Name: autoradiography as a simple and powerful method for visualization and characterization of pharmacological targets
Uploaded: 2019-03-12T15:00:00
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작품은 Lundbeck 재단 (그랜트 R133-A12270), Novo Nordisk 기초 (그랜트 NNF0C0028664)에 의해 지원 되었다. 저자 [3H] radioligand의 공급에 대 한 박사 Aleš 마렉을 감사합니다.

모든 동물 처리 덴마크어 동물 실험 검사자에서 지침에 따라 수행 되었다.
참고: 여기에 설명 된 프로토콜 커버 조직 준비 (즉, 마우스 뇌 조직), 생체 외에서 autoradiographic 분석 결과 새로운 실험실에서 메서드, 인광 체 격판덮개를 이미징에 노출 설정에 대 한 충분 한 세부 사항에서 뿐만 아니라 지역화 및 다른 해 부 구조에 radioligand 바인딩 측정의 목적으로 autorad...

Autoradiographic 분석 결과의 품질은 가장 자주는 radioligand의 감도 의해 결정 됩니다. 주요 기여 하는 요소는 적절 한 특정 활동 (즉, 방사능의 양을 ligands를 알려진된 ligands의 가용성에 의해 또는 특정 라벨 기술의 타당성에 의해 주어진 선택 된 방사성 동위 원소 단위는 radioligand의 두더지) 당23와 화학 저하의 제한 금액. 알려진된 ligands의 radioligands의 많은 수는 움...

Autoradiography는 방사성 붕괴의 이미지를 제공 하는 방법입니다. 기술은은 정기적으로 관심 생체 외에서 기반 radiolabelled 화합물과 그 대상 간의 특정 약물 상호 작용에의 한 단백질의 조직 분포를 연구 하는 데 사용 됩니다. 이 대상에 대 한는 리간드의 선택도 대 한 직접적인 정보를 제공합니다. 생체 외에서 autoradiography도 사용할 수 있습니다 결정 뿐만 아니라 약리 바인딩 매개 변수 분리 상수 (Kd) 및 (B최대), 바인딩 사이트의 밀도 같은 radioligands의 양적 결정 경쟁 ligands1,2의 저해 상수 (Ki). 전통적인 homogenate radioligand 바인딩에 비해 autoradiography 공간 해부학을 시각화 수 있는 그리고 지역 식 패턴3의 간결 상세히의 이점이 있다. Autoradiography 방법 따라서 검증 된 항 체의 부재에 (서) 특히 immunocytochemistry에 관련 대안입니다. Autoradiography 쉽게 필요한 약리학 특이성, 톰 cryostat 준비 조직 단면도, 및 적합 한 이미징에 대 한 액세스와 함께 적합 한 radioligand의 가용성을 주어진 표준 방사성 동위 원소 실험실에서 구현 각 조직 섹션에서 방사능의 분포를 분석할 수 있는 장치. 특히,는 radioligand에 대 한 중요 한 선택 기준이 아닌 대상 사이트에 바인딩 제한 금액입니다. 이 다른 단백질, 세포 막 또는 플라스틱 또는 필터, 등 자료 수 있으며 일반적인 바인딩 통칭. 일반적으로, 비 특정 바인딩 비 있는 하지만 있는 특정 오프 대상 단백질을 포함 될 수 있습니다. 사실 특정 바인딩 유효성을 검사 하는 가장 좋은 방법은 조직 부족 대상, 예를 들면, 유전자를 비교 (녹아웃) 조직4설계 된다.
여기, 방법론은 포유류 두뇌에서 γ-hydroxybutyric acid (GHB)의 높은 친 화력 바인딩 사이트의 autoradiographic 묘사와 그림입니다. GHB는 narcolepsy 및 알코올 중독5, 치료 뿐만 아니라 포유류 두뇌와는 레크리에이션의 자연 구성 모두 임상적으로 유용한 약물 관련성의 이다 GHB와 그것의 바인딩 사이트 간의 약리 상호 작용 이해 약6. 높은 선호도 GHB 바인딩 사이트 처음 쥐 뇌 homogenate7[3H] GHB 바인딩을 사용 하 여 설명 했다. 년 동안, 더 autoradiography 연구 [3H] GHB와 아날로그 [3H] NCS 382 바인딩 사이트 쥐8,,910, 마우스9 개 지역에서의 높은 밀도 보였다는 11와 원숭이/인간 두뇌12돼지. 그러나, 분자 정체성과 이러한 바인딩 사이트의 정확한 기능 관련성은 애매 남아 있다.
의도 바인딩 사이트 추가 하 고 GHB의 생리 적 역할에 대 한 연구를 촉진 하기 위하여, 다른 동위 원소 다른 선호도 부여를 통합 하는 여러 radioligands 개발 되었습니다 ([3H] GHB, [3 H] NCS-382, [3H] HOCPCA와 [125나] BnOPh GHB)13,,1415,16(17에서 검토) (그림 1). 선택적인 높은 선호도 radioligands와 바인딩 사이트 이미징 기술9,11형광체를 사용 하 여 높은-품질 이미지의 생산에 대 한 허용의 매우 높은 조직 밀도의 조합. 세부를 예증 하는 autoradiographic 실험 및 그림 설정에 실용적인 포인트의 개요, 함께 토론 섹션의 방사성 핵 종 i) 선택, ii) 분석 결과 조건, 선택 및 iii) 형광체의 사용을 강조 합니다. x 선 필름 대 이미징 접시입니다. 이 종이의 전반적인 목표는 조직 분포 및 단백질 목표의 약리학 분석에 대 한 알리는 autoradiography 기술에 기술, 방법론 및 과학적인 세부 사항을 제공.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Absolute ethanol</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>107017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BAS-TR2040 Imaging Plate</td>
			<td>GE Healthcare Life Science</td>
			<td>28956481</td>
			<td>20x40 cm - Sensitive to tritium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cresyl violet acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5042-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPX (non-aqueous mounting medium for microscopy)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>100579</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O.C.T. Compound, 12 x 125 mL</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td>Tissue-Tek</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>16005-1KG-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-9483</td>
			<td>microscope slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Manual Slide Staining Set</td>
			<td>Sakura Finetek Denmark ApS</td>
			<td>4451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tritium Standard on Glas</td>
			<td>American Radiolabeld Chemicals, Inc.</td>
			<td>ART 0123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene substitute</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5597</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

autoradiography as a simple and powerful method for visualization and characterization of pharmacological targets

Autoradiography 생체 외에서 인간 뿐만 아니라 실험 동물에서 조직에 관심사의 단백질의 해부학 적 분포를 시각화 하는 것을 목표로. 메서드를 생물 학적 대상 radioligand의 특정 바인딩을 기반으로 합니다. 따라서, 언된 조직 단면도 radioligand 솔루션, 알을 품는 그리고 대상 바인딩 이후 지역화 방사성 붕괴의 탐지에 의해 예를 들어 감광 필름 또는 인광 체 격판덮개를 이미징 사용 하 여. 결과 디지털 autoradiograms 정량화 및 지역화 radioligand 바인딩 다른 해 부 구조에서의 놀라운 공간 해상도 표시 합니다. 또한, 정량화 바인딩 사이트 (B최대) 선택 된 조직에서의 밀도 뿐만 아니라 분리 상수 (Kd), (K나) 저해 상수에 의하여 ligand 선호도 약리 특성에 대 한 수 있습니다. 따라서, 메서드는 대상 지역화 및 리간드 선택에 대 한 정보를 제공합니다. 여기, 기술은 높은 선호도 γ-hydroxybutyric 산 (GHB) 바인딩 바인딩 분석 결과 관한 방법론 고려 사항에 특별 한 강조와 포유류 뇌 조직에서 사이트의 autoradiographic 묘사와 궁 행 매개 변수는 radioligand 및 검출 방법의 선택.

설명 된 프로토콜을 사용 하 여, 높은 선호도 GHB 바인딩 사이트의 해부학 적 분포 radiolabelled GHB 아날로그 [3H] 함께 가시화 했다 코로나, 화살 및 수평 섹션 (그림 3으로 잘 렸는 쥐의 뇌에 HOCPCA ). 높은 수준의 바인딩 해 마와 대뇌 피 질에서 관찰 되었다가 낮은 바인딩 및 바인딩 없음 검색 되었습니다, 소 뇌에 해당 하는 높은 선호도 GHB 사이트<...

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Autoradiography as a Simple and Powerful Method for Visualization and Characterization of Pharmacological Targets

시각화 및 약리 대상의 특성에 대 한 간단 하 고 강력한 방법으로 autoradiography

Autoradiography 하는 방법은 정기적으로 질적 또는 양적 약리학의 결정에 대 한 바인딩을 radioligands 조직 단면도를 공부 하는 데 사용 됩니다.

In vitro autoradiography aims to visualize the anatomical distribution of a protein of interest in tissue from experimental animals as well as humans. The ...

사인 방사선 사진은 표적에 대한 특정 방사선 리간드를 사용하여 조직에서 단백질 결합 부위의 분포를 연구하는 강력하고 간단한 기술입니다. 또한 면역 히스토케화학에 적합한 대안입니다. 이 기술은 전통적인 필름 노출보다 빠른 디지털 이미지를 통해 공간 해상도로 단백질 발현을 시각화합니다.그것은 또한 단백질 표적의 약리 분석에 사용될 수 있습니다. 이 방법은 유리에 장착 된 마우스 조직을 포함하지만 다른 종또는 커버립에서 자란 세포로 확장 될 수 있습니다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 박사 과정 학생 인 Nane Griem-Krey가 할 것입니다.시작하려면, 그것을 동결 스냅 가루 드라이 아이스에 조직을 잠급. 냉동 조직을 영하 20도로 설정된 냉동 조직을 냉동으로 직접 옮기습니다. 조직이 20 분 동안 극저온에서 영하 20도까지 적응하게하십시오.그런 다음 조직 홀더를 극저온 외부의 중간체로 덮고 냉동 조직 표본을 원하는 방향으로 빠르게 배치하고 중간크기는 여전히 액체입니다. 조직 홀더를 다시 극저온으로 옮기고 경화시 영하 10도 이하의 온도에 내장 된 매체를 노출하십시오. 극저온의 마이크로토메에 티슈 홀더를 배치합니다.기울어질 부분을 피하기 위해 조직의 방향을 조정합니다. 원하는 두께의 섹션에서 스테레오 탁스 아틀라스의 지도로 조직을 잘라 필요한 경우 작은 브러시로 섹션을 펼칩니다. 해동은 현미경 슬라이드에 섹션을 마운트합니다.그런 다음 원하는 기술 반복에 대한 관심 영역에서 섹션을 순차적으로 수집합니다. 슬라이드의 섹션이 추가 처리 전에 1시간 동안 공기를 건조하게 합니다. 인증된 방사능 실험실에서 연필을 사용하여 슬라이드에 실험 조건과 라벨을 부착합니다.슬라이드를 플라스틱 트레이에 수평으로 놓습니다. 문제의 대상에 맞게 조정된 적절한 양의 SA 버퍼를 슬라이드에 장착된 섹션에 신중하게 적용합니다. 각 섹션이 완전히 덮여 있는지 확인합니다.비특이적 결합의 판정을 위해 라벨이 없는 화합물의 관련 농도로 SA 버퍼를 보충하십시오. 그런 다음 증발을 피하기 위해 트레이를 뚜껑으로 덮습니다. 20 rpm으로 설정된 플레이트 셰이커에서 30분 동안 관련 온도에서 사전 배양합니다.다음으로 각 슬라이드에서 인큐베이션 전 액체를 부어 슬라이드를 플라스틱 트레이로 다시 옮습니다. 즉시 SA 버퍼에서 radioligand의 관련 농도와 함께 섹션을 완전히 덮습니다. 비특이적 결합의 판정을 위해, 라벨이 없는 화합물의 관련 농도로 radioligand 용액을 보충한다.트레이를 뚜껑으로 덮고 원하는 조건에서 20 rpm에서 일정한 부드러운 흔들림으로 인큐베이션하십시오. 그 후 인큐베이션 용액을 부어 슬라이드를 현미경 슬라이드 랙으로 옮킨다. 슬라이드를 즉시 씻으십시오.GHB 프로토콜의 경우 얼음 차가운 SA 버퍼로 20초 간 세척한 다음 슬라이드 랙을 얼음 차가운 증류수로 채워진 트레이에 찍어 두 번 헹구십시오. 슬라이드를 랙에 수직으로 배치하고 공기건조를 최소 1시간 동안 건조시합니다. 그런 다음 실온에서 하룻밤 고정을 위해 파라포름알데히드를 포함하는 고정소로 슬라이드를 옮김합니다.다음 날, 실온에서 실리카 젤이 들어있는 건조기 상자로 슬라이드를 옮기. 수분을 제거하기 위해 3 시간 동안 건조기 상자에 슬라이드를 둡니다. 첫째, 조직을 향하고 방사선 차폐 이미징 플레이트 카세트에 섹션을 배치합니다.방사성 리간드 결합의 후속 정량화를 위해 모든 카세트에 방사성 마이크로 스케일을 포함한다. 사용 직전에 삼중수소에 민감한 인광 화상 진찰 판을 인광 화상 진찰 기계에 적재하고 제조업체의 지시에 따라 가시적외선에 노출하여 지웁니까. 그런 다음 인광 화상 진찰 기계에서 이미징 플레이트를 제거하고 즉시 카세트의 섹션에 놓습니다.카세트가 완전히 닫혀 있는지 확인합니다. 빛으로부터 보호하면서 실온에서 최적화된 노출 시간을 위해 피광기 이미징 플레이트에 섹션을 노출시하십시오. 노출 후, 조심스럽게 어둠 속에서 카세트를 열고 즉시 인광구 이미저의 어두운 상자에 이미징 플레이트를 전송합니다.디지털 이미지를 얻기 위해 가능한 최고 해상도로 플레이트를 스캔합니다. 먼저 적절한 이미지 분석 프로그램을 엽니다. 메뉴 항목 영역 측정을 선택하여 각 교정 표준에 대한 상대 광학 밀도를 결정합니다.지역 생성을 위한 도구를 선택하고 방사성 마이크로스케일의 각 지점에 대해 동일한 크기의 영역을 선택하는 데 사용합니다. 메뉴 항목 레이블 아래의 번호를 클릭하여 선택한 각 영역에 숫자를 할당합니다. 파일 내보내기를 클릭한 다음 2D 지역 보고서를 클릭하여 교정 표준의 각 지점에 대한 OD 값을 내보냅니다.독점 이미징 소프트웨어에서 영역 생성 도구를 사용하여 모든 섹션에 대한 관심 영역을 선택하고 OD를 측정하여 자동 라디오그램의 정량화를 수행합니다. 관심 영역에 대한 템플릿을 만들어 모든 섹션에서 동일한 영역을 선택하고 각 자동 라디오그램의 뇌 해부학의 사소한 변형으로 복사하여 조정합니다. 이 후 파일 내보내기 2D 지역 보고서를 클릭하여 선택한 영역의 ROD 값과 크기를 스프레드시트로 내보냅니다.텍스트 프로토콜에 설명된 대로 radioligand의 바인딩을 결정합니다. 이 연구에서는, 높은 친화성 GHB 결합 부위의 해부학적 분포는 관상, 처탈 및 수평 섹션으로 절단된 마우스 뇌에서 방사성 표지된 GHB 아날로그 방사성 HOCPCA로 시각화됩니다. 높은 수준의 결합은 해마와 피질에서 볼 수 있으며, 낮은 결합 수준은 줄무늬에서 볼 수 있으며 소뇌에서 바인딩이 감지되지 않습니다.여기에 도시된 바와 같이, 해부학적 구조는 상이한 평면을 사용하여 시각화될 수 있고 해부학적 무결성은 크레실 바이올렛 스테인링에 의해 지원될 수 있다. 쥐, 마우스 및 돼지의 대표적인 자동 방사선 사진은 포유류 뇌에서 높은 친화성 GHB 결합 부위의 진화적 보존을 보여줍니다. 방사성 HOCPCA 결합 부위는 그들 사이의 총 뇌 해부학의 비교를 가능하게 하는 모든 3종에서 검출됩니다.높은 선호도 GHB 바인딩 사이트는 바인딩 사이트에 대한 서로 다른 친화성을 표시하지만 유사한 특정 활동을 표시하는 GHB radioligands와 프로브됩니다. 방사성 HOCPCA는 고감도 및 뛰어난 신호 대 잡음 비율을 부여합니다. 방사성 NCS-382의 낮은 감도로 인해 유사한 수준의 결합을 얻기 위해 더 높은 방사성 리간드 농도를 사용해야 합니다.방사성 GHB가 유사한 결합 수준을 달성하기 위해서는 더 높은 방사성 GHB가 필요합니다. 그러나, 더 높은 radioligand 농도는 또한 노이즈 비율에 결과적으로 더 낮은 신호와 비특이적 결합의 수준을 증가시다. 소음 비에 가장 좋은 신호를 얻기 위해 radioligand 농도, 세척 및 노출 시간과 같은 분석 조건을 최적화하는 것이 중요하며 이전에 플레이트를 지우는 것도 매우 중요합니다.절차는 발견 프로젝트에 유용 할 수있는 살아있는 동물의 화합물 바인딩에 대한 아이디어를 얻기 위해 생체 내 조건으로 확장 될 수있다. 인증된 완전한 방사성 물질이 있는 실험실에서 일하고 방사능 또는 파라포름알데히드를 취급할 때 보호복을 착용해야 합니다.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Simple Composite Phenotype Scoring System for Evaluating Mouse Models of Cerebellar Ataxia

소뇌 운동 실조증의 마우스 모델을 평가하기위한 간단한 복합 표현형 점수 시스템

We describe a protocol for the rapid and sensitive quantification of disease severity in mouse models of cerebella ataxia. It is derived from previously ...

연구

신경과학

Novel Apparatus and Method for Drug Reinforcement

약물 보강 소설 장치 및 방법

Animal models of reinforcement have proven to be useful for understanding the neurobiological mechanisms underlying drug addiction.  Operant drug ...

The Vermicelli and Capellini Handling Tests: Simple quantitative measures of dexterous forepaw function in rats and mice

베르 미 첼리와 Capellini 처리 시험 : 쥐 및 생쥐의 손재주가 앞발 기능의 단순 양적 측정

Previous characterizations of rodent eating behavior have revealed that they use coordinated forepaw movements to manipulate food pieces. We have extended ...

Automated Interactive Video Playback for Studies of Animal Communication

동물 커뮤니케이션 연구를위한 자동화된 대화형 비디오 재생

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Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

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의 Proprioceptors의 시각화<em&gt; Drosophila</em&gt; 애벌레와 Pupae

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

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사용하는 마우스 대뇌 피질과 해마의 시각화 및 Dendrites와 쪽이의 유전자 조작<em&gt; utero에서</em&gt; Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development

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예 자궁 Electroporation 및 전체 반구의 Explants : 초기 두피 개발 연구 간단한 실험 방법

Cortical development involves complex interactions between neurons and non-neuronal elements including precursor cells, blood vessels, meninges and ...

A Simple and Inexpensive Method for Determining Cold Sensitivity and Adaptation in Mice

마우스에 콜드 민감도 및 적응을 결정하기위한 간단하고 저렴한 방법

Cold hypersensitivity is a serious clinical problem, affecting a broad subset of patients and causing significant decreases in quality of life.  The cold ...

Live Imaging of Nicotine Induced Calcium Signaling and Neurotransmitter Release Along Ventral Hippocampal Axons

니코틴 유도 칼슘 신호 전달 및 복부 해마 축삭을 따라 신경 전달 물질 방출의 라이브 영상

Sustained enhancement of axonal signaling and increased neurotransmitter release by the activation of pre-synaptic nicotinic acetylcholine receptors ...

A Simple Alternative to Stereotactic Injection for Brain Specific Knockdown of miRNA

miRNA의 뇌의 특정 최저 대한 정위 주입하는 간단한 대안

MicroRNAs (miRNAs) are key regulators of gene expression.  In the brain, vital processes like neurodevelopment and neuronal functions depend on the ...