצא בשימוש שגרתי ללמוד קשירה של radioligands על מקטעים של רקמות לקביעת פרמקולוגיה איכותי או כמותי.

In vitro autoradiography aims to visualize the anatomical distribution of a protein of interest in tissue from experimental animals as well as humans. The ...

אוטוביוגרפיה היא טכניקה חזקה ופשוטה ללמוד הפצה של אתרי קשירה חלבון ברקמות באמצעות radioligand ספציפי עבור היעד. זה גם חלופה מתאימה אימונוהיסטוכימיה. טכניקה זו מדמיינת ביטוי חלבון ברזולוציה מרחבית באמצעות תמונות דיגיטליות מהירות יותר מחשיפה מסורתית לסרטים.זה עשוי לשמש גם לניתוח תרופתי של מטרות חלבון. השיטה כוללת רקמות עכבר המותקנות על זכוכית אך ניתן להרחיבן למינים אחרים או אפילו לתאים הגדלים על כיסויים. הדגמת ההליך תהיה על ידי נאן Griem-Krey, דוקטורנט במעבדה שלי.כדי להתחיל, להטביע את הרקמה באבקת קרח יבש כדי לצלם להקפיא אותו. מעבירים את הרקמה הקפואה ישירות להקפאה שנקבעה למינוס 20 מעלות צלזיוס. תן לרקמה להתאקלם למינוס 20 מעלות צלזיוס בהקפאה במשך 20 דקות.לאחר מכן מכסים את מחזיק הרקמה עם מדיום הטבעה מחוץ קריוסטט במהירות למקם את דגימת הרקמה הקפואה בכיוון הרצוי בעוד המדיום הטבעה הוא עדיין נוזלי. מעבירים את מחזיק הרקמה בחזרה להקפאטאט וחושפים את המדיום המטביע לטמפרטורות מתחת למינוס 10 מעלות צלזיוס להקשחה. מקם את מחזיק הרקמה במיקרוטום של ההקפאה.התאימו את כיוון הרקמה כדי למנוע מקטעים משופעים. חותכים את הרקמה עם הדרכה של אטלס סטריאוטוקסי בחלקים של עובי הרצוי ולפתח את החלק עם מברשת קטנה במידת הצורך. הפשר את המקטע על מגלשת מיקרוסקופ.לאחר מכן לאסוף ברצף את הסעיפים מאזור העניין עבור החזרה הטכנית הרצויה. אפשר לחלקים בשקופיות להתייבש למשך שעה אחת לפני טיפול נוסף. במעבדה רדיואקטיבית מוסמכת, השתמש בעיפרון כדי לתייג את השקופיות בתנאי הניסוי.מקם את השקופיות אופקית במגשי פלסטיק. החל בזהירות אמצעי אחסון מתאים של מאגר שיוך דם המותאם ליעד הנדון על המקטעים שנטענו בשקופיות. ודא שכל מקטע מכוסה לחלוטין.לקביעת איגוד לא ספציפי, תוספת מאגר SA עם ריכוז רלוונטי של תרכובת ללא תריס. לאחר מכן מכסים את המגשים במכסים כדי למנוע אידוי. טרום דגירה בטמפרטורה רלוונטית במשך 30 דקות על שייקר צלחת להגדיר 20 סל"ד.לאחר מכן, יוצקים את נוזל הדגירה מראש מכל שקופית ומעבירים את השקופיות בחזרה למגש הפלסטיק. מיד לכסות את החלקים לחלוטין עם הריכוז הרלוונטי של radioligand במאגר SA. לקביעת מחייב לא ספציפי, תוספת רדיוליגנד פתרון עם ריכוז רלוונטי של תרכובת ללא תריס.מכסים את המגשים במכסים ודגירה בתנאים הרצויים עם רעידות עדינות קבועות ב-20 סל"ד. לאחר מכן, יוצקים את פתרון הדגירה ומעבירים את השקופיות לתוך ארון תקשורת לשקופיות מיקרוסקופ. מיד לשטוף את השקופיות.לפרוטוקול GHB, יש לשטוף פעמיים עם חיץ SA קר כקרח למשך 20 שניות ולאחר מכן לשטוף פעמיים על-ידי טבילת מתלה השקופיות במגשים מלאים במים מזוקקים קרים כקרח. מקם את השקופיות אנכית בארונות תקשורת וייבש את האוויר למשך שעה אחת לפחות. לאחר מכן להעביר את השקופיות ל קיבוע המכיל paraformaldehyde עבור קיבעון לילה בטמפרטורת החדר.למחרת, להעביר את המגלשות לקופסת desiccator המכילה ג'ל סיליקה בטמפרטורת החדר. השאירו את השקופיות בתיבת ההתבולל למשך שלוש שעות כדי למנוע לחות. ראשית, מניחים את החלקים לתוך קלטת צלחת הדמיה מוגנת קרינה עם הרקמה פונה כלפי מעלה.כלול מיקרו-קנה מידה רדיואקטיבי בכל קלטת לכמות הבא של כריכת רדיוליגנד. מיד לפני השימוש, לטעון את צלחת הדמיה זרחן רגיש טריטיום לתוך מכונת הדמיה זרחן ולחשוף אותו לאור אינפרא אדום גלוי על פי הוראות היצרן כדי למחוק אותו. לאחר מכן הסר את לוח ההדמיה ממכונת ההדמיה של הזרחן והצב אותה מיד על החלקים בקלטת.ודא שהקלטת סגורה לחלוטין. חשוף את החלקים לצלחת הדמיית הזרחן לזמן החשיפה האופטימי בטמפרטורת החדר תוך שמירה מפני אור. לאחר החשיפה, פותחים בזהירות את הקלטת בחושך ומיד מעבירים את לוח ההדמיה לתוך הקופסה הכהה של דימוי זרחן.סרוק את הלוח ברזולוציה הגבוהה ביותר האפשרית כדי לקבל תמונה דיגיטלית. כדי להתחיל, פתח תוכנית מתאימה לניתוח תמונות. קבע את הצפיפות האופטית היחסית עבור כל תקן כיול על-ידי בחירת קביעת אזור פריט התפריט.בחרו בכלי ליצירת אזורים ולהשתמש בו לבחירת אזור בגודל שווה לכל נקודה במיקרו-גוונים הרדיואקטיביים. הקצה מספר לכל אזור שנבחר על-ידי לחיצה על מספר תחת תווית פריט התפריט. לחץ על ייצוא קבצים ולאחר מכן על דוח אזור דו-מימדי כדי לייצא את ערכי ה- OD עבור כל נקודה בתקן הכיול.בתוכנת ההדמיה הקניינית, השתמש בכלי ליצירת אזור כדי לבחור את אזור העניין בכל מקטע ולמדוד את ה- ODs שלו כדי להתחיל לבצע כימות של האוטרדיוגרמות. בחר את אותו אזור בכל מקטע על-ידי יצירת תבנית עבור אזור העניין והעתק והתאם אותו לווריאציות קלות באנטומיה של המוח בכל אוטורדוגרמה. לאחר מכן, לחץ על דוח אזור דו-מימדי של ייצוא קבצים כדי לייצא את הערכים והגדלים של ROD של אזורים נבחרים לגיליון אלקטרוני.קבע את האיגוד של הרדיוליגנד כמפורט בפרוטוקול הטקסט. במחקר זה, ההתפלגות האנטומית של אתרי קשירה GHB זיקה גבוהה הם דמיינו עם רדיולאבלד GHB אנלוגי רדיואקטיבי HOCPCA במוח העכבר אשר נחתך לתוך קורונדל, קשת, וקטעים אופקיים. רמות גבוהות של קשירה נראים בהיפוקמפוס ובקליפת המוח, בעוד רמות קשירה נמוכות יותר נראים בסטריאטום ולא מזוהה כריכה בצוואר הקטן.כפי שמוצג כאן, המבנים האנטומיים עשויים להיות חזותיים באמצעות מישורים שונים ושלמות אנטומית עשויה להיות נתמכת על ידי כתמים סגולים cresyl. אוטורדוגרמות מייצגות של חולדה, עכבר וחזיר ממחישות את השימור האבולוציוני של אתרי קשירה GHB בעלי זיקה גבוהה במוח היונקים. אתרי איגוד HOCPCA רדיואקטיביים מזוהים בכל שלושת המינים המאפשרים השוואה של אנטומיה מוחית גסה ביניהם.אתרי איגוד GHB זיקה גבוהה נבדקים עם רדיוליגנדים GHB אשר מציגים זיקה שונה עבור אתרי הכריכה אבל פעילויות ספציפיות דומות. HOCPCA רדיואקטיבי ניחן ברגישות גבוהה ויחס אות מעולה לרעש. בשל הרגישות הנמוכה יותר של NCS-382 רדיואקטיבי, יש להשתמש בריכוזי רדיוליגנד גבוהים יותר על מנת להשיג רמות דומות של קשירה.אפילו ריכוזי רדיוליגנד גבוהים יותר נחוצים עבור GHB רדיואקטיבי כדי להשיג רמות קשירה דומות. עם זאת, ריכוזי רדיוליגנד גבוהים יותר גם להגדיל את רמת כריכה לא ספציפית עם יחס אות נמוך יותר לרעש וכתוצאה מכך. חשוב לייעל את תנאי ההתמדה כמו ריכוז radioligand, כביסה ותזמן חשיפה על מנת לקבל את האות הטוב ביותר ליחסי רעש וזה גם מאוד חשוב לזכור למחוק את הצלחת לפני.ניתן להאריך את ההליך לתנאי vivo כדי לקבל מושג על כריכה מורכבת בבעלי חיים אשר יכול להיות שימושי עבור פרויקטים גילוי. זכור לעבוד במעבדה עם חומר רדיואקטיבי מלא מוסמך ללבוש בגדים מגן בעת טיפול רדיואקטיביות או paraformaldehyde.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Simple Composite Phenotype Scoring System for Evaluating Mouse Models of Cerebellar Ataxia

ניקוד פשוט Composite הפנוטיפ מערכת להערכת מודלים של עכבר אטקסיה cerebellar

We describe a protocol for the rapid and sensitive quantification of disease severity in mouse models of cerebella ataxia. It is derived from previously ...

Novel Apparatus and Method for Drug Reinforcement

רומן Apparatus ואת שיטת חיזוק והתרופות

Animal models of reinforcement have proven to be useful for understanding the neurobiological mechanisms underlying drug addiction.  Operant drug ...

The Vermicelli and Capellini Handling Tests: Simple quantitative measures of dexterous forepaw function in rats and mice

אטריה ו בדיקות Capellini טיפול: מדדים כמותיים פשוט פונקציה של מיומנות בכפו אצל חולדות ועכברים

Previous characterizations of rodent eating behavior have revealed that they use coordinated forepaw movements to manipulate food pieces. We have extended ...

Automated Interactive Video Playback for Studies of Animal Communication

ניגון אוטומטי של וידאו אינטראקטיבי ללימודי תקשורת של בעלי חיים

Video playback is a widely-used technique for the controlled manipulation and presentation of visual signals in animal communication. In particular, ...

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

ויזואליזציה של Proprioceptors ב<em&gt; תסיסנית</em&gt; זחלים וגלמים

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

להדמיה מניפולציה גנטית של דנדריטים עם קוצים בקליפת עכבר היפוקמפוס מוחין באמצעות<em&gt; ברחם</em&gt; Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development

Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development

לשעבר הרחם electroporation וexplants חצי כדור שלם: שיטה ניסיונית פשוטה למחקרים בהתפתחות קליפת מוח הקדומה

Cortical development involves complex interactions between neurons and non-neuronal elements including precursor cells, blood vessels, meninges and ...

A Simple and Inexpensive Method for Determining Cold Sensitivity and Adaptation in Mice

שיטה פשוטה וזולה לקביעה קרה רגישות והסתגלות בעכברים

Cold hypersensitivity is a serious clinical problem, affecting a broad subset of patients and causing significant decreases in quality of life.  The cold ...

Live Imaging of Nicotine Induced Calcium Signaling and Neurotransmitter Release Along Ventral Hippocampal Axons

הדמיה חיה של איתות הניקוטין מושרה סידן והשחרור הנוירוטרנסמיטר לאורך האקסונים בהיפוקמפוס הגחון

Sustained enhancement of axonal signaling and increased neurotransmitter release by the activation of pre-synaptic nicotinic acetylcholine receptors ...

A Simple Alternative to Stereotactic Injection for Brain Specific Knockdown of miRNA

חלופה פשוטה להזרקת stereotactic למציאה ספציפית המוח של מירנה

MicroRNAs (miRNAs) are key regulators of gene expression.  In the brain, vital processes like neurodevelopment and neuronal functions depend on the ...