Name: autoradiography as a simple and powerful method for visualization and characterization of pharmacological targets
Uploaded: 2019-03-12T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Autoradiography as a Simple and Powerful Method for Visualization and Characterization of Pharmacological Targets at JoVE.com

仕事は、ルンドベック財団 (グラント R133 A12270) とノボ ノルディスク財団 (グラント NNF0C0028664) によって支持されました。著者は、[3H] 放射性リガンドの供給のための博士 Aleš マレクをありがとうございます。

デンマーク動物実験の検査官からのガイドラインに準拠したすべての動物取扱を行った。
注: ここで説明したプロトコルをカバー ティッシュの準備 (すなわちマウス脳組織)、新しいラボ内のメソッド、蛍光イメージング プレートへの露出を設定するための十分な詳細で体外オートラジオグラフィーによるアッセイと同様その後デンシトメトリー分析 autoradio...

オートラジオグラフィーによるアッセイの品質よく、リガンドの感度によって決定されます。主要な貢献の要因は適切な特定活動 (すなわち放射能の量を持つ配位子を生成する知られている配位子の可用性または特定のラベリング技術の可能性に与えられる選択したラジオ アイソトープ放射性リガンドの単位モル) あたり23と化学的な劣化の限られた量。イメージング...

放射線は、放射性崩壊の画像を提供する方法です。テクニックは、日常的に関心体外に基づく放射性標識化合物とそのターゲットの特定の薬理学的相互作用の蛋白質の組織分布を調査する使用されます。これは、ターゲットのリガンドの選択性について直接的な情報を提供します。体外放射線写真法は、決定するだけでなく、解離定数 (Kd) などの結合部位 (B最大)、密度イメージングに関する基礎的薬理学的バインディング パラメーターの定量のためにまた使用されるかもしれません競合するリガンド1,2の阻害定数 (Ki) です。オートラジオグラフィーによる伝統的な磨砕液放射性リガンド結合と比較して、空間の解剖学を視覚化することができるという、地域性の表現パターン3の簡潔な詳細を与えることの利点があります。したがって、放射線写真法のメソッドは検証された抗体の有無を中心に、各種の関連する代替です。ミクロトーム クライオスタット切片、および適切なイメージングを準備するために、必要な薬理学的特異性と適切なリガンドの可用性を与えられる標準的なラジオ アイソトープ実験室の放射線写真法を簡単に実装します。それぞれティッシュ セクションの放射能の分布を分析することができるデバイス。特に、リガンドの重要な選択基準は、非ターゲット サイトへのバインドの限られた量です。これは他の蛋白質、膜やプラスチックやフィルターなどの材料にすることができ、総称して非固有のバインドと呼びます。通常非特異的結合非飽和ですが特定のオフのターゲット蛋白質を含む場合は飽和することができます。True 特定のバインドを検証する最良の方法は、組織の遺伝子、例えばターゲットを欠けていると比較する設計 (ノックアウト) 組織4です。
ここでは、方法論は、γ-ヒドロキシ酪酸 (GHB) 哺乳類の脳の高親和性結合部位のオートラジオ グラフの特性で示されています。GHB は両方臨床的に有用な薬剤アルコール依存症5ナルコレプシーの治療だけでなく、哺乳類の脳とレクリエーションの天然成分で、関連性は GHB とその結合部位の薬理学的相互作用を理解すること薬6。高親和性 GHB 結合部位は、ラット脳ホモジネート7[3H] GHB のバインディングを使用して記述されていた最初。年間、[3H] を用いたオートラジオグラフィーによる研究をさらに GHB とアナログ [3H] NCS 382 結合ラット8,9,10, マウスの9の領域を脳の部位の高密度を示しました、11、猿と人間の脳の12の豚。ただし、分子のアイデンティティおよびこれらの結合部位の機能的関連性正確なは、とらえどころのない残っています。
異なる親和性に恵まれている異なる同位体を組み込んだ複数イメージングに関する基礎的、さらに結合部位を特徴付けると生理的ガンマヒドロキシ酪酸の役割に関する研究を容易にする意図で開発されている ([3H] GHB、[3H] NCS-382、[3H] HOCPCA および [125私] BnOPh GHB)13,14,15,16(文献17) (図 1)。選択的な高親和性イメージングに関する基礎的およびイメージング技術9,11蛍光体を用いた高品質画像の生産のためのサイトが認められているバインディングの非常に高い組織密度の組み合わせ。オートラジオグラフィーによる実験とイラストの設定詳細を実証するための実践的なポイントの概要、と一緒にディスカッション セクション i) 放射性核種の選択、ii) アッセイ条件の選択および iii) 蛍光体の使用を強調します。対 x 線フィルム イメージング プレート。本稿の全体的な目標は、組織分布と標的タンパク質の薬理学的解析について知らせるためオートラジオグラフィー技術に関する技術、方法論的、科学的な詳細を提供することです。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Absolute ethanol</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>107017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BAS-TR2040 Imaging Plate</td>
			<td>GE Healthcare Life Science</td>
			<td>28956481</td>
			<td>20x40 cm - Sensitive to tritium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cresyl violet acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5042-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPX (non-aqueous mounting medium for microscopy)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>100579</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O.C.T. Compound, 12 x 125 mL</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td>Tissue-Tek</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>16005-1KG-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-9483</td>
			<td>microscope slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Manual Slide Staining Set</td>
			<td>Sakura Finetek Denmark ApS</td>
			<td>4451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tritium Standard on Glas</td>
			<td>American Radiolabeld Chemicals, Inc.</td>
			<td>ART 0123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene substitute</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5597</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

autoradiography as a simple and powerful method for visualization and characterization of pharmacological targets

体外放射線写真法は、実験動物として人間から組織の興味の蛋白質の解剖学的分布を可視化を目指しています。メソッドは、その生物学的対象放射性リガンドの特定の結合に基づいています。したがって、凍結するティッシュ セクションはリガンド溶液で培養した、ターゲットへのバインドはその後ローカライズ放射性崩壊の検出によってたとえば、感光性フィルムまたは蛍光イメージング プレートを使用しています。結果として得られるデジタル autoradiograms は、定量化と明確な解剖学的構造の放射性リガンドの結合の局在化を可能にする顕著な空間分解能を表示します。また、定量化できます親和性リガンドの薬理学的解析による結合部位 (B最大) 選択した組織の密度と同様、酸解離定数 (Kd)、阻害定数 (K私)。したがって、メソッドは、ターゲットの局在と性についての情報を提供します。高親和性 γ-ヒドロキシ酪酸 (GHB) 結合の試金に関する方法論的考察に特別な重点を置いて、哺乳類の脳組織内のサイトを結合のオートラジオ グラフの特性と技術を例示するここでは、パラメーター、リガンドと検出方法の選択。

記述のプロトコルを使用して、高親和性 GHB 結合部位の解剖学的分布は放射性標識された GHB アナログ [3H] 可視化したマウスの脳は、コロナ、矢状面、水平方向のセクション (図 3 にカットされた HOCPCA).バインドの高レベルは、海馬と皮質で観察された、線条体下部のバインドとバインドがありませんが小脳で検出された高親和性 GHB サイ...

Watch this Scientific Journal Video about Autoradiography as a Simple and Powerful Method for Visualization and Characterization of Pharmacological Targets at JoVE.com

Autoradiography as a Simple and Powerful Method for Visualization and Characterization of Pharmacological Targets

シンプルかつ強力な可視化と薬理学的ターゲットの評価法として放射線写真法

オートラジオグラフィー法は質的または量的薬理学による組織切片にイメージングに関する基礎的バインディングを研究する使用します。

In vitro autoradiography aims to visualize the anatomical distribution of a protein of interest in tissue from experimental animals as well as humans. The ...

オートラジオグラフィーは、標的に対して特定の放射線リガンドを使用して組織中のタンパク質結合部位の分布を研究するための強力で簡単な技術です。免疫検査に代わるのにも適しています。この技術は、従来のフィルム露出よりも高速なデジタル画像を介して空間分解能を用いてタンパク質発現を可視化する。また、タンパク質標的の薬理学的分析に使用してもよい。この方法は、ガラスに取り付けられたマウス組織を含むが、他の種に拡張されるか、あるいはカバースリップで増殖した細胞に拡張することができる。この手順のデモンストレーションは、私の研究室の博士課程の学生、ナネ・グレム=クレイです。まず、粉末ドライアイスに組織を沈め、凍結します。凍結した組織を、マイナス20度に設定されたクライオスタットに直接移します。凍結スタットで20分マイナス20度に組織を順応させます。次に、凍結スタットの外側に埋め込み培地で組織ホルダーを覆い、埋め込み培地がまだ液体である間、すぐに凍結した組織標本を所望の方向に置きます。組織ホルダーをクライオスタットに戻し、埋め込み培地をマイナス10°C以下の温度に曝して硬化させます。凍結スタットのミクロトームに組織ホルダーを置きます。傾斜した切片を避けるために、組織の向きを調整します。所望の厚さのセクションで立体性アトラスの指導で組織を切断し、必要に応じて小さなブラシでセクションを展開します。顕微鏡のスライドにセクションを取り付けます。次に、目的の技術的な繰り返しのために、関心のある領域からセクションを順次収集します。スライドのセクションを1時間空気乾燥させてから、さらに処理します。認定された放射能研究所では、鉛筆を使用してスライドに実験条件のラベルを付けます。スライドをプラスチックトレイに水平に配置します。対象に合わせて適切な SA バッファをスライドに取り付けたセクションに慎重に適用します。各セクションが完全にカバーされていることを確認します。非特異的結合の決定のために、非標識化合物の関連濃度でSAバッファーを補う。その後、蒸発を避けるために蓋でトレイを覆います。20rpmにセットされたプレートシェーカーで30分間、関連温度で予熱する。次に、各スライドからプレインキュベーション液を注ぎ、スライドをプラスチックトレイに戻します。直ちにSAバッファー内の放射性リガンドの関連濃度でセクションを完全にカバーします。非特異的結合の決定のために、非標識化合物の関連濃度で放射性リガンド溶液を補う。蓋でトレイを覆い、20 rpmで一定の穏やかな揺れで所望の条件下でインキュベートします。この後、インキュベーション溶液を注ぎ、スライドを顕微鏡スライドラックに移します。すぐにスライドを洗ってください。GHBプロトコルの場合、氷冷SAバッファーで20秒間洗浄し、スライドラックを氷冷蒸留水で満たされたトレイに浸して2回洗い流します。スライドをラックに垂直に配置し、空気乾燥を少なくとも 1 時間は使用します。次に、パラホルムアルデヒドを含む固定剤にスライドを移し、室温で一晩固定します。翌日、スライドを室温でシリカゲルを含むデシケータボックスに移します。水分を除去するために、デシケーターボックスにスライドを3時間放置します。まず、切片を、組織を上に向けた放射線遮蔽イメージングプレートカセットに入れる。放射性リガンと結合の後の定量のためにすべてのカセットに放射性マイクロスケールを含める。使用直前に、トリチウム感受性蛍光体イメージングプレートを蛍光イメージングマシンにロードし、メーカーの指示に従って可視赤外線に露出して消去します。次に、蛍光体イメージングマシンからイメージングプレートを取り出し、すぐにカセット内のセクションに置きます。カセットが完全に閉じられていることを確認します。光から遮光しながら室温での最適な露光時間のために、このセクションを蛍光イメージングプレートに露出させます。露光後、暗い中でカセットを慎重に開け、すぐに蛍光体の画像装置の暗い箱に画像板を移します。デジタル画像を得るために可能な限り最高の解像度でプレートをスキャンします。まず、適切な画像解析プログラムを開きます。メニュー項目領域決定を選択して、キャリブレーション規格ごとの相対的な光学密度を決定します。領域作成用のツールを選択し、それを使用して、放射性マイクロスケールの各ポイントに等しいサイズの領域を選択します。メニュー項目のラベルの下の番号をクリックして、選択した各領域に番号を割り当てます。[ファイルエクスポート]、[2D リージョン レポート]の順にクリックして、キャリブレーション規格の各ポイントの OD 値をエクスポートします。独自のイメージングソフトウェアでは、領域作成ツールを使用して、すべてのセクションで対象領域を選択し、そのODを測定してオートラジオグラムの定量化を開始します。各セクションで、対象領域のテンプレートを作成してコピーし、各オートラジオグラムの脳の解剖学の小さなバリエーションに合わせて調整することで、同じ領域を選択します。その後、[ファイル エクスポート 2D 領域レポート] をクリックして、選択した領域の ROD 値とサイズをスプレッドシートにエクスポートします。テキストプロトコルで概説されているように、ラジオリガンドの結合を決定します。本研究では、高親和性GHB結合部位の解剖学的分布を、コロナ、矢状、および水平切片に切断したマウス脳の放射標識GHBアナログ放射性HOCPCAで可視化する。海馬と皮質では高レベルの結合が見られ、線条体では低い結合レベルが見られ、小脳では結合は検出されない。ここに示すように、解剖学的構造は異なる平面を用いて視覚化され、解剖学的完全性はクレシルバイオレット染色によって支持され得る。ラット、マウスおよびブタの代表的なオートラジオグラムは、哺乳類の脳における高親和性GHB結合部位の進化的保全を示す。放射性HOCPCA結合部位は、それら間の総脳解剖学の比較を可能にする3種すべてで検出される。高親和性GHB結合部位は、結合部位に対して異なる親和性を示すが、同等の特定の活動を示すGHB放射リガンドで調査される。放射性HOCPCAは高感度で、ノイズ比に優れた信号を与えられる。放射性NCS-382の感度が低いため、同様のレベルの結合を得るためには、より高い放射性リガンド濃度を使用する必要があります。放射性GHBが同等の結合レベルを達成するには、さらに高い放射性リガンド濃度が必要です。しかし、高い放射性リガンド濃度はまた、結果的に低い信号対雑音比で非特異的結合のレベルを増加させる。放射リガンド濃度、洗浄、暴露時間などのアッセイ条件を最適化して、ノイズ比に対する最良の信号を得ることが重要であり、プレートを以前に消去することも非常に重要です。この手順は、発見プロジェクトに役立つ可能性のある生きている動物の化合物結合に関するアイデアを得るためにin vivo条件に拡張することができます。放射線活性やパラホルムアルデヒドを扱う際には、認定された完全な放射性物質を持つ実験室で働き、防護服を着用することを忘れないでください。

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Simple Composite Phenotype Scoring System for Evaluating Mouse Models of Cerebellar Ataxia

小脳性運動失調のマウスモデルを評価するための単純な複合表現型のスコアリングシステム

We describe a protocol for the rapid and sensitive quantification of disease severity in mouse models of cerebella ataxia. It is derived from previously ...

Novel Apparatus and Method for Drug Reinforcement

薬物の強化のための新規装置および方法

Animal models of reinforcement have proven to be useful for understanding the neurobiological mechanisms underlying drug addiction.  Operant drug ...

The Vermicelli and Capellini Handling Tests: Simple quantitative measures of dexterous forepaw function in rats and mice

春雨とカッペリーニの処理試験：ラットとマウスの器用な前足の機能の簡単な定量的指標

Previous characterizations of rodent eating behavior have revealed that they use coordinated forepaw movements to manipulate food pieces. We have extended ...

Automated Interactive Video Playback for Studies of Animal Communication

アニマルコミュニケーションの研究のための自動化されたインタラクティブなビデオ再生

Video playback is a widely-used technique for the controlled manipulation and presentation of visual signals in animal communication. In particular, ...

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

でProprioceptorsの可視化<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;幼虫および蛹

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

使用して、マウス大脳皮質および海馬における可視化と樹状突起と棘の遺伝子操作<em&gt;子宮内で</em&gt;エレクトロポレーション

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development

Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development

exの子宮内エレクトロポレーションと全半球植：早期皮質の発達についての研究のための簡単な実験方法

Cortical development involves complex interactions between neurons and non-neuronal elements including precursor cells, blood vessels, meninges and ...

A Simple and Inexpensive Method for Determining Cold Sensitivity and Adaptation in Mice

マウスにおける低温感受性と適応を決定するためのシンプルで安価な方法

Cold hypersensitivity is a serious clinical problem, affecting a broad subset of patients and causing significant decreases in quality of life.  The cold ...

Live Imaging of Nicotine Induced Calcium Signaling and Neurotransmitter Release Along Ventral Hippocampal Axons

ニコチン誘導性カルシウムシグナリングおよび腹側海馬軸索に沿って神経伝達物質放出のライブイメージング

Sustained enhancement of axonal signaling and increased neurotransmitter release by the activation of pre-synaptic nicotinic acetylcholine receptors ...

A Simple Alternative to Stereotactic Injection for Brain Specific Knockdown of miRNA

miRNAの脳特異的ノックダウンのための定位注射への単純な代替

MicroRNAs (miRNAs) are key regulators of gene expression.  In the brain, vital processes like neurodevelopment and neuronal functions depend on the ...