Name: autoradiography as a simple and powerful method for visualization and characterization of pharmacological targets
Uploaded: 2019-03-12T15:00:00
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O trabalho foi financiado pela Fundação Lundbeck (Grant R133-A12270) e a Novo Nordisk Foundation (Grant NNF0C0028664). Os autores agradecer Dr. Aleš Marek para o fornecimento de radioligantes [3H].

Todo animal manipulação foi realizada em conformidade com as diretrizes da Inspetoria de Experimentação Animal dinamarquês.
Nota: O protocolo descrito aqui aborda a preparação do tecido (ou seja, tecido de cérebro de rato), em vitro ensaio eosina em detalhes suficientes para a criação do método em um novo laboratório, a exposição de imagem de placas de fósforo, bem como subsequente análise densitométricos de autoradiograms (Figura 2</stro...

A qualidade de um ensaio de eosina mais frequentemente é determinada pela sensibilidade do radioligantes. Um grande fator que contribui é o radioisótopo selecionado, que é dado pela disponibilidade de ligantes conhecidos ou pela viabilidade de técnicas específicas de rotulagem para produzir ligantes com atividade específica apropriada (ou seja, a quantidade de radioatividade por mole de unidade de um radioligantes)23e com quantidades limitadas de degradação química. Um grande n?...

Autoradiografia é um método que fornece imagens de decaimento radioativo. A técnica é usada rotineiramente para estudar a distribuição de tecido de uma proteína de interesse em vitro com base em uma interação farmacológica específica entre um composto marcadas com radioisótopos e seu destino. Isto fornece informação directa sobre a seletividade do ligante para o alvo. Em vitro autoradiografia pode também ser utilizada para a determinação quantitativa dos parâmetros de ligação farmacológica de radioligands, tais como a constante de dissociação (Kd) e a densidade dos sítios de ligação (Bmáx), bem como para a determinação a constante de inibição (Ki) de concorrentes ligantes1,2. Comparado aos tradicionais homogenate radioligantes vinculação, autoradiografia tem a vantagem de ser capaz de visualizar a anatomia espacial e dando detalhes sucintas de padrões de expressão regional3. O método de autoradiografia, portanto, é uma alternativa relevante de imunocitoquímica, especialmente na ausência de um anticorpo validado. Autoradiografia é facilmente implementada em um laboratório de radioisótopos padrão dado a disponibilidade de um radioligantes adequado com a necessária especificidade farmacológica, acesso a um criostato micrótomo para a preparação de cortes de tecido e uma imagem adequada dispositivo que é capaz de analisar a distribuição de radioatividade nas seções respectivas tecido. Nomeadamente, um critério importante de seleção para o radioligantes é uma quantidade limitada de ligação a sites não-alvo. Isto pode ser para outras proteínas, membranas ou materiais como plástico ou filtros e é coletivamente conhecido como inespecificas. Geralmente, inespecificas é não saturável, mas podem ser saturável se envolve uma proteína específica de fora do alvo. A melhor forma de validar a verdadeira ligação específica é comparar aos tecidos falta o alvo, por exemplo, geneticamente projetado tecido (nocaute)4.
Aqui, a metodologia é ilustrada com a eosina caracterização do sítio de ligação de alta afinidade para ácido γ-hidroxibutírico (GHB) o cérebro de mamíferos. Compreender a interação farmacológica entre o GHB e o seu sítio de ligação é de relevância como o GHB é uma droga ambos clinicamente útil no tratamento da narcolepsia e alcoolismo5, mas, também, um constituinte natural do cérebro de mamíferos e um recreio Droga,6. Locais de alta afinidade GHB obrigatórios foram primeiro descritos usando vinculação de GHB [3H] de cérebro de rato homogenate7. Ao longo dos anos, mais estudos autoradiografia com [3H] GHB e o análogo [3H] NCS-382 mostrou uma alta densidade de binding sites em regiões prosencéfalo de rato8,9,10, rato9 , cérebro de macaco/humano e1112de porco. No entanto, a identidade molecular e a relevância funcional exata desses sites de ligação permaneceram indescritíveis.
Com a intenção de caracterizar ainda mais os sítios de ligação e para facilitar os estudos sobre o papel fisiológico de GHB, foram desenvolvidos vários radioligands, incorporando diferentes isótopos dotados com afinidades diferentes ([3H] GHB, [3 H] NCS-382, [3H] HOCPCA e [125eu] BnOPh-GHB)13,14,15,16(revisto em17) (Figura 1). A combinação de radioligands de alta afinidade seletiva e uma densidade muito alta de tecido de binding sites permitiram a produção de imagens de alta qualidade usando o fósforo de imagem técnica9,11. Juntamente com um resumo dos pontos na criação de uma experiência de eosina e uma ilustração para exemplificar detalhes práticos, a seção de discussão enfatizará i) a escolha do radionuclídeo, ii) a escolha das condições de ensaio e iii) a utilização de fósforo placas de imagem contra a película de raio x. O objetivo geral deste trabalho é fornecer detalhes técnicos, metodológicos e científicos sobre a técnica de autoradiografia para informar sobre a distribuição tecidual e análise farmacológica de alvos de proteína.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Absolute ethanol</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>107017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BAS-TR2040 Imaging Plate</td>
			<td>GE Healthcare Life Science</td>
			<td>28956481</td>
			<td>20x40 cm - Sensitive to tritium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cresyl violet acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5042-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPX (non-aqueous mounting medium for microscopy)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>100579</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O.C.T. Compound, 12 x 125 mL</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td>Tissue-Tek</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>16005-1KG-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-9483</td>
			<td>microscope slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Manual Slide Staining Set</td>
			<td>Sakura Finetek Denmark ApS</td>
			<td>4451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tritium Standard on Glas</td>
			<td>American Radiolabeld Chemicals, Inc.</td>
			<td>ART 0123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene substitute</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5597</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

autoradiography as a simple and powerful method for visualization and characterization of pharmacological targets

Em vitro autoradiografia pretende visualizar a distribuição anatômica de uma proteína de interesse em tecido de animais experimentais, bem como os seres humanos. O método baseia-se a vinculação específica de um radioligantes ao seu alvo biológico. Portanto, seções congeladas do tecido são incubadas com radioligantes solução, e a ligação para o destino é posteriormente localizada por detecção de decaimento radioativo, por exemplo, usando filme fotossensível ou imagem de placas de fósforo. Autoradiograms Digitas resultantes exibem notável resolução espacial, que permite a quantificação e localização da ligação de radioligantes em estruturas anatômicas distintas. Além disso, quantificação permite a caracterização farmacológica de afinidade de ligante através de constantes de dissociação (Kd), constantes de inibição (Keu), bem como a densidade dos sítios de ligação (Bmáx) em tecidos selecionados. Assim, o método fornece informações sobre localização de alvo e seletividade de ligante. Aqui, a técnica é exemplificada com eosina caracterização do ácido de alta afinidade γ-hidroxibutírico (GHB) vinculação sites no tecido do cérebro de mamíferos, com ênfase especial em considerações metodológicas sobre o ensaio parâmetros, a escolha do radioligantes e o método de deteção.

Usando o protocolo descrito, a distribuição anatômica dos sites alta afinidade de ligação GHB foi visualizada com o análogo GHB marcadas com radioisótopos [3H] HOCPCA no cérebro de rato, que foi cortado em secções coronais, sagitais e horizontais (Figura 3 ). Observaram-se altos níveis de vinculação no hipocampo e córtex, ligação inferior no corpo estriado e não foi detectados no cerebelo, correspondente aos padrões de expressão ...

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Autoradiography as a Simple and Powerful Method for Visualization and Characterization of Pharmacological Targets

Autoradiografia como um método simples e poderoso para visualização e caracterização de alvos farmacológicos

O método de autoradiografia é rotineiramente usado para estudar a ligação de radioligands para cortes de tecido para determinação da farmacologia qualitativa ou quantitativa.

In vitro autoradiography aims to visualize the anatomical distribution of a protein of interest in tissue from experimental animals as well as humans. The ...

Autordiografia é uma técnica poderosa e simples para estudar a distribuição de sítios de ligação proteica em tecidos usando radiolig e para o alvo. Também é uma alternativa adequada à imunohistoquímica. Esta técnica visualiza a expressão proteica com resolução espacial através de imagens digitais que é mais rápida do que a exposição cinematográfica tradicional.Também pode ser usado para análise farmacológica de alvos proteicos. O método envolve tecidos de camundongos montados em vidro, mas podem ser estendidos a outras espécies ou até mesmo a células cultivadas em deslizamentos de tampas. Demonstrando que o procedimento será de Nane Griem-Krey, uma estudante de doutorado no meu laboratório.Para começar, submergir o tecido em gelo seco em pó para congelá-lo. Transfira o tecido congelado diretamente para um criostat que é definido para menos 20 graus Celsius. Deixe o tecido aclimatar a menos 20 graus Celsius no criostat por 20 minutos.Em seguida, cubra o suporte tecidual com o meio de incorporação fora do criostat e coloque rapidamente a amostra de tecido congelado na orientação desejada enquanto o meio de incorporação ainda é líquido. Transfira o suporte tecidual de volta para o criostat e exponha o meio de incorporação a temperaturas abaixo de menos 10 graus Celsius para endurecimento. Posicione o suporte tecidual no microtome do criostat.Ajuste a orientação do tecido para evitar seções inclinadas. Corte o tecido com a orientação de um atlas estereotaxico em seções de espessura desejada e desdobre a seção com uma pequena escova, se necessário. Descongele a seção em um slide de microscópio.Em seguida, recolhem sequencialmente as seções da região de interesse para a repetição técnica desejada. Deixe as seções nos slides secarem por uma hora antes de manusear mais. Em um laboratório de radioatividade certificado, use um lápis para rotular os slides com as condições experimentais.Coloque os slides horizontalmente em bandejas de plástico. Aplique cuidadosamente um volume apropriado de tampão SA ajustado ao alvo em questão às seções montadas nos slides. Certifique-se de que cada seção está completamente coberta.Para a determinação de vinculação não específica, suplemente o tampão SA com uma concentração relevante de composto não rotulado. Em seguida, cubra as bandejas com tampas para evitar a evaporação. Pré-incubar a uma temperatura relevante por 30 minutos em um agitador de placas definido a 20 rpm.Em seguida, despeje o líquido de pré-incubação de cada slide e transfira os slides de volta para a bandeja de plástico. Cubra imediatamente as seções completamente com a concentração relevante de radiolig e no buffer SA. Para a determinação de vinculação não específica, complemente radiolig e solução com uma concentração relevante de composto não rotulado.Cubra as bandejas com tampas e incubar sob as condições desejadas com agitação suave constante a 20 rpm. Depois disso, despeje a solução de incubação e transfira os slides para um rack de slides de microscópio. Lave imediatamente os slides.Para o protocolo GHB, lave duas vezes com o tampão SA gelado por 20 segundos e enxágue duas vezes mergulhando o rack de slides em bandejas cheias de água gelada e destilada. Posicione os slides verticalmente em racks e o ar seque por pelo menos uma hora. Em seguida, transfira os slides para um fixador contendo paraformaldeído para fixação durante a noite à temperatura ambiente.No dia seguinte, transfira os slides para uma caixa de desiccator contendo gel de sílica à temperatura ambiente. Deixe os slides na caixa do desiccator por três horas para eliminar a umidade. Primeiro, coloque as seções em uma fita de placa de imagem protegida por radiação com o tecido virado para cima.Inclua uma microescala radioativa em cada para quantificação subsequente de radiolig e vinculação. Imediatamente antes do uso, carregue a placa de imagem de fósforo sensível ao trítio na máquina de imagem fosfora e exponha-a à luz infravermelha visível de acordo com as instruções do fabricante para apagá-la. Em seguida, remova a placa de imagem da máquina de imagem fosfora e coloque-a imediatamente sobre as seções do.Certifique-se de que o está completamente fechado. Exponha as seções à placa de imagem fosfora para o tempo de exposição otimizado à temperatura ambiente enquanto estiver protegido da luz. Após a exposição, abra cuidadosamente o no escuro e transfira imediatamente a placa de imagem para a caixa escura de um imager fosforo.Escaneie a placa na mais alta resolução possível para obter uma imagem digital. Para começar, abra um programa de análise de imagem apropriado. Determine as densidades ópticas relativas para cada padrão de calibração selecionando a determinação da região do item do menu.Selecione a ferramenta para criação de região e use-a para selecionar uma área de tamanho igual para cada ponto da microescala radioativa. Atribua um número a cada área selecionada clicando no número no rótulo do item do menu. Clique em Exportação de Arquivos e, em seguida, Relatório de Região 2D para exportar os valores OD para cada ponto do padrão de calibração.No software de imagem proprietário, use uma ferramenta de criação de região para selecionar a região de interesse em cada seção e medir seus ODs para começar a realizar a quantificação dos autoradiogramas. Selecione a mesma região em cada seção criando um modelo para a região de interesse e copie e ajuste-a a pequenas variações na anatomia cerebral em cada autordiograma. Depois disso, clique em Relatório de Região de Exportação de Arquivos 2D para exportar os valores e tamanhos de ROD das áreas selecionadas em uma planilha.Determine a vinculação do radioligand conforme descrito no protocolo de texto. Neste estudo, a distribuição anatômica dos locais de ligação GHB de alta afinidade são visualizadas com o HOCPCA radiolatroboado análogo GHB em um cérebro de camundongo que foi cortado em seções coronais, sagitas e horizontais. Altos níveis de ligação são vistos no hipocampo e córtex, enquanto níveis de ligação mais baixos são vistos no estriado e nenhuma ligação é detectada no cerebelo.Como mostrado aqui, as estruturas anatômicas podem ser visualizadas usando diferentes planos e a integridade anatômica pode ser suportada por manchas violetas de cresito. Autordiogramas representativos de um rato, um rato e um porco ilustram a conservação evolutiva dos locais de ligação ghb de alta afinidade no cérebro mamífero. Os locais de ligação radioativa hocpca são detectados em todas as três espécies que permitem a comparação da anatomia cerebral bruta entre eles.Os sites de ligação GHB de alta afinidade são sondados com radioligands GHB que exibem diferentes afinidades para os locais de ligação, mas atividades específicas comparáveis. O HOCPCA radioativo é dotado de alta sensibilidade e excelente relação sinal/ruído. Devido à menor sensibilidade do NCS-382 radioativo, devem ser utilizadas concentrações radioligas mais elevadas para obter níveis semelhantes de vinculação.Radiolig e concentrações ainda mais altas são necessárias para que o GHB radioativo atinja níveis de ligação comparáveis. No entanto, as concentrações de radiolig e de radiolig mais altas também aumentam o nível de ligação não específica com uma relação sinal/ruído consequentemente menor. É importante otimizar as condições de ensaio, como o tempo de concentração e concentração, lavagem e exposição para obter o melhor sinal para as relações de ruído e também é muito importante lembrar de apagar a placa antes.O procedimento pode ser estendido a condições in vivo para ter uma ideia sobre a ligação composta em um animal vivo que poderia ser útil para projetos de descoberta. Lembre-se de trabalhar em um laboratório com material radioativo completo certificado e usar roupas protetoras ao manusear radioatividade ou paraformaldeído.

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