Name: autoradiography as a simple and powerful method for visualization and characterization of pharmacological targets
Uploaded: 2019-03-12T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Autoradiography as a Simple and Powerful Method for Visualization and Characterization of Pharmacological Targets at JoVE.com

Работа была поддержана Фондом компании «Лундбек» (Грант R133-A12270) и Ново Нордиск Foundation (Grant NNF0C0028664). Авторы благодарят доктор Aleš Marek на поставку лиганд [3H].

Все животные обработка была выполнена в соответствии с руководящими принципами датского инспекции экспериментов животных.
Примечание: Протокол, описанные здесь охватывает Подготовка тканей (т.е., ткани мозга мыши), в пробирке autoradiographic assay достаточно подробно д?...

Качество autoradiographic assay чаще всего определяется чувствительность лиганд. Важным фактором является выбранный радиоизотопных, которая дается путем наличия известных лигандами или осуществимость конкретных методов маркировки приносить лигандов с соответствующей удельной активностью (<e...

Авторадиографии — это метод, который предоставляет изображения радиоактивного распада. Метод обычно используется для изучения распределения ткани протеина интереса в vitro на основе конкретных фармакологических взаимодействия между радиоизотопами соединения и его цель. Это обеспечивает прямую информацию о избирательность лигандом для целевого объекта. Радиоавтографией в пробирке может также использоваться для количественного определения фармакологических привязки параметров radioligands, таких как Константа диссоциации (dK) и плотности сайтов связывания (BМакс), а также для определения Ингибирование константа (iK) конкурирующих лигандов1,2. По сравнению с традиционными огневки лиганд привязки, радиоавтография имеет преимущество возможность визуализировать пространственных анатомии и кратким указанием региональных выражение модели3. Методом авторадиографии является поэтому соответствующие альтернативы immunocytochemistry, особенно в отсутствие проверенных антитела. Авторадиографии легко реализуется в стандартной радиоизотопной лаборатории, при условии наличия подходящего лиганд с необходимые фармакологических специфичность, доступ к микротом криостат для подготовки разделов ткани и подходящих изображений устройство, которое имеет возможность анализа распределения радиоактивности в разделах соответствующие ткани. В частности важным критерием отбора для лиганд является ограниченное количество привязки на сайты, не являющиеся объектом. Это может быть другие белки, мембраны или такие материалы, как пластик или фильтры и коллективно называется неспецифичный привязки. Обычно неспецифичный привязки не конденсаторе, но может быть конденсаторе, если она включает в себя конкретные-целевого белка. Лучший способ проверки истинный конкретной привязки является для сравнения тканей, генетически не хватает целевого объекта, например, инженерии тканей (нокаут)4.
Здесь методология иллюстрируется с autoradiographic характеристика высокоспецифичные связывающие сайта для γ-оксимасляная кислота (ГОМК) в мозге млекопитающих. Понимание фармакологических взаимодействия между ГОМК и его привязки сайта имеет значение как ГОМК снадобье как клинически полезным в лечении нарколепсии и алкоголизма5, но также природных составляющих млекопитающих мозга и отдыха наркотиками6. Высокоспецифичные ГОМК привязки сайтов впервые были описаны с помощью [3H] ГОМК привязки для мозга крысы огневки7. С годами, дальнейших исследований авторадиографии с [3H] ГОМК и аналог [3H] NCS-382 показал высокую плотность привязки сайтов в регионах мозга крысы8,9,10, мыши9 , свинья11и обезьяна/человеческий мозг12. Однако молекулярной идентификации и точное функциональные актуальность этих сайтов связывания остаются недостижимой.
С намерением для дальнейшей характеризации привязки сайтов и для облегчения исследования о физиологической роли ГОМК, были разработаны несколько radioligands включения различных изотопов, наделенных различными сходство ([3H] ГОМК, [3 H] NCS-382, [3H] HOCPCA и [125я] BnOPh-GHB)13,14,,1516(обзор в17) (рис . 1). Сочетание выборочного высокоспецифичные radioligands и ткани очень высокой плотности привязки сайтов, позволили для производства высококачественных изображений с использованием люминофора, изображений техники9,11. Наряду с изложение практических точек в создании эксперимент autoradiographic и иллюстрации иллюстрируют детали в разделе обсуждения особое внимание будет уделяться i) выбор радионуклидов, ii) выбор условий пробирного и iii) использование фосфора визуализации пластины по сравнению с рентгеновской пленки. Общая цель этого документа заключается в том, предоставлять технических, методологических и научных сведений по технике авторадиографии для информирования о распределении ткани и фармакологические анализа белковых мишеней.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Absolute ethanol</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>107017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BAS-TR2040 Imaging Plate</td>
			<td>GE Healthcare Life Science</td>
			<td>28956481</td>
			<td>20x40 cm - Sensitive to tritium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cresyl violet acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5042-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPX (non-aqueous mounting medium for microscopy)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>100579</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O.C.T. Compound, 12 x 125 mL</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td>Tissue-Tek</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>16005-1KG-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-9483</td>
			<td>microscope slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Manual Slide Staining Set</td>
			<td>Sakura Finetek Denmark ApS</td>
			<td>4451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tritium Standard on Glas</td>
			<td>American Radiolabeld Chemicals, Inc.</td>
			<td>ART 0123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene substitute</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5597</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

autoradiography as a simple and powerful method for visualization and characterization of pharmacological targets

В vitro авторадиографии стремится визуализации анатомического распределения протеин интереса в ткани экспериментальных животных, а также людей. Метод основан на конкретной привязки лиганд своей биологической цели. Таким образом замороженные ткани секции инкубируют с решением лиганд, и привязки к целевому впоследствии локализуется путем обнаружения радиоактивного распада, например, с помощью светочувствительной пленки или фосфора изображений пластины. Результате цифровой autoradiograms отображения замечательные пространственного разрешения, который позволяет количественной и локализации лиганд привязки в различных анатомических структур. Кроме того количественная оценка позволяет фармакологическая характеристика сродство лиганда с помощью константы диссоциации (dK), константы ингибирования (Kя), а также плотность сайтов связывания (BМакс) в отдельных тканях. Таким образом метод предоставляет сведения о локализации целевого и лигандом избирательности. Здесь техника проявляется с autoradiographic характеристика высокоспецифичные гамма-оксимасляная кислота (ГОМК) привязки сайтов в ткани мозга млекопитающих, с особым упором на методологические соображения относительно привязки пробирного параметры, выбор лиганд и метод обнаружения.

С помощью описанных протокола, анатомические распределение сайтов связывания ГОМК высокоспецифичные был визуализирован с радиоизотопами ГОМК аналог [3H] HOCPCA в мозг мыши, который был сокращен на корональных, сагиттальной и горизонтальные секции (рис. 3...

Watch this Scientific Journal Video about Autoradiography as a Simple and Powerful Method for Visualization and Characterization of Pharmacological Targets at JoVE.com

Autoradiography as a Simple and Powerful Method for Visualization and Characterization of Pharmacological Targets

Авторадиографии как простой и мощный метод для визуализации и характеристика фармакологического целей

Методом авторадиографии обычно используется для изучения привязки radioligands в разделах ткани для определения качественных или количественных фармакологии.

In vitro autoradiography aims to visualize the anatomical distribution of a protein of interest in tissue from experimental animals as well as humans. The ...

Ауторадиография является мощным и простым методом для изучения распределения белковых связывающих участков в тканях с использованием конкретных радиолиганда для цели. Это также подходящая альтернатива иммуногистохимии. Этот метод визуализирует экспрессию белка с пространственным разрешением с помощью цифровых изображений, что быстрее, чем традиционная экспозиция пленки.Он также может быть использован для фармакологического анализа белковых целей. Метод включает в себя ткани мыши, установленные на стекле, но могут быть распространены на другие виды или даже на клетки, выращенные на обложках. Демонстрация процедуры будет Нан Грем-Крей, аспирант в моей лаборатории.Для начала погрузим ткань в порошкообразный сухой лед, чтобы заморозить его. Перенесите замороженную ткань непосредственно в криостат, который установлен до минус 20 градусов по Цельсию. Пусть ткань акклиматизироваться до минус 20 градусов по Цельсию в криостате в течение 20 минут.Затем накройте держатель ткани встраиванием среды за пределами криостата и быстро поместите образец замороженной ткани в нужную ориентацию, в то время как среда встраивания все еще является жидкой. Передача держателя ткани обратно в криостат и подвергать встраивания среды до температуры ниже минус 10 градусов по Цельсию для затвердевания. Распоить держатель ткани в микротоме криостата.Отрегулируйте ориентацию ткани, чтобы избежать наклонных секций. Вырезать ткани с руководством стереотаксис атласа в разделах желаемой толщины и разворачивать раздел с небольшой кистью, если это необходимо. Оттепель монтирует секцию на слайд микроскопа.Затем последовательно собирать разделы из области, представляющие интерес для желаемого технического повторения. Разрешить разделы на слайдах в воздух сухой в течение одного часа до дальнейшей обработки. В сертифицированной лаборатории радиоактивности используйте карандаш для обозначения слайдов экспериментальными условиями.Поместите слайды горизонтально в пластиковые подносы. Тщательно примените соответствующий объем буфера SA, скорректированного под соответствующую цель, к разделам, установленным на слайдах. Убедитесь, что каждый раздел полностью покрыт.Для определения неспецифической привязки дополните буфер SA соответствующей концентрацией неоцеливого соединения. Затем накройте лотки крышками, чтобы избежать испарения. Предварительно инкубировать при соответствующей температуре в течение 30 минут на тарелке шейкер установлен до 20 об/мин.Затем слейте жидкость перед инкубацией с каждого слайда и перенесите слайды обратно в пластиковый лоток. Немедленно покройте разделы вполне с уместной концентрацией radioligand в буфере SA. Для определения неспецифической обязательной, дополнить радиолиганда решение с соответствующей концентрацией неоцеливого соединения.Накройте лотки крышками и инкубировать в желаемых условиях с постоянной нежной тряской при 20 об/мин. После этого слейте инкубационный раствор и перенесите слайды в стойку слайда микроскопа. Немедленно вымойте горки.Для протокола GHB, мыть дважды с ледяной SA буфер в течение 20 секунд, а затем промыть дважды, окунув слайд стойку в лотки заполнены ледяной дистиллированной воды. Распоистите слайды вертикально в стеллажах и высушите воздух не менее одного часа. Затем перенесите слайды на фиксатор, содержащий параформальдегид для ночной фиксации при комнатной температуре.На следующий день перенесите слайды в коробку с кремнием, содержащую кремнеземный гель при комнатной температуре. Оставьте горки в коробке децикатора на три часа, чтобы устранить влагу. Во-первых, поместите секции в кассету с радиационной экранной пластиной с тканью вверх.Включите радиоактивный микромасштаб в каждую кассету для последующей количественной оценки радиолигандовой привязки. Непосредственно перед использованием загрузите чувствительный к тритию фосфорную пластину в машину для визуализации фосфора и подвергайте ее видимому инфракрасному свету в соответствии с инструкциями производителя по его удалению. Затем снимите пластину с фосфорной визуализации машины и сразу же поместите ее на секции в кассете.Убедитесь, что кассета закрыта полностью. Выставить секции на фосфорную пластину для оптимизированного времени экспозиции при комнатной температуре при защите от света. После экспозиции осторожно откройте кассету в темноте и немедленно перенесите пластину изображения в темную коробку фосфорного изображения.Сканирование пластины в максимально возможном разрешении для получения цифрового изображения. Для начала откройте соответствующую программу анализа изображений. Определите относительную оптическую плотность для каждого стандарта калибровки, выбрав определение региона пункта меню.Выберите инструмент для создания региона и используйте его для выбора области равного размера для каждой точки радиоактивного микромасштаба. Назначьте номер каждой выбранной области, нажав на номер под меткой пункта меню. Нажмите «Экспорт файлов», а затем отчет о 2D-регионе для экспорта значений OD для каждой точки стандарта калибровки.В проприетарном программном обеспечении визуализации используйте инструмент создания региона для выбора области, интересной для каждого раздела, и измерения его ODs, чтобы начать количественную оценку авторадиограмм. Выберите один и тот же регион в каждом разделе, создав шаблон для области интереса и скопировать и настроить его на незначительные изменения в анатомии мозга в каждой авторадиограмме. После этого нажмите Отчет об экспорте файлов 2D-региона для экспорта значений ROD и размеров выбранных областей в электронную таблицу.Определите привязку радиолиганда, изложенную в текстовом протоколе. В этом исследовании анатомическое распределение сайтов связывания GHB высокого сродства визуализируется с помощью радиозапоможенных аналогов GHB радиоактивных HOCPCA в мозге мыши, который был разрезан на корональные, сагиттаальные и горизонтальные секции. Высокие уровни связывания видны в гиппокампе и коре головного мозга, в то время как более низкие уровни связывания видны в стриатуме и не обнаруживается связывание в мозжечках.Как показано здесь, анатомические структуры могут быть визуализированы с использованием различных плоскостей и анатомической целостности может быть поддержана cresyl фиолетовый окрашивания. Репрезентативные авторадиограммы крысы, мыши и свиньи иллюстрируют эволюционное сохранение высоких сродства GHB связывающих участков в мозге млекопитающих. Радиоактивные места связывания HOCPCA обнаружены во всех трех видах, что позволяет сравнивать грубую анатомию мозга между ними.Высокое сродство GHB связывающих сайтов зондов с GHB radioligands, которые отображают различные сходства для связывающих сайтов, но сопоставимые конкретные виды деятельности. Радиоактивная HOCPCA наделена высокой чувствительностью и отличным соотношением сигнала к шуму. Из-за более низкой чувствительности радиоактивных NCS-382, более высокие концентрации радиолиганда должны быть использованы для того, чтобы получить аналогичные уровни связывания.Еще более высокие концентрации радиолиганда необходимы для достижения радиоактивных ПГВ сопоставимых обязательных уровней. Однако более высокие концентрации радиолиганда также повышают уровень неспецифической привязки с последующим более низким соотношением сигнала к шуму. Важно оптимизировать условия анализа, такие как концентрация радиолиганда, стирка и время экспозиции, чтобы получить лучший сигнал к шумовым соотношениям, и это также очень важно помнить, чтобы стереть пластину раньше.Процедура может быть распространена на условия in vivo, чтобы получить представление о соединении связывания в живом животном, которые могут быть полезны для проектов открытия. Не забудьте работать в лаборатории с сертифицированным полноценным радиоактивным материалом и носить защитную одежду при обращении с радиоактивностью или параформалдегидом.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Simple Composite Phenotype Scoring System for Evaluating Mouse Models of Cerebellar Ataxia

Простая сложная система подсчета очков для оценки фенотипа мыши Модели мозжечковая атаксия

We describe a protocol for the rapid and sensitive quantification of disease severity in mouse models of cerebella ataxia. It is derived from previously ...

Novel Apparatus and Method for Drug Reinforcement

Аппарат Роман и метод по борьбе с наркотиками Усиление

Animal models of reinforcement have proven to be useful for understanding the neurobiological mechanisms underlying drug addiction.  Operant drug ...

The Vermicelli and Capellini Handling Tests: Simple quantitative measures of dexterous forepaw function in rats and mice

Вермишель и тесты Capellini Обращение: Простые количественные показатели ловкие функции передней лапы у крыс и мышей

Previous characterizations of rodent eating behavior have revealed that they use coordinated forepaw movements to manipulate food pieces. We have extended ...

Automated Interactive Video Playback for Studies of Animal Communication

Автоматизированная Интерактивная Воспроизведение видео по изучению коммуникации животных

Video playback is a widely-used technique for the controlled manipulation and presentation of visual signals in animal communication. In particular, ...

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Визуализация проприорецепторов в<em&gt; Drosophila</em&gt; Личинки и куколки

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Визуализация и генетических манипуляций дендритов и шипы в мышь коры головного мозга и гиппокамп использования<em&gt; Внутриутробное</em&gt; Электропорация

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development

Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development

Экс внутриутробно электропорации и всего Экспланты полушарии: Простой экспериментальный метод исследования раннего развития коры

Cortical development involves complex interactions between neurons and non-neuronal elements including precursor cells, blood vessels, meninges and ...

A Simple and Inexpensive Method for Determining Cold Sensitivity and Adaptation in Mice

Простой и недорогой метод для определения холодную чувствительность и адаптация в мышах

Cold hypersensitivity is a serious clinical problem, affecting a broad subset of patients and causing significant decreases in quality of life.  The cold ...

Live Imaging of Nicotine Induced Calcium Signaling and Neurotransmitter Release Along Ventral Hippocampal Axons

Живая съемка никотина индуцированной сигнализации кальция и высвобождение нейромедиаторов Наряду вентральной гиппокампа Аксоны

Sustained enhancement of axonal signaling and increased neurotransmitter release by the activation of pre-synaptic nicotinic acetylcholine receptors ...

A Simple Alternative to Stereotactic Injection for Brain Specific Knockdown of miRNA

Простой Альтернатива стереотаксической инъекции для мозга Удельный нокдаун микроРНК

MicroRNAs (miRNAs) are key regulators of gene expression.  In the brain, vital processes like neurodevelopment and neuronal functions depend on the ...