Name: autoradiography as a simple and powerful method for visualization and characterization of pharmacological targets
Uploaded: 2019-03-12T15:00:00
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Il lavoro è stato supportato dalla Fondazione Lundbeck (Grant R133-A12270) e la Fondazione di Novo Nordisk (Grant NNF0C0028664). Gli autori ringraziano il Dr. Aleš Marek per la fornitura di radioligand [3H].

Tutti gli animali gestione è stata eseguita in conformità con le linee guida da The ispettorato danese di sperimentazione animale.
Nota: Il protocollo descritto qui copre (cioè, tessuto di cervello di topo), preparazione di tessuti in vitro autoradiografico dosaggio in modo sufficientemente dettagliato per l'impostazione del metodo in un nuovo laboratorio, l'esposizione al fosforo piastre di imaging come pure successiva analisi densitometrica di autoradiogrammi (<strong cl...

La qualità di un'analisi autoradiografica viene determinata dalla sensibilità del radioligand. Un fattore di contributo importante è il radioisotopo selezionato, che è dato dalla disponibilità di ligandi noti o dalla fattibilità di specifiche tecniche di etichettatura per produrre ligandi con appropriata attività specifica (cioè, la quantità di radioattività per mole unità un radioligando)23e con limitate quantità di degradazione chimica. Un gran numero di radioligands di liga...

Autoradiografia è un metodo che fornisce immagini di decadimento radioattivo. La tecnica è usata ordinariamente per studiare la distribuzione tissutale di una proteina di interesse in vitro basato su una specifica interazione farmacologica tra un composto radiomarcato e l'obiettivo. Questo fornisce informazioni dirette circa la selettività del ligando per la destinazione. Autoradiografia in vitro può essere utilizzato anche per la determinazione quantitativa di parametri di associazione farmacologica di radioligands, come la costante di dissociazione (Kd) e densità di siti di legame (Bmax), nonché per la determinazione la costante di inibizione (Ki) delle concorrenti ligandi1,2. Rispetto al tradizionale omogeneato radioligand binding, autoradiografia ha il vantaggio di essere in grado di visualizzare anatomia spaziale e con l'indicazione succinte della espressione regionale modelli3. Il metodo di autoradiografia è quindi un'alternativa pertinente per immunocitochimica, soprattutto in assenza di un anticorpo convalidato. Autoradiografia viene implementata facilmente in un laboratorio del radioisotopo standard dato la disponibilità di un radioligand adatto con la necessaria specificità farmacologica, ad un criostato microtomo per la preparazione di sezioni di tessuto e un imaging adatto dispositivo che è in grado di analizzare la distribuzione della radioattività nelle sezioni rispettive del tessuto. In particolare, un importante criterio di selezione per il radioligando è una quantità limitata di associazione ai siti non-bersaglio. Questo può essere ad altre proteine, membrane o materiali quali plastica o filtri ed è collettivamente come legame non specifico. Solitamente, il legame non specifico è non saturabile ma può essere saturabile se si tratta di una specifica proteina fuori bersaglio. Il modo migliore di convalida vero legame specifico è da confrontare con tessuti manca il bersaglio, per esempio, geneticamente ingegnerizzati (knock-out) del tessuto4.
Qui, la metodologia è illustrata con la caratterizzazione autoradiografica del sito di legame ad alta affinità per l'acido γ-idrossibutirrico (GHB) nel cervello dei mammiferi. Comprendere l'interazione farmacologica tra GHB e il suo sito di legame è di pertinenza come GHB è una droga sia clinicamente utile nel trattamento della narcolessia e alcolismo5, ma anche un costituente naturale del cervello dei mammiferi e un'area di divertimento droga6. Siti di legame ad alta affinità GHB in primo luogo sono stati descritti utilizzando [3H] associazione di GHB a ratto cervello omogeneato7. Nel corso degli anni, ulteriori studi di autoradiografia con [3H] GHB e l'analogo [3H] NCS-382 ha mostrato un'alta densità di siti nelle regioni del forebrain del ratto8,9,10, mouse9 di legame ,11e scimmia/umano cervello12del maiale. Tuttavia, l'identità molecolare ed esatta rilevanza funzionale di questi siti di legame sono rimasti sfuggente.
Con l'intenzione di caratterizzare ulteriormente i siti di legame e per facilitare gli studi sul ruolo fisiologico di GHB, sono state sviluppate più radioligands incorporando isotopi diversi dotati di diverse affinità ([3H] GHB, [3 H] NCS-382, [3H] HOCPCA e [125I] BnOPh-GHB)13,14,15,16(rivisto in17) (Figura 1). La combinazione di selettivo ad alta affinità radioligands e una densità molto elevata del tessuto dell'associazione siti hanno permesso per la produzione di immagini di alta qualità utilizzando il fosforo imaging tecnica9,11. Insieme con un contorno dei punti pratici nella creazione di un esperimento autoradiografico e un'illustrazione per esemplificare i dettagli, la sezione di discussione metterà in risalto i) la scelta di radionuclide, ii) la scelta delle condizioni di dosaggio e iii) l'uso del fosforo Imaging piastre contro pellicola di raggi x. L'obiettivo generale di questa carta è quello di fornire dettagli tecnici, metodologici e scientifici sulla tecnica autoradiografia per informare sulla distribuzione tissutale e analisi farmacologica di bersagli proteici.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Absolute ethanol</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>107017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BAS-TR2040 Imaging Plate</td>
			<td>GE Healthcare Life Science</td>
			<td>28956481</td>
			<td>20x40 cm - Sensitive to tritium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cresyl violet acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5042-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPX (non-aqueous mounting medium for microscopy)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>100579</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O.C.T. Compound, 12 x 125 mL</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td>Tissue-Tek</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>16005-1KG-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-9483</td>
			<td>microscope slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Manual Slide Staining Set</td>
			<td>Sakura Finetek Denmark ApS</td>
			<td>4451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tritium Standard on Glas</td>
			<td>American Radiolabeld Chemicals, Inc.</td>
			<td>ART 0123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene substitute</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5597</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

autoradiography as a simple and powerful method for visualization and characterization of pharmacological targets

In vitro l'autoradiografia ha lo scopo di visualizzare la distribuzione anatomica di una proteina di interesse nel tessuto da animali da esperimento come pure gli esseri umani. Il metodo si basa sul legame specifico di un radioligand al suo target biologico. Pertanto, le sezioni di tessuto congelato sono incubate con radioligandi soluzione e l'associazione alla destinazione è successivamente localizzata tramite la rilevazione del decadimento radioattivo, ad esempio, utilizzando la pellicola fotosensibile o fosforo piastre di imaging. Autoradiogrammi digitale risultante visualizzare notevole risoluzione spaziale, che consente la quantificazione e la localizzazione di radioligand binding in strutture anatomiche distinte. Inoltre, quantificazione consente la caratterizzazione farmacologica di affinità ligando mediante costanti di dissociazione (Kd), costanti di inibizione (Kio) così come la densità di siti di legame (Bmax) in determinati tessuti. Così, il metodo fornisce informazioni sulla localizzazione di destinazione sia selettività ligando. Qui, la tecnica è esemplificata con autoradiografico caratterizzazione dell'acido ad alta affinità γ-idrossibutirrico (GHB) siti nel tessuto di cervello dei mammiferi, con speciale enfasi su considerazioni metodologiche per quanto riguarda l'analisi obbligatoria di legame parametri, la scelta del radioligand e il metodo di rilevamento.

Utilizzando il protocollo descritto, la distribuzione anatomica di siti di legame ad alta affinità GHB è stata visualizzata con l'analogo GHB radiomarcato [3H] HOCPCA nel cervello di topo, che è stato tagliato in sezioni coronale, sagittali e orizzontale (Figura 3 ). Alti livelli di associazione sono stati osservati nell'ippocampo e nella corteccia, inferiore nel corpo striato e l'associazione non è state rilevate nel cervelletto, corrispondent...

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Autoradiography as a Simple and Powerful Method for Visualization and Characterization of Pharmacological Targets

Autoradiografia come un metodo semplice e potente per la visualizzazione e caratterizzazione di bersagli farmacologici

Il metodo di autoradiografia è ordinariamente utilizzato per studiare l'associazione di radioligands per sezioni di tessuto per la determinazione qualitativa o quantitativa farmacologia.

In vitro autoradiography aims to visualize the anatomical distribution of a protein of interest in tissue from experimental animals as well as humans. The ...

L'autoradiografia è una tecnica potente e semplice per studiare la distribuzione di siti di legame proteico nei tessuti utilizzando radioligand specifici per il bersaglio. È anche un'alternativa adatta all'immunoistochimica. Questa tecnica visualizza l'espressione proteica con risoluzione spaziale tramite immagini digitali che è più veloce dell'esposizione tradizionale al film.Può anche essere utilizzato per l'analisi farmacologica di obiettivi proteici. Il metodo prevede tessuti di topo montati su vetro, ma può essere esteso ad altre specie o anche a cellule coltivate su coverlips. A dimostrare la procedura sarà Nane Griem-Krey, dottoranda nel mio laboratorio.Per iniziare, immergere il tessuto nel ghiaccio secco in polvere per scattare congelarlo. Trasferire il tessuto congelato direttamente in un criostato impostato su meno 20 gradi Celsius. Lasciare che il tessuto si acclimati a meno 20 gradi Celsius nel criostato per 20 minuti.Quindi coprire il supporto del tessuto con un mezzo di incorporamento all'esterno del criostato e posizionare rapidamente il campione di tessuto congelato nell'orientamento desiderato mentre il mezzo di incorporamento è ancora liquido. Trasferire il porta tessuto al criostato ed esporre il mezzo di incorporamento a temperature inferiori a meno 10 gradi Celsius per l'indurimento. Posizionare il porta tessuto nel microtomo del criostato.Regolare l'orientamento del tessuto per evitare sezioni inclinate. Tagliare il tessuto con la guida di un atlante stereotassico in sezioni dello spessore desiderato e aprire la sezione con un piccolo pennello, se necessario. Scongelare montare la sezione su uno scivolo al microscopio.Quindi raccogliere in sequenza le sezioni dalla regione di interesse per la ripetizione tecnica desiderata. Lasciare asciugare ad aria le sezioni sui vetrini per un'ora prima di un'ulteriore manipolazione. In un laboratorio di radioattività certificato, utilizzare una matita per etichettare le diapositive con le condizioni sperimentali.Posizionare gli scivoli orizzontalmente in vassoi di plastica. Applicare con cura un volume appropriato di tampone SA regolato al bersaglio in questione alle sezioni montate sulle diapositive. Assicurarsi che ogni sezione sia completamente coperta.Per la determinazione di un legame non specifico, integrare il tampone SA con una concentrazione rilevante di composto non etichettato. Quindi coprire i vassoi con coperchi per evitare l'evaporazione. Pre-incubare a una temperatura rilevante per 30 minuti su uno shaker impostato su 20 giri/min.Quindi, versare il liquido di pre-incubazione da ogni diapositiva e trasferire di nuovo le diapositive nel vassoio di plastica. Coprire immediatamente le sezioni completamente con la relativa concentrazione di radiolige nel tampone SA. Per la determinazione di legatura non specifica, integrare la soluzione di radiolige con una concentrazione rilevante di composto non etichettato.Coprire i vassoi con coperchi e incubare nelle condizioni desiderate con costante agitazione delicata a 20 giri/min. Successivamente, versare la soluzione di incubazione e trasferire le diapositive in un rack di scorrimento del microscopio. Lavare immediatamente le diapositive.Per il protocollo GHB, lavare due volte con tampone SA ghiacciato per 20 secondi e quindi risciacquare due volte scavando il rack scorrevole in vassoi pieni di acqua distillata ghiacciata. Posizionare i vetrini verticalmente in rack e asciugare all'aria per almeno un'ora. Quindi trasferire le diapositive su un fissatore contenente paraformaldeide per la fissazione notturna a temperatura ambiente.Il giorno successivo, trasferire le diapositive in una scatola di essiccatore contenente gel di silice a temperatura ambiente. Lasciare le diapositive nella scatola dell'essiccatore per tre ore per eliminare l'umidità. In primo luogo, posizionare le sezioni in una cassetta di una piastra di imaging schermata a radiazioni con il tessuto rivolto verso l'alto.Includere una microscala radioattiva in ogni cassetta per la successiva quantificazione del radiolig e del legame. Immediatamente prima dell'uso, caricare la piastra di imaging al fosforo sensibile al trizio nella macchina per l'imaging del fosforo ed esporla alla luce infrarossa visibile secondo le istruzioni del produttore per cancellarla. Quindi rimuovere la piastra di imaging dalla macchina per l'imaging del fosforo e posizionarla immediatamente sulle sezioni della cassetta.Assicurarsi che la cassetta sia completamente chiusa. Esporre le sezioni alla piastra di imaging del fosforo per il tempo di esposizione ottimizzato a temperatura ambiente mentre sono schermate dalla luce. Dopo l'esposizione, aprire attentamente la cassetta al buio e trasferire immediatamente la lastra di imaging nella scatola scura di un imager al fosforo.Scansionare la piastra alla massima risoluzione possibile per ottenere un'immagine digitale. Per iniziare, aprire un programma di analisi delle immagini appropriato. Determinare le densità ottiche relative per ogni standard di calibrazione selezionando la determinazione dell'area della voce di menu.Selezionate lo strumento per la creazione della regione e utilizzatelo per selezionare un'area di uguale dimensione per ogni punto della microscala radioattiva. Assegnare un numero a ogni area selezionata facendo clic sul numero sotto l'etichetta della voce di menu. Fare clic su Esporta file e quindi su Report area 2D per esportare i valori OD per ogni punto dello standard di calibrazione.Nel software di imaging proprietario, utilizzare uno strumento di creazione della regione per selezionare la regione di interesse in ogni sezione e misurare i suoi OD per iniziare a eseguire la quantificazione degli autoradiogrammi. Selezionare la stessa area in ogni sezione creando un modello per l'area di interesse e copiarlo e adattarlo a piccole variazioni nell'anatomia cerebrale in ogni autoradiogramma. Successivamente, fare clic su Report area 2D esportazione file per esportare i valori e le dimensioni dell'asta delle aree selezionate in un foglio di calcolo.Determinare l'associazione del radioligand come indicato nel protocollo di testo. In questo studio, la distribuzione anatomica dei siti di legame GHB ad alta affinità viene visualizzato con l'HOCPCA radioattivo analogico GHB radioetichettato in un cervello di topo che è stato tagliato in sezioni coronali, sagittali e orizzontali. Alti livelli di legame sono visti nell'ippocampo e nella corteccia mentre livelli di legame più bassi sono visti nello striato e non viene rilevato alcun legame nel cervelletto.Come mostrato qui, le strutture anatomiche possono essere visualizzate usando piani diversi e l'integrità anatomica può essere supportata dalla colorazione viola cresile. Autoradiogrammi rappresentativi di un topo, un topo e un maiale illustrano la conservazione evolutiva dei siti di legame GHB ad alta affinità nel cervello dei mammiferi. I siti di legame hocpca radioattivi sono rilevati in tutte e tre le specie consentendo il confronto dell'anatomia cerebrale lorda tra di loro.I siti di legame GHB ad alta affinità sono sondati con radioligand ghb che mostrano affinità diverse per i siti di legame ma attività specifiche comparabili. Radioactive HOCPCA è dotato di un'elevata sensibilità e di un eccellente rapporto segnale/rumore. A causa della minore sensibilità dell'NCS-382 radioattivo, per ottenere livelli simili di legame devono essere utilizzate concentrazioni di radioligande più elevate.Per raggiungere livelli di legame comparabili sono necessarie concentrazioni di radioligie ancora più elevate per il GHB radioattivo. Tuttavia, concentrazioni di radioligande più elevate aumentano anche il livello di legame non specifico con un rapporto segnale/rumore di conseguenza inferiore. È importante ottimizzare le condizioni di dosaggio come la concentrazione di radioligand, il lavaggio e il tempo di esposizione al fine di ottenere i migliori rapporti segnale/rumore ed è anche molto importante ricordare di cancellare la piastra prima.La procedura può essere estesa a condizioni in vivo per avere un'idea del legame composto in un animale vivente che potrebbe essere utile per progetti di scoperta. Ricordarsi di lavorare in laboratorio con materiale radioattivo completo certificato e di indossare indumenti protettivi quando si maneggia radioattività o paraformaldeide.

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