Name: autoradiography as a simple and powerful method for visualization and characterization of pharmacological targets
Uploaded: 2019-03-12T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Autoradiography as a Simple and Powerful Method for Visualization and Characterization of Pharmacological Targets at JoVE.com

Arbeidet ble støttet av Lundbeck Foundation (Grant R133-A12270) og Novo Nordisk Foundation (Grant NNF0C0028664). Forfatterne takker Dr. Aleš Marek for levering av [3H] radioligand.

Alle dyr behandling ble utført i samsvar med retningslinjer fra den danske dyr eksperimentering Inspectorate.
Merk: Protokollen beskrevet her dekker vev forberedelse (dvs.mus hjernevev), i vitro autoradiographic analysen i tilstrekkelig detalj for å konfigurere metoden i en ny lab, eksponering fosfor imaging plater samt etterfølgende densitometric analyse av autoradiograms (figur 2) med sikte på å lokalisere og kvantifisere radioligand bindi...

Kvaliteten på autoradiographic analysen bestemmes oftest følsomheten til radioligand. En viktig medvirkende faktor er den valgte radioisotop, som er gitt av tilgjengeligheten av kjente ligander eller muligheten for spesifikke merking teknikker å gi ligander med aktuelle aktiviteten (dvs., mengden av radioaktivitet per enhet mol et radioligand)23og med begrensede mengder av kjemiske degradering. Mange radioligands av kjente ligander merkes med tritium9,</sup...

Autoradiography er en metode som gir bilder av radioaktivitet. Teknikken brukes rutinemessig å studere vev distribusjon av et protein av interesse i vitro basert på en bestemt farmakologiske interaksjon mellom en radiolabelled sammensatte og målet. Dette gir direkte kunnskap om selektivitet av ligand for målet. In vitro autoradiography kan også brukes for kvantitative fastsettelse av farmakologiske bindingsparameterne av radioligands, som dissosiasjon konstant (Kd) og tetthet av bindende områder (BMaks), samt for å bestemme hemming-konstant (Kjeg) av konkurrerende ligander1,2. Sammenlignet med tradisjonelle homogenate radioligand binding, har autoradiography fordelen av å kunne visualisere romlige anatomi og gi konsis detaljer om regionale uttrykk mønstre3. Metoden autoradiography er derfor et aktuelt alternativ til immunocytochemistry, spesielt i fravær av et valideres antistoff. Autoradiography er lett implementert i et standard radioisotop laboratorium gitt tilgjengeligheten av en egnet radioligand med nødvendige farmakologiske spesifisitet, tilgang til en mikrotomen kryostaten forbereder vev inndelinger og en passende bildebehandling enhet som kan analysere fordelingen av radioaktivitet i delene respektive vev. En viktig utvalgskriterium i radioligand er spesielt begrenset binding til ikke-målområder. Dette kan være andre proteiner, membraner eller materialer som plast eller filtre og er kollektivt referert til som uspesifisert bindende. Vanligvis uspesifisert binding er ikke-saturable men kan være saturable hvis det innebærer et bestemt off-målet protein. Den beste måten å validere ekte bestemt bindingen er å sammenligne vev mangler målet, f.eksgenetisk konstruert (knock-out) vev4.
Her er metodikken illustrert med autoradiographic karakterisering av høy affinitet binding området for γ-hydroxybutyric syre (GHB) i pattedyr hjernen. Forstå farmakologiske samspillet mellom GHB og sin binding området er relevant GHB er både et klinisk nyttig stoff i behandlingen av Narkolepsi og alkoholisme5, men også en naturlig bestanddel av pattedyr hjernen og en rekreasjon narkotika6. Høy affinitet GHB bindende områder ble først beskrevet ved hjelp av [3H] GHB binding til rotte hjernen homogenate7. Gjennom årene, videre autoradiography studier med [3H] GHB og analog [3H] sokkel-382 har vist en høy tetthet av bindende områder i forebrain regioner av rotte8,9,10, musen9 , gris11og monkey/menneskelige hjerne12. Imidlertid har molekylær identitet og nøyaktig funksjonelle relevansen av disse bindende områder vært unnvikende.
Med hensikten å ytterligere karakterisere bindende områder, og å lette studier fysiologiske rollen GHB, flere radioligands omfatter forskjellige isotoper utstyrt med forskjellige interesseområder er utviklet ([3H] GHB, [3 H] sokkel-382 [3H] HOCPCA og [125jeg] BnOPh-GHB)13,14,15,16(omtalt i17) (figur 1). Kombinasjonen av selektiv høy affinitet radioligands og en meget høy vevs tetthet at bindingen nettsteder har tillatt for produksjon av høy kvalitet bilder ved hjelp av fosfor tenkelig teknikk9,11. Sammen med en disposisjon av de praktiske punktene i å sette opp et autoradiographic eksperiment og en illustrasjon formidle detaljer vil under diskusjon understreke i) valg av radionuklidenes, ii) valg av analysen og iii) bruk av fosfor bildebehandling plater versus X-ray film. Det overordnede målet med denne utredningen er å gi teknisk og vitenskapelig og metodologiske detaljer på autoradiography teknikken for å informere om vev distribusjon og farmakologiske analyse av protein mål.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Absolute ethanol</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>107017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BAS-TR2040 Imaging Plate</td>
			<td>GE Healthcare Life Science</td>
			<td>28956481</td>
			<td>20x40 cm - Sensitive to tritium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cresyl violet acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5042-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPX (non-aqueous mounting medium for microscopy)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>100579</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O.C.T. Compound, 12 x 125 mL</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td>Tissue-Tek</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>16005-1KG-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-9483</td>
			<td>microscope slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Manual Slide Staining Set</td>
			<td>Sakura Finetek Denmark ApS</td>
			<td>4451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tritium Standard on Glas</td>
			<td>American Radiolabeld Chemicals, Inc.</td>
			<td>ART 0123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene substitute</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5597</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

autoradiography as a simple and powerful method for visualization and characterization of pharmacological targets

In vitro autoradiography mål å visualisere anatomiske fordelingen av et protein av interesse i vev fra forsøksdyr som mennesker. Metoden er basert på bestemte binding av en radioligand til biologiske målet. Derfor frossent deler er ruges med radioligand løsning, og bindingen til målet er senere lokalisert ved påvisning av radioaktivitet, for eksempel ved hjelp av fotosensitive film eller fosfor imaging plater. Resulterende digitale autoradiograms vise bemerkelsesverdig romlig oppløsning, som muliggjør kvantifisering og lokalisering av radioligand binding i forskjellige anatomiske strukturer. Videre tillater kvantifisering farmakologiske karakterisering av ligand affinitet med dissosiasjon konstanter (Kd), hemming konstanter (Kjeg) samt tettheten av bindende områder (BMaks) i valgte vev. Dermed gir metoden informasjon om både målet lokalisering og ligand selektivitet. Her, er teknikken eksemplifisert med autoradiographic karakteristikk av høy affinitet γ-hydroxybutyric syre (GHB) bindende områder i pattedyr hjernevev, med spesiell vekt på metodiske hensyn bindende analysen parametere, radioligand og oppdagelsen metoden.

Bruker beskrevet protokollen, anatomisk fordelingen av høy affinitet GHB bindende områder var visualisert med radiolabelled GHB analog [3H] HOCPCA i musen hjernen, som ble skåret i koronale, sagittal og vannrette delene (Figur 3 ). Høye nivåer av binding ble observert i hippocampus og cortex, lavere i striatum og ingen binding ble oppdaget i lillehjernen tilsvarer tidligere rapporterte uttrykk mønstre av høy affinitet GHB nettsteder<sup clas...

Watch this Scientific Journal Video about Autoradiography as a Simple and Powerful Method for Visualization and Characterization of Pharmacological Targets at JoVE.com

Autoradiography as a Simple and Powerful Method for Visualization and Characterization of Pharmacological Targets

Autoradiography som en enkel og kraftig metode for visualisering og karakterisering av farmakologiske mål

Metoden autoradiography brukes rutinemessig å studere binding av radioligands til vev deler for fastsettelse av kvalitative og kvantitative farmakologi.

In vitro autoradiography aims to visualize the anatomical distribution of a protein of interest in tissue from experimental animals as well as humans. The ...

Autoradiografi er en kraftig og enkel teknikk for å studere distribusjon av proteinbindende steder i vev ved hjelp av spesifikk radioligand for målet. Det er også egnet alternativ til immunohistochemistry. Denne teknikken visualiserer proteinuttrykk med romlig oppløsning via digitale bilder som er raskere enn tradisjonell filmeksponering.Det kan også brukes til farmakologisk analyse av proteinmål. Metoden innebærer mus vev montert på glass, men kan utvides til andre arter eller til og med til celler dyrket på coverslips. Å demonstrere prosedyren vil være av Nane Griem-Krey, en ph.d.-student i laboratoriet mitt.For å begynne, senk vevet i pulverisert tørris for å smekker fryse den. Overfør det frosne vevet direkte til en kryostat som er satt til minus 20 grader Celsius. La vevet akklimatisere seg til minus 20 grader Celsius i kryostaten i 20 minutter.Dekk deretter vevsholderen med innebyggingsmediet utenfor kryostaten og plasser raskt den frosne vevsprøven i ønsket retning mens innebyggingsmediet fortsatt er flytende. Overfør vevsholderen tilbake til kryostaten og utsett innebyggingsmediet til temperaturer under minus 10 grader Celsius for herding. Plasser vevsholderen i mikrotomen på kryostaten.Juster retningen på vevet for å unngå skrånende seksjoner. Klipp vevet med veiledning av et stereotoksisk atlas i deler av ønsket tykkelse og brett ut seksjonen med en liten børste om nødvendig. Tin delen på et mikroskopsklie.Deretter sekvensielt samle seksjonene fra regionen av interesse for ønsket teknisk repetisjon. La seksjonene på skliene lufttørke i en time før videre håndtering. I et sertifisert radioaktivitetslaboratorium bruker du en blyant til å merke lysbildene med eksperimentelle forhold.Plasser lysbildene horisontalt i plastbrett. Påfør forsiktig et passende volum av SA-buffer justert til det aktuelle målet på de aktuelle delene som er montert på lysbildene. Kontroller at hver del er helt dekket.For fastsettelse av ikke-spesifikk binding, supplere SA buffer med en relevant konsentrasjon av umerkede sammensatte. Dekk deretter brettene med lokk for å unngå fordampning. Forhåndsinkuber ved en relevant temperatur i 30 minutter på en plateshaker satt til 20 o/min.Hell deretter av forinkubasjonsvæsken fra hvert lysbilde og overfør lysbildene tilbake til plastbrettet. Dekk umiddelbart seksjonene helt med relevant konsentrasjon av radioligand i SA-buffer. For bestemmelse av ikke-spesifikk binding, supplere radioligand løsning med en relevant konsentrasjon av umerket forbindelse.Dekk brettene med lokk og inkuber under ønskede forhold med konstant skånsom risting ved 20 o/min. Etter dette, hell av inkubasjonsløsningen og overfør lysbildene til et mikroskopskliestativ. Vask straks lysbildene.For GHB-protokollen vasker du to ganger med iskald SA-buffer i 20 sekunder og skyll deretter to ganger ved å dyppe lysbildestativet i skuffer fylt med iskaldt destillert vann. Plasser lysbildene vertikalt i stativer og lufttørk i minst én time. Overfør deretter lysbildene til en fikser som inneholder paraformaldehyd for fiksering over natten ved romtemperatur.Neste dag, overføre lysbildene til en desiccator boks som inneholder silika gel ved romtemperatur. La lysbildene stå i desiccatorboksen i tre timer for å eliminere fuktighet. Plasser først seksjonene i en strålingsskjermet bildeplatekassett med vevet vendt opp.Inkluder en radioaktiv mikroskala i hver kassett for påfølgende kvantifisering av radioligog binding. Umiddelbart før bruk legger du den tritiumfølsomme fosforbildeplaten inn i fosforbildemaskinen og utsetter den for synlig infrarødt lys i henhold til produsentens instruksjoner for å slette den. Fjern deretter bildeplaten fra fosforbildemaskinen og plasser den umiddelbart på seksjonene i kassetten.Kontroller at kassetten er helt lukket. Utsett seksjonene for fosforbildeplaten for den optimaliserte eksponeringstiden ved romtemperatur mens de er skjermet mot lys. Etter eksponering, åpne kassetten forsiktig i mørket og overfør umiddelbart bildeplaten til den mørke boksen til en fosforbilder.Skann platen med høyest mulig oppløsning for å få et digitalt bilde. Åpne et passende bildeanalyseprogram for å begynne. Bestem de relative optiske tetthetene for hver kalibreringsstandard ved å velge områdebestemmelsen for menyelementet.Velg verktøyet for oppretting av område, og bruk det til å velge et område med lik størrelse for hvert punkt i den radioaktive mikroskalaen. Tilordne et tall til hvert valgte område ved å klikke på nummer under menyelementetiketten. Klikk Fileksport og deretter 2D-områderapport for å eksportere OD-verdiene for hvert punkt i kalibreringsstandarden.I den proprietære bildebehandlingsprogramvaren bruker du et områdeopprettingsverktøy til å velge interesseområdet i hver seksjon og måle ODene for å begynne å utføre kvantifisering av autoradiogrammene. Velg samme region i hver del ved å opprette en mal for interesseområdet og kopiere og justere den til mindre variasjoner i hjernens anatomi i hvert autoradiogram. Etter dette klikker du Fileksporter 2D-områderapport for å eksportere ROD-verdiene og -størrelsene for valgte områder til et regneark.Bestem bindingen av radioligand som beskrevet i tekstprotokollen. I denne studien visualiseres den anatomiske fordelingen av de høye affinitetsbindingsstedene GHB med de radiomerkede GHB analoge radioaktive HOCPCA i en musehjerne som ble kuttet i koronale, sagittal og horisontale seksjoner. Høye bindingsnivåer er sett i hippocampus og cortex mens lavere bindingsnivåer er sett i striatum og ingen binding oppdages i lillehjernen.Som vist her, kan de anatomiske strukturene visualiseres ved hjelp av forskjellige plan og anatomisk integritet kan støttes av cresyl fiolett farging. Representative autoradiograms av en rotte, en mus og en gris illustrerer evolusjonær bevaring av den høye affinitet GHB bindende steder i pattedyr hjernen. Radioaktive HOCPCA bindende steder oppdages hos alle tre artene som muliggjør sammenligning av grov hjerneanatomi mellom dem.De høye affinitets ghb binding nettsteder er undersøkt med GHB radioligander som viser ulike affiniteter for bindende nettsteder, men sammenlignbare spesifikke aktiviteter. Radioaktiv HOCPCA er utstyrt med høy følsomhet og utmerket signal-til-støy-forhold. På grunn av den lavere følsomheten til radioaktivt norsk sokkel-382 må høyere radioligandkonsentrasjoner brukes for å oppnå lignende bindingsnivåer.Enda høyere radioligand konsentrasjoner er nødvendig for at radioaktivt GHB skal oppnå sammenlignbare bindingsnivåer. Høyere radioligog konsentrasjoner øker imidlertid også nivået av ikke-spesifikk binding med et følgelig lavere signal-til-støy-forhold. Det er viktig å optimalisere analyseforholdene som radioligand konsentrasjon, vasking og eksponeringstid for å få det beste signalet til støyforhold, og det er også svært viktig å huske å slette platen før.Prosedyren kan utvides til in vivo forhold for å få en idé om sammensatt binding i et levende dyr som kan være nyttig for oppdagelsesprosjekter. Husk å arbeide i et laboratorium med sertifisert fullt radioaktivt materiale og å bruke verneklær ved håndtering av radioaktivitet eller paraformaldehyd.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Simple Composite Phenotype Scoring System for Evaluating Mouse Models of Cerebellar Ataxia

We describe a protocol for the rapid and sensitive quantification of disease severity in mouse models of cerebella ataxia. It is derived from previously ...

Novel Apparatus and Method for Drug Reinforcement

Animal models of reinforcement have proven to be useful for understanding the neurobiological mechanisms underlying drug addiction.  Operant drug ...

The Vermicelli and Capellini Handling Tests: Simple quantitative measures of dexterous forepaw function in rats and mice

Previous characterizations of rodent eating behavior have revealed that they use coordinated forepaw movements to manipulate food pieces. We have extended ...

Automated Interactive Video Playback for Studies of Animal Communication

Video playback is a widely-used technique for the controlled manipulation and presentation of visual signals in animal communication. In particular, ...

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Visualisering av Proprioceptors i<em&gt; Drosophila</em&gt; Larver og pupper

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Visualisering og genetisk manipulering av dendritter og pigger i Mus hjernebarken og hippocampus hjelp<em&gt; I fosterlivet</em&gt; Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development

Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development

Ex utero Electroporation og Whole halvkule explants: A Simple Experimental Method for studier av tidlig kortikal utvikling

Cortical development involves complex interactions between neurons and non-neuronal elements including precursor cells, blood vessels, meninges and ...

A Simple and Inexpensive Method for Determining Cold Sensitivity and Adaptation in Mice

En enkel og rimelig metode for å bestemme Cold Følsomhet og Adaptation i Mus

Cold hypersensitivity is a serious clinical problem, affecting a broad subset of patients and causing significant decreases in quality of life.  The cold ...

Live Imaging of Nicotine Induced Calcium Signaling and Neurotransmitter Release Along Ventral Hippocampal Axons

Live-Imaging av nikotin Induced Kalsium alarm og neurotransmitterfrigivning Sammen ventral Hippokampale Axoner

Sustained enhancement of axonal signaling and increased neurotransmitter release by the activation of pre-synaptic nicotinic acetylcholine receptors ...

A Simple Alternative to Stereotactic Injection for Brain Specific Knockdown of miRNA

Et enkelt alternativ til Stereotactic Injection for Brain Spesifikk knockdown av miRNA

MicroRNAs (miRNAs) are key regulators of gene expression.  In the brain, vital processes like neurodevelopment and neuronal functions depend on the ...