Name: autoradiography as a simple and powerful method for visualization and characterization of pharmacological targets
Uploaded: 2019-03-12T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Autoradiography as a Simple and Powerful Method for Visualization and Characterization of Pharmacological Targets at JoVE.com

İş Lundbeck Vakfı (Grant R133-A12270) ve Novo Nordisk Vakfı (Grant NNF0C0028664) tarafından desteklenmiştir. Yazarlar Dr Aleš Marek [3H] radioligand temini için teşekkür ederiz.

Tüm hayvan işleme Danimarka hayvan deney Müfettişliği yönergelere uygun olarak gerçekleştirildi.
Not: Burada açıklanan protokol doku hazırlık (Yani, fare beyin dokusu), vitro autoradiographic tahlil kurma yöntemi yeni bir laboratuvarda, tabak Imaging fosfor maruz için yeterli ayrıntılı kapsar yanı sıra autoradiograms (Şekil 2) sonraki densitometric analizi Yerelleştirme ve farklı anatomik yapıları bağlamasında radioligan...

Autoradiographic bir tahlil kalitesini en sık radioligand duyarlılık tarafından belirlenir. Bilinen ligandlar kullanılabilirliğini veya özel etiketleme teknikler fizibilite ligandlar uygun belirli aktivite ile (Yani, radyoaktivite miktarı verim verilir seçili Radyoizotop önemli bir faktör olduğunu bir radioligand birimi mol) başına23ve sınırlı miktarda kimyasal bozulması. Çok sayıda bilinen ligandlar radioligands hangi çeşitli yararları infers trityum<sup class="xre...

Autoradiography radyoaktif bozunma görüntüleri sağlayan bir yöntemdir. Tekniği rutin bir protein radiolabelled bir bileşik ve hedefine arasında belirli bir farmakolojik etkileşim temel faiz vitro doku dağılımı incelemek için kullanılır. Bu hedef için ligand selectivity hakkında doğrudan bilgi sağlar. Vitro autoradiography de radioligands, bağlayıcı siteleri (Bmax), yoğunluğu ve ayrışma sabiti (Kd) gibi parametrelerin farmakolojik bağlama kantitatif tayin yanı sıra belirlemek için kullanılabilir rakip ligandlar1,2inhibisyon sabiti (Ki). Geleneksel homogenate radioligand bağlama için karşılaştırıldığında, autoradiography kayma anatomi görselleştirmek için güçlü olmak ve bölgesel ifade kalıpları3özlü ayrıntılarını veren avantajına sahiptir. Autoradiography yöntemi bu nedenle özellikle doğrulanmış bir antikor yokluğunda immunocytochemistry ilgili bir alternatiftir. Autoradiography kolayca uygun bir radioligand durumu ile gerekli farmakolojik özgüllüğü, doku bölümleri ve uygun bir görüntüleme hazırlanması için bir microtome cryostat erişim verilen bir standart Radyoizotop laboratuvar uygulanır radyoaktivite kendi doku bölümlerde dağıtım analiz yapabiliyor aygıt. Özellikle, bir önemli seçim radioligand için sınırlı bağlama hedef olmayan sitelere bir kriterdir. Bu diğer proteinler, membran veya plastik veya filtreler gibi maddeler olabilir ve toplu non-spesifik bağlama olarak anılacaktır. Genellikle, non-spesifik bağlama saturable olmayan ama belirli bir hedef kapalı protein içeriyorsa saturable olabilir. Doğru belirli bağlama doğrulama için en iyi yolu (knock-out) doku4hedef örneğin, genetik olarak eksik dokuların karşılaştırmak için tasarlanmış olduğunu.
Burada, metodoloji γ-hidroksibütrik asit (GHB) memeli beyinde yüksek afinite bağlama sitesine autoradiographic karakterizasyonu gösterilmektedir. GHB hem klinik olarak yararlı bir ilaç tedavisi Narkolepsi ve alkolizm5, aynı zamanda doğal bir kurucu memeli beyin ve bir eğlence olduğu gibi farmakolojik etkileşim GHB ve bağlama sitesi arasında alaka en önemli noktadır uyuşturucu6. Yüksek-benzeşme GHB bağlayıcı siteleri ilk [3H] GHB bağlama sıçan beyin homogenate7kullanarak açıklanan. Yıllar içinde autoradiography çalışmaları [3H] ile daha fazla GHB ve analog [3H] NCS-382 siteler fare8,9,10, fare9 ön bölgelerinde bağlama yüksek yoğunluklu gösterdi ,11ve maymun/insan beyin12domuz. Ancak, bu bağlama sitelerin tam işlevsel alaka ve moleküler kimlik zor kalmıştır.
Daha fazla bağlayıcı siteleri niteleyen ve GHB fizyolojik rolü üzerinde çalışmalar kolaylaştırmak için niyeti ile birden çok radioligands farklı benzeşim ile donatılmış farklı izotoplar birleşmeyle geliştirilmiştir ([3H] GHB, [3 H] NCS-382, [3H] HOCPCA ve [125ben] BnOPh-GHB)13,14,15,16(17' gözden) (şekil 1). Siteleri görüntüleme tekniği9,11fosfor kullanarak yüksek kaliteli görüntüleri üretimi için izin bağlama çok yüksek doku yoğunluğu ve seçmeli yüksek benzeşme radioligands birleşimi. Autoradiographic deney ve bir örnek ayrıntıları örneklemek için ayarlama içinde pratik noktaları bir taslağını ile birlikte, i) radyonüklid seçimi, ii) tahlil koşullar seçimi ve III) fosfor kullanımı tartışma bölümünde vurgulamak olacaktır Röntgen film karşı plakaları görüntüleme. Bu yazıda genel amacı autoradiography tekniğine doku dağıtım ve protein hedeflerin farmakolojik analizleri hakkında bilgilendirmek için teknik, metodolojik, bilimsel bilgileri sağlamaktır.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Absolute ethanol</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>107017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BAS-TR2040 Imaging Plate</td>
			<td>GE Healthcare Life Science</td>
			<td>28956481</td>
			<td>20x40 cm - Sensitive to tritium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cresyl violet acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5042-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPX (non-aqueous mounting medium for microscopy)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>100579</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O.C.T. Compound, 12 x 125 mL</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td>Tissue-Tek</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>16005-1KG-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-9483</td>
			<td>microscope slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Manual Slide Staining Set</td>
			<td>Sakura Finetek Denmark ApS</td>
			<td>4451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tritium Standard on Glas</td>
			<td>American Radiolabeld Chemicals, Inc.</td>
			<td>ART 0123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene substitute</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5597</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

autoradiography as a simple and powerful method for visualization and characterization of pharmacological targets

Vitro autoradiography deneysel hayvan hem de insan dokudan ilgi bir proteinin anatomik dağılımını görselleştirmenizi amaçlamaktadır. Bu yöntem bir radioligand biyolojik hedefine için belirli bağlama üzerinde dayanır. Bu nedenle, donmuş doku bölümleri radioligand çözüm ile inkübe ve bağlama hedef için daha sonra radyoaktif bozunma, algılama tarafından Örneğin, ışığa duyarlı film ya da fosfor plakaları Imaging kullanarak yerelleştirilmiştir. Elde edilen dijital autoradiograms miktar ve yerelleştirme radioligand bağlama farklı anatomik yapılar sağlar olağanüstü Uzaysal çözünürlük görüntüler. Ayrıca, miktar ligand afinite farmakolojik karakterizasyonu için ayrılma sabitleri (Kd), inhibisyon sabitleri (Kben) yanı sıra bağlayıcı siteleri (Bmax) seçili dokularda yoğunluğu aracılığıyla izin verir. Böylece, belgili tanımlık yöntem hedef Yerelleştirme ve ligand seçicilik hakkında bilgi sağlar. Burada, teknik autoradiographic karakterizasyonu siteleri bağlama tahlil ile ilgili metodolojik konuları üzerinde durularak memeli beyin dokusu içinde bağlama yüksek afinite γ-hidroksibütrik asit (GHB) örneği Parametreler, radioligand ve algılama yöntemi seçimi.

Açıklanan iletişim kuralını kullanarak, yüksek-benzeşme GHB bağlayıcı siteleri anatomik dağıtımını radiolabelled GHB analog [3H] ile görüntülenmiştir koronal, sagittal ve yatay bölüme (şekil 3 kesildi fare beynindeki HOCPCA ). Yüksek yüzey-in bağlama Hipokampus ve korteks gözlendi, alt striatum bağlamasında ve hiçbir bağlama beyincik içinde yüksek-benzeşme GHB siteleri9,<sup class=...

Watch this Scientific Journal Video about Autoradiography as a Simple and Powerful Method for Visualization and Characterization of Pharmacological Targets at JoVE.com

Autoradiography as a Simple and Powerful Method for Visualization and Characterization of Pharmacological Targets

Görselleştirme ve farmakolojik hedefleri karakterizasyonu için basit ve güçlü yöntemi olarak autoradiography

Autoradiography yöntemi radioligands doku bölümlerine bağlama nitel veya nicel Farmakoloji belirlenmesi için incelemek için düzenli olarak kullanılır.

In vitro autoradiography aims to visualize the anatomical distribution of a protein of interest in tissue from experimental animals as well as humans. The ...

Otoradyografi, spesifik radyoligand kullanarak dokularda protein bağlayıcı bölgelerin dağılımını inceleyen güçlü ve basit bir tekniktir. Ayrıca immünohistokimyaya da uygun bir alternatif. Bu teknik, geleneksel film pozlama daha hızlı dijital görüntüler ile mekansal çözünürlük ile protein ifade görselleştirir.Ayrıca protein hedeflerinin farmakolojik analizi için de kullanılabilir. Bu yöntem, cam üzerine monte edilmiş fare dokularını içerir, ancak diğer türlere, hatta kapaklarda yetişen hücrelere de uzatılabilir. Prosedürü göstermek Nane Griem-Krey, benim laboratuvarda bir doktora öğrencisi tarafından olacaktır.Başlamak için, onu dondurmak için toz kuru buz doku batırın. Donmuş dokuyu doğrudan eksi 20 santigrat dereceye ayarlanmış bir kriyostata aktarın. Doku eksi 20 santigrat derece ye 20 dakika kriyostat alışmak sağlar.Daha sonra doku tutucuyu kriyostat dışında katıştırma ortamı ile kapatın ve gömme ortamı hala sıvıyken dondurulmuş doku örneğini hızlı bir şekilde istenilen yönde yerleştirin. Doku tutucuyu kriyostat'a geri aktarın ve katıştırma ortamını sertleşme için eksi 10 santigrat derecenin altındaki sıcaklıklara maruz bırakın. Doku tutucuyu kriyostat mikrotomuna yerleştirin.Eğimli kesitlerden kaçınmak için dokunun yönünü ayarlayın. İstenilen kalınlıkta bölümlerde stereotaksik bir atlas ın rehberliğinde dokuyu kesin ve gerekirse küçük bir fırça ile kesiti açın. Çözülme bölümü mikroskop slayt üzerine monte edin.Daha sonra istenilen teknik tekrar için ilgi bölgesinden bölümleri sırayla toplayın. Slaytlar üzerindeki bölümlerin daha fazla işleme konmadan önce bir saat boyunca kurumasını bekleyin. Sertifikalı bir radyoaktivite laboratuvarında, slaytları deneysel koşullarla etiketlemek için bir kalem kullanın.Slaytları yatay olarak plastik tepsilere yerleştirin. Slaytlara monte edilen bölümlere, söz konusu hedefe ayarlanmış uygun bir SA arabelleği hacmini dikkatlice uygulayın. Her bölümün tamamen kapalı olduğundan emin olun.Spesifik olmayan bağlayıcıbelirlenmesi için, etiketlenmemiş bileşik ilgili bir konsantrasyon ile ek SA tampon. Daha sonra buharlaşmayı önlemek için tepsileri kapaklarla kapatın. 20 rpm olarak ayarlanmış bir plaka shaker üzerinde 30 dakika boyunca ilgili bir sıcaklıkta pre-incubate.Daha sonra, her slayttan kuluçka öncesi sıvıyı dökün ve slaytları plastik tepsiye geri aktarın. Hemen sa tampon radyoligand ilgili konsantrasyon ile tamamen bölümleri kaplayın. Spesifik olmayan bağlayıcıbelirlenmesi için, etiketli olmayan bileşik ilgili bir konsantrasyon ile ek radyoligand çözeltisi.20 rpm sürekli nazik sallayarak istenilen koşullar altında kapaklar ve kuluçka ile tepsiler kapağı. Bundan sonra, kuluçka çözeltisini dökün ve slaytları bir mikroskop slayt rafına aktarın. Hemen slaytları yıkayın.GHB protokolü için, 20 saniye boyunca buz gibi SA tamponuyla iki kez yıkayın ve slayt rafını buz gibi distile su yla dolu tepsilere daldırarak iki kez durulayın. Slaytları raflarda dikey olarak yerleştirin ve en az bir saat kuru havalayın. Daha sonra slaytları oda sıcaklığında gece fiksasyonu için paraformaldehit içeren bir fiksatöre aktarın.Ertesi gün, oda sıcaklığında silika jel içeren bir kurutucu kutusuna slaytlar aktarın. Nemi ortadan kaldırmak için slaytları kurutucu kutuda üç saat bekletin. İlk olarak, doku yukarı bakacak şekilde radyasyon korumalı görüntüleme plaka kasetiçine bölümleri yerleştirin.Radyoligve bağlama sonraki nicelik için her kasetbir radyoaktif mikroölçek ekleyin. Kullanımdan hemen önce trityuma duyarlı fosfor görüntüleme plakasını fosfor görüntüleme makinesine yükleyin ve üreticinin talimatlarına göre görünür kızılötesi ışığa maruz bırakın. Daha sonra görüntüleme plakasını fosfor görüntüleme makinesinden çıkarın ve hemen kasetteki bölümlere yerleştirin.Kasetin tamamen kapalı olduğundan emin olun. Işıktan korunurken oda sıcaklığında optimize edilmiş pozlama süresi için bölümleri fosfor görüntüleme plakasına maruz bırakın. Pozlamadan sonra, karanlıkta kaseti dikkatlice açın ve görüntüleme plakasını hemen fosfor görüntüleyicisinin karanlık kutusuna aktarın.Dijital görüntü elde etmek için plakayı mümkün olan en yüksek çözünürlükte taz.yama. Başlamak için uygun bir görüntü analizi programı açın. Menü öğesi bölge belirlemesini seçerek her kalibrasyon standardı için göreli optik yoğunlukları belirleyin.Bölge oluşturma aracını seçin ve radyoaktif mikro ölçeğin her noktası için eşit boyutta bir alan seçmek için kullanın. Menü öğesi etiketinin altındaki numaraya tıklayarak seçili her alana bir sayı atayın. Kalibrasyon standardının her noktası için OD değerlerini dışa aktarmak için Dosya Dışa Aktarma ve ardından 2B Bölge Raporu'nu tıklatın.Tescilli görüntüleme yazılımında, her bölümdeki ilgi çekici bölgeyi seçmek ve otoradyogramların niceliğini gerçekleştirmeye başlamak için oD'lerini ölçmek için bir bölge oluşturma aracı kullanın. İlgi alanı için bir şablon oluşturarak her bölümde aynı bölgeyi seçin ve kopyalayın ve her otoradyogramdaki beyin anatomisindeki küçük varyasyonlara göre ayarlayın. Bundan sonra, rod değerlerini ve seçili alanların boyutlarını elektronik tabloya aktarmak için Dosya Dışa Aktar 2B Bölge Raporu'nu tıklatın.Metin protokolünde belirtildiği gibi radioligand'ın bağlayıcılığı belirleyin. Bu çalışmada, yüksek afinite GHB bağlama sitelerinin anatomik dağılımı, koronal, sagital ve yatay kesitler halinde kesilmiş bir fare beyninde radyoetiketli GHB analog radyoaktif HOCPCA ile görselleştirilmiştir. Hipokampus ve kortekste yüksek düzeyde bağlama görülürken striatumda daha düşük bağlama düzeyleri görülür ve beyincikte bağlayıcılık saptanmaz.Burada gösterildiği gibi, anatomik yapılar farklı düzlemler kullanılarak görselleştirilebilir ve anatomik bütünlük cresyl menekşe boyama ile desteklenebilir. Bir sıçan, fare ve bir domuzun temsili otoradyogramları memeli beynindeki yüksek yakınlıklı GHB ciltleme alanlarının evrimsel korumasını göstermektedir. Radyoaktif HOCPCA bağlama siteleri aralarında brüt beyin anatomisi karşılaştırma sağlayan her üç tür tespit edilir.Yüksek afinite GHB bağlama siteleri, bağlayıcı sitelere farklı yakınlıklar gösteren ancak benzer özel faaliyetler gösteren GHB radyoligandlarla incelenir. Radyoaktif HOCPCA yüksek hassasiyet ve gürültü oranına mükemmel sinyal ile donatılmıştır. Radyoaktif NCS-382'nin daha düşük hassasiyeti nedeniyle benzer düzeyde bağlama elde etmek için daha yüksek radyoligve konsantrasyonlar kullanılmalıdır.Daha yüksek radyoligand konsantrasyonları radyoaktif GHB karşılaştırılabilir bağlama düzeyleri elde etmek için gereklidir. Ancak, daha yüksek radyoligand konsantrasyonları da gürültü oranı daha düşük bir sinyal ile spesifik olmayan bağlama düzeyini artırmak. Gürültü oranlarına en iyi sinyali almak için radyoligand konsantrasyonu, yıkama ve maruz kalma süresi gibi ar-ge koşullarını optimize etmek önemlidir ve daha önce plakayı silmeyi hatırlamak da çok önemlidir.Prosedür keşif projeleri için yararlı olabilir canlı bir hayvan bileşik bağlama hakkında bir fikir almak için in vivo koşullara uzatılabilir. Sertifikalı tam radyoaktif malzeme ile bir laboratuvarda çalışmayı unutmayın ve radyoaktivite veya paraformaldehit kullanırken koruyucu giysiler giymek.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Simple Composite Phenotype Scoring System for Evaluating Mouse Models of Cerebellar Ataxia

Serebellar Ataksi Fare Modelleri Değerlendirme Basit Kompozit Fenotip Puanlama Sistemi

We describe a protocol for the rapid and sensitive quantification of disease severity in mouse models of cerebella ataxia. It is derived from previously ...

Novel Apparatus and Method for Drug Reinforcement

İlaç Takviye için yeni cihaz ve Yöntem

Animal models of reinforcement have proven to be useful for understanding the neurobiological mechanisms underlying drug addiction.  Operant drug ...

The Vermicelli and Capellini Handling Tests: Simple quantitative measures of dexterous forepaw function in rats and mice

Şehriye ve Capellini İşleme Testleri: sıçan ve fareler hünerli forepaw fonksiyonu Basit kantitatif tedbirler

Previous characterizations of rodent eating behavior have revealed that they use coordinated forepaw movements to manipulate food pieces. We have extended ...

Automated Interactive Video Playback for Studies of Animal Communication

Hayvan İletişim Araştırmaları Otomatik Etkileşimli Video Oynatma

Video playback is a widely-used technique for the controlled manipulation and presentation of visual signals in animal communication. In particular, ...

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Içinde proprioseptörlere Görselleştirmesi<em&gt; Drosophila</em&gt; Larva ve Pupa

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Kullanarak Fare Serebral Korteks ve Hippocampus Görselleştirme ve Dendritler ve Spine Genetik Manipülasyon<em&gt; Utero olarak</em&gt; Elektroporasyon

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development

Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development

Eski utero Elektroporasyon ve Tüm Yarımküre Eksplantlarından: Erken Kortikal Kalkınma Çalışmaları İçin Basit Bir Deney Yöntemi

Cortical development involves complex interactions between neurons and non-neuronal elements including precursor cells, blood vessels, meninges and ...

A Simple and Inexpensive Method for Determining Cold Sensitivity and Adaptation in Mice

Fareler Soğuk Hassasiyeti ve Uyum belirlenmesi için Basit ve ucuz Yöntem

Cold hypersensitivity is a serious clinical problem, affecting a broad subset of patients and causing significant decreases in quality of life.  The cold ...

Live Imaging of Nicotine Induced Calcium Signaling and Neurotransmitter Release Along Ventral Hippocampal Axons

Nikotin Kaynaklı Kalsiyum Sinyali ve ventral Hipokampal Aksonlar boyunca Nörotransmitter Release Canlı Görüntüleme

Sustained enhancement of axonal signaling and increased neurotransmitter release by the activation of pre-synaptic nicotinic acetylcholine receptors ...

A Simple Alternative to Stereotactic Injection for Brain Specific Knockdown of miRNA

MiRNA Beyin Özgül demonte için Stereotaktik Injection Basit Alternatif

MicroRNAs (miRNAs) are key regulators of gene expression.  In the brain, vital processes like neurodevelopment and neuronal functions depend on the ...