Name: autoradiography as a simple and powerful method for visualization and characterization of pharmacological targets
Uploaded: 2019-03-12T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Autoradiography as a Simple and Powerful Method for Visualization and Characterization of Pharmacological Targets at JoVE.com

Arbetet stöds av stiftelsen Lundbeck (Grant R133-A12270) och Novo Nordisk Foundation (Grant NNF0C0028664). Författarna tackar Dr. Aleš Marek för leverans av [3H] radioligand.

Alla djurhantering utfördes i enlighet med riktlinjerna från den danska djur experiment inspektorat.
Obs: Det protokollet som beskrivs här omfattar vävnad förberedelse (dvsmus hjärnvävnad), in vitro- den autoradiografiska analysen i tillräcklig detalj för att ställa in metoden i ett nytt labb, exponering för fosfor imaging plattor som efterföljande Densitometrisk analys av autoradiograms (figur 2) med syftet att lokalisera och kvantif...

Kvaliteten på en den autoradiografiska assay bestäms oftast av känsligheten hos radioligand. En viktig bidragande faktor är den valda radioisotop, som ges av tillgången till kända ligander eller av genomförbarheten av specifika märkning tekniker ge ligander med lämplig specifik aktivitet (dvs, det mängden radioaktivitet per enhet mol av en radioligand)23och med begränsade mängder kemisk nedbrytning. Ett stort antal radioligands av kända ligander är märkta med tritium<sup cl...

Autoradiografi är en metod som ger bilder av radioaktivt sönderfall. Tekniken används rutinmässigt för att studera vävnad fördelningen av ett protein med intresse i vitro som baserat på en specifik farmakologisk interaktion mellan en radioaktivt märkt substans och dess mål. Detta ger direkt information om selektivitet av liganden för målet. In vitro autoradiografi kan också användas för kvantitativ bestämning av farmakologiska bindande parametrar för radioligands, såsom dissociationskonstant (Kd) och täthet av bindningsställen (Bmax), samt för att fastställa den hämning konstanten (Ki) konkurrerande ligander1,2. Jämfört med traditionella Homogenatet radioligand bindande, har autoradiografi fördelen av att kunna visualisera rumsliga anatomi och ge kortfattad information om regionala uttryck mönster3. Metoden för autoradiografi är därför ett relevant alternativ till immuncytokemi, särskilt i avsaknad av en validerad antikropp. Autoradiografi genomförs enkelt i en standard radioisotop laboratorium ges tillgång till en lämplig radioligand med krävs farmakologisk specificitet, tillgång till en mikrotom kryostat för att förbereda vävnadssnitt och en lämplig imaging enhet som kan analysera fördelningen av radioaktivitet i avsnitten respektive vävnad. Noterbart är ett viktigt urvalskriterium för radioligand en begränsad mängd bindning till icke-målorganismer platser. Detta kan vara att andra proteiner, membran eller material som plast eller filter, och benämns kollektivt som icke-specifik bindning. Vanligtvis, icke-specifik bindning är ej mättnadsbar men kan vara mättnadsbar om det innebär ett särskilt protein som off-target. Det bästa sättet för att validera sant specifik bindning är att jämföra med vävnader saknar målet, t.ex., genetiskt modifierade (knock-out) vävnad4.
Här, illustreras metoden som med den autoradiografiska karakterisering av hög affinitet bindningsstället för γ-verkan syra (GHB) i däggdjur hjärnan. Förstå farmakologiska samspelet mellan GHB och dess bindningsställe är relevant eftersom GHB är både en kliniskt användbar drog i behandling av narkolepsi och alkoholism5, men också en naturlig beståndsdel i däggdjur hjärnan och ett fritids drog6. Hög affinitet GHB bindningsställen beskrevs först använda [3H] GHB bindning till råtta hjärnan Homogenatet7. Med åren ytterligare autoradiografi studier med [3H] GHB och analogt [3H] NCS-382 har visat en hög täthet av bindningsställen i framhjärnan regioner av råtta8,9,10, mus9 , gris11och apa/mänskliga hjärnan12. Molekylär identitet och exakta funktionell betydelse av dessa bindande platser har dock förblivit svårfångad.
Med avsikten att ytterligare karakterisera de bindande platserna och för att underlätta studier om de fysiologiska roll GHB, flera radioligands införliva olika isotoper begåvad med olika tillhörighet har utvecklats ([3H] GHB, [3 H] NCS-382, [3H] HOCPCA och [125jag] BnOPh-GHB)13,14,15,16(ses i17) (figur 1). Kombinationen av selektiv hög affinitet radioligands och en mycket hög täthet av bindningen platser har tillåtit för produktion av högkvalitativa bilder med hjälp av den fosfor som imaging teknik9,11. Tillsammans med en disposition av de praktiska punkterna att inrätta ett den autoradiografiska experiment och en illustration att exemplifiera detaljer, kommer att diskussionsavsnittet betona i) valet av radionuklid, ii) Val av assay villkor och iii) användningen av fosfor Imaging plattor kontra röntgenfilm. Det övergripande målet med detta dokument är att tillhandahålla vetenskapliga, tekniska och metodologiska detaljer på autoradiografi tekniken för att informera om vävnadsdistribution och farmakologiska analyser av protein mål.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Absolute ethanol</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>107017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BAS-TR2040 Imaging Plate</td>
			<td>GE Healthcare Life Science</td>
			<td>28956481</td>
			<td>20x40 cm - Sensitive to tritium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cresyl violet acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5042-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPX (non-aqueous mounting medium for microscopy)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>100579</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O.C.T. Compound, 12 x 125 mL</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td>Tissue-Tek</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>16005-1KG-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-9483</td>
			<td>microscope slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Manual Slide Staining Set</td>
			<td>Sakura Finetek Denmark ApS</td>
			<td>4451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tritium Standard on Glas</td>
			<td>American Radiolabeld Chemicals, Inc.</td>
			<td>ART 0123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene substitute</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5597</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

autoradiography as a simple and powerful method for visualization and characterization of pharmacological targets

In vitro autoradiografi syftar till att visualisera anatomiska fördelningen av ett protein av intresse i vävnad från experimentella djur liksom människor. Metoden bygger på den specifika bindningen av en radioligand till sitt biologiska mål. Därför frysta vävnadssnitt inkuberas med radioligand lösning och bindningen till målet är därefter lokaliserade genom påvisande av radioaktivt sönderfall, exempelvis med hjälp av ljuskänsliga filmen eller fosfor imaging plattor. Resulterande digital autoradiograms Visa anmärkningsvärda rumsliga upplösningen, vilket möjliggör kvantifiering och lokalisering av radioligand bindning i skilda anatomiska strukturer. Dessutom tillåter kvantifiering för farmakologiska karakterisering av liganden affinitet med hjälp av dissociation konstanter (Kd), hämning konstanter (Kjag) samt tätheten av bindningsställen (Bmax) i valda vävnader. Metoden ger alltså information om både målet lokalisering och ligand selektivitet. Här exemplifieras tekniken med den autoradiografiska karakterisering av hög affinitet γ-verkan syra (GHB) bindande platser i däggdjur hjärnvävnad, med särskild tonvikt på metodologiska överväganden angående bindande analysen parametrar, valet av radioligand och identifieringsmetoden.

Genom att använda protokollet beskrivs, anatomiska fördelningen av de hög affinitet GHB bindningsställen var visualiseras med radioaktivt märkt GHB analoga [3H] HOCPCA i mus hjärnan, som var skuren i koronalt, sagittal och horisontella sektioner (figur 3 ). Höga nivåer av bindande observerades i hippocampus och hjärnbarken, lägre i striatum och ingen bindning identifierades i lillhjärnan, motsvarande tidigare rapporterade uttrycksmönste...

Watch this Scientific Journal Video about Autoradiography as a Simple and Powerful Method for Visualization and Characterization of Pharmacological Targets at JoVE.com

Autoradiography as a Simple and Powerful Method for Visualization and Characterization of Pharmacological Targets

Autoradiografi som en enkel och kraftfull metod för visualisering och karakterisering av farmakologiska mål

Metoden för autoradiografi används rutinmässigt för att studera bindning av radioligands till vävnadssnitt för bestämning av kvalitativa eller kvantitativa farmakologi.

In vitro autoradiography aims to visualize the anatomical distribution of a protein of interest in tissue from experimental animals as well as humans. The ...

Autoradiografi är en kraftfull och enkel teknik för att studera distribution av proteinbindningsställen i vävnader med hjälp av specifik radioligand för målet. Det är också lämpligt alternativ till immunhistokemi. Denna teknik visualiserar proteinuttryck med rumslig upplösning via digitala bilder vilket är snabbare än traditionell filmexponering.Det kan också användas för farmakologisk analys av proteinmål. Metoden omfattar musvävnader monterade på glas men kan utvidgas till andra arter eller till och med till celler som odlas på täcken. Demonstrera förfarandet kommer att vara av Nane Griem-Krey, en doktorand i mitt laboratorium.Till att börja, dränka vävnaden i pulveriserad torris för att knäppa frysa den. Överför den frysta vävnaden direkt till en kryostat som är inställd på minus 20 grader Celsius. Låt vävnaden acklimatisera sig till minus 20 grader Celsius i kryostaten i 20 minuter.Täck sedan vävnadshållaren med inbäddningsmedium utanför kryostaten och placera snabbt det frusna vävnadsprovet i önskad orientering medan inbäddningsmediet fortfarande är flytande. Överför tillbaka vävnadshållaren till kryostaten och exponera inbäddningsmediet till temperaturer under minus 10 grader Celsius för härdning. Placera vävnadshållaren i kryostatens mikrotom.Justera vävnadens orientering för att undvika sluttande sektioner. Skär vävnaden med ledning av en stereotaxisk atlas i sektioner av önskad tjocklek och veckla ut sektionen med en liten borste om det behövs. Tina montera avsnittet på ett mikroskop bild.Samla sedan i ordningstal sektionerna från den region som är av intresse för den önskade tekniska upprepningen. Låt avsnitten på objektglasen lufttorka i en timme innan de hanteringen av detta. I ett certifierat radioaktivitetslaboratorium använder du en penna för att märka bilderna med de experimentella förhållandena.Placera objektglasen horisontellt i plastbrickor. Applicera noggrant en lämplig volym sa-buffert justerad till målet i fråga på de sektioner som är monterade på objektglasen. Kontrollera att varje avsnitt är helt täckt.För bestämning av icke-specifik bindning, komplettera SA buffert med en relevant koncentration av omärkta förening. Täck sedan brickorna med lock för att undvika avdunstning. Förinkubera vid en relevant temperatur i 30 minuter på en tallriksskak som är inställd på 20 varv/min.Därefter häller du av förinkubationsvätskan från varje objektglas och överför glidbanorna tillbaka till plastbrickan. Täck omedelbart över avsnitten helt med den relevanta koncentrationen av radioligand i SA-buffert. För bestämning av icke-specifik bindning, komplettera radioligand lösning med en relevant koncentration av omärkta förening.Täck brickorna med lock och inkubera under de önskade förhållandena med konstant skonsam skakning vid 20 rpm. Efter detta häller du av inkubationslösningen och överför objektglasen till ett mikroskopglasställ. Tvätta genast objektglasen.För GHB-protokollet, tvätta två gånger med iskall SA buffert i 20 sekunder och skölj sedan två gånger genom att doppa glidstället i brickor fyllda med iskallt destillerat vatten. Placera objektglasen vertikalt i ställningar och lufttorka i minst en timme. Överför sedan objektglasen till en fixator som innehåller paraformaldehyd för övernattfixering vid rumstemperatur.Nästa dag överför du objektglasen till en exsiccatorlåda som innehåller kiselgel i rumstemperatur. Låt objektglasen vara kvar i exsiccator-lådan i tre timmar för att eliminera fukt. Först, placera sektionerna i en strålning skärmad avbildning tallrik kassett med vävnaden uppåt.Inkludera en radioaktiv mikroskala i varje kassett för efterföljande kvantifiering av radioligandbindning. Omedelbart före användning, ladda den tritiumkänsliga fosforavbildningsplattan i fosforavbildningsmaskinen och utsätt den för synligt infrarött ljus enligt tillverkarens anvisningar för att radera den. Ta sedan bort bildplattan från fosforbildningsmaskinen och placera den omedelbart på sektionerna i kassetten.Se till att kassetten är helt stängd. Exponera sektionerna för fosforavbildningsplattan för den optimerade exponeringstiden i rumstemperatur medan den är avskärmad från ljus. Efter exponeringen ska kassetten i mörker försiktigt öppnas och bildplattan omedelbart överföras in i den mörka lådan på en fosforbildare.Skanna plattan med högsta möjliga upplösning för att få en digital bild. Börja, öppna ett lämpligt bildanalysprogram. Bestäm de relativa optiska tätheterna för varje kalibreringsstandard genom att välja fastställelse av menyalternativet region.Välj verktyget för att skapa regionen och använd det för att välja ett område med lika stor storlek för varje punkt i den radioaktiva mikroskalan. Tilldela varje valt område ett nummer genom att klicka på tal under menyalternativets etikett. Klicka på Filexport och sedan 2D-regionrapport om du vill exportera OD-värdena för varje punkt i kalibreringsstandarden.I den egenutvecklade bildhanteringsprogram, använd en region skapande verktyg för att välja den region av intresse i varje avsnitt och mäta dess ODs att börja utföra kvantifiering av autoradiograms. Välj samma region i varje avsnitt genom att skapa en mall för regionen av intresse och kopiera och justera den till mindre variationer i hjärnans anatomi i varje autoradiogram. Efter detta klickar du på 2D-regionrapport för filexport för att exportera DE ROD-värden och storlekar för valda områden till ett kalkylblad.Bestäm radioligandens bindning enligt textprotokollets kontur. I denna studie visualiseras den anatomiska fördelningen av den höga affinitet GHB bindningsställena med radiolabeled GHB analoga radioaktiva HOCPCA i en mus hjärna som skars i koronal, sagittal och horisontella sektioner. Höga nivåer av bindning ses i hippocampus och cortex medan lägre bindningsnivåer ses i striatum och ingen bindning upptäcks i lillhjärnan.Som framgår här, kan de anatomiska strukturerna visualiseras med hjälp av olika plan och anatomiska integritet kan stödjas av cresyl violett färgning. Representativa autoradiograms av en råtta, en mus och en gris illustrerar det evolutionära bevarandet av de höga affinitets-GHB-bindningsställena i däggdjurshjärnan. Radioaktiva HOCPCA bindningsställen upptäcks i alla tre arter som möjliggör jämförelse av brutto hjärnans anatomi mellan dem.Den höga affinitet GHB bindande platser är sonderade med GHB radioligands som visar olika affiniteter för de bindande platser men jämförbara specifika aktiviteter. Radioaktivt HOCPCA är begåvat med hög känslighet och utmärkt signal/brusförhållande. På grund av den lägre känsligheten hos radioaktiv NCS-382 måste högre radioligandkoncentrationer användas för att man ska få liknande bindningsnivåer.Ännu högre radioligandkoncentrationer är nödvändiga för att radioaktiv GHB ska kunna uppnå jämförbara bindningsnivåer. Högre radioligandkoncentrationer ökar dock också nivån på den icke-specifika bindningen med en följaktligen lägre signal-bruskvot. Det är viktigt att optimera analysen villkor som radioligand koncentration, tvätt och exponeringstid för att få bästa signal till brus nyckeltal och det är också mycket viktigt att komma ihåg att radera plattan innan.Förfarandet kan utvidgas till in vivo villkor för att få en uppfattning om sammansatta bindning i ett levande djur som kan vara användbara för upptäckt projekt. Kom ihåg att arbeta i ett laboratorium med certifierat fullt radioaktivt material och att bära skyddskläder vid hantering av radioaktivitet eller paraformaldehyd.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Simple Composite Phenotype Scoring System for Evaluating Mouse Models of Cerebellar Ataxia

En enkel komposit Fenotyp Scoring System för utvärdering musmodeller av cerebellär ataxi

We describe a protocol for the rapid and sensitive quantification of disease severity in mouse models of cerebella ataxia. It is derived from previously ...

Novel Apparatus and Method for Drug Reinforcement

Nya Apparat och metod för narkotikakontroll Förstärkning

Animal models of reinforcement have proven to be useful for understanding the neurobiological mechanisms underlying drug addiction.  Operant drug ...

The Vermicelli and Capellini Handling Tests: Simple quantitative measures of dexterous forepaw function in rats and mice

Den spån och Capellini Tester Hantering: Enkel kvantitativa mått på händiga framtassarna funktionen hos råttor och möss

Previous characterizations of rodent eating behavior have revealed that they use coordinated forepaw movements to manipulate food pieces. We have extended ...

Automated Interactive Video Playback for Studies of Animal Communication

Automatisk Interaktiv Videouppspelning för studier av djurkommunikation

Video playback is a widely-used technique for the controlled manipulation and presentation of visual signals in animal communication. In particular, ...

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Visualisering av proprioceptorer i<em&gt; Drosophila</em&gt; Larver och puppor

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Visualisering och Genetic Manipulation av dendriter och ryggar i mus hjärnbarken och hippocampus med användning av<em&gt; I utero</em&gt; Elektroporering

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development

Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development

Ex utero Elektroporation och Hela Explantat Hemisphere: En enkel Experimentell metod för studier av tidig kortikal utveckling

Cortical development involves complex interactions between neurons and non-neuronal elements including precursor cells, blood vessels, meninges and ...

A Simple and Inexpensive Method for Determining Cold Sensitivity and Adaptation in Mice

En enkel och billig metod för bestämning Cold Känslighet och anpassning hos möss

Cold hypersensitivity is a serious clinical problem, affecting a broad subset of patients and causing significant decreases in quality of life.  The cold ...

Live Imaging of Nicotine Induced Calcium Signaling and Neurotransmitter Release Along Ventral Hippocampal Axons

Live avbildning av nikotin inducerad kalciumsignalering och frisättning av signalsubstans Längs Ventral Hippocampus Axoner

Sustained enhancement of axonal signaling and increased neurotransmitter release by the activation of pre-synaptic nicotinic acetylcholine receptors ...

A Simple Alternative to Stereotactic Injection for Brain Specific Knockdown of miRNA

Ett enkelt alternativ till stereotaktisk injektion för Brain Specifik Knockdown av miRNA

MicroRNAs (miRNAs) are key regulators of gene expression.  In the brain, vital processes like neurodevelopment and neuronal functions depend on the ...