Name: colletotrichum fioriniae development in water and chloroform-based blueberry and cranberry floral extracts
Uploaded: 2019-04-12T14:00:00
Duration: 12 min 32 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Colletotrichum fioriniae Development in Water and Chloroform-based Blueberry and Cranberry Floral Extracts at JoVE.com

Vi takke William S. Haines, Sr. begavet Cranberry Research Fund og New Jersey blåbær og tranebær forskning Rådet, Inc. for støtte. Vi takker også Jennifer Vaiciunas (vejledning og floral præparater), Christine Constantelos (svampe kultur og floral præparater), David Jones (floral præparater og udtræk), Langley Oudemans (floral præparater, filme/fotografering), Jesse Lynch (floral præparater), Roxanne Tumnalis (generel support), og mange studerende/sommer praktikanter.

<ol>
	<li>Pszcz&#243;&#322;kowska, A., Okorski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+report+of+anthracnose+disease+caused+by+Colletotrichum+fioriniae+on+blueberry+in+western+Poland.">First report of anthracnose disease caused by Colletotrichum fioriniae on blueberry in western Poland.</a> Plant Disease. 100, 2167 (2016).</li><li>Oudemans, P. V., Caruso, F. L., Stretch, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cranberry+fruit+rot+in+the+northeast:+a+complex+disease.">Cranberry fruit rot in the northeast: a complex disease.</a> Plant Disease. 82, 1176-1184 (1998).</li><li>Damm, U., Cannon, P. F., Woudenberg, J. H. C., Crous, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Colletotrichum+acutatum+species+complex.">The Colletotrichum acutatum species complex.</a> Studies in Mycology. 73, 37-113 (2012).</li><li>Marcelino, J., Giordano, R., Gouli, S., Gouli, V., Parker, B. L., Skinner, M., TeBeest, D., Cesnik, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colletotrichum+acutatum+var.+fioriniae+(teleomorph:+Glomerella+acutata+var.+flioriniae+var.+nov.)+infection+of+a+scale+insect.">Colletotrichum acutatum var. fioriniae (teleomorph: Glomerella acutata var. flioriniae var. nov.) infection of a scale insect.</a> Mycologia. 100, 353-374 (2008).</li><li>Pennycook, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colletotrichum+fioriniae+comb.+&amp;+stat.+nov.,+resolving+a+nomenclatural+muddle.">Colletotrichum fioriniae comb. &amp; stat. nov., resolving a nomenclatural muddle.</a> Mycotaxon. 132, 149-154 (2017).</li><li>Shivas, R. G., Tan, Y. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+taxonomic+re-assessment+of+Colletotrichum+acutatum,+introducing+C.+fioriniae+comb.+et+stat.+nov+and+C.+simmondsii+sp+nov.">A taxonomic re-assessment of Colletotrichum acutatum, introducing C. fioriniae comb. et stat. nov and C. simmondsii sp nov.</a> Fungal Diversity. 39, 111-122 (2009).</li><li>Wharton, P. S., Di&#233;guez-Uribeondo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+of+Colletotrichum+acutatum.">The biology of Colletotrichum acutatum.</a> Anales del Jard&#237;n Bot&#225;nico de Madrid. 61, 3-22 (2004).</li><li>Prusky, D., Alkan, N., Mengiste, T., Fluhr, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quiescent+and+necrotrophic+lifestyle+choice+during+postharvest+disease+development.">Quiescent and necrotrophic lifestyle choice during postharvest disease development.</a> Annual Review of Phytopathology. 51, 155-176 (2013).</li><li>Milholland, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Compendium of Blueberry and Cranberry Diseases. , (1995).</li><li>DeMarsay, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Anthracnose fruit rot of highbush blueberry: biology and epidemiology. , (2005).</li><li>Madden, L. V., Yang, X. S., Wilson, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+rain+intensity+on+splash+dispersal+of+Colletotrichum+acutatum.">Effects of rain intensity on splash dispersal of Colletotrichum acutatum.</a> Phytopathology. 86, 864-874 (1996).</li><li>Yang, X., Madden, L. V., Wilson, L. L., Ellis, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+surface-topography+and+rain+intensity+on+splash+dispersal+of+Colletotrichum+acutatum.">Effects of surface-topography and rain intensity on splash dispersal of Colletotrichum acutatum.</a> Phytopathology. 80, 1115-1120 (1990).</li><li>Wharton, P. S., Dickman, J. S., Schilder, A. M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Timing+of+spore+release+by+Colletotrichum+acutatum+in+Michigan+blueberry+fields.">Timing of spore release by Colletotrichum acutatum in Michigan blueberry fields.</a> Phytopathology. 92, 86 (2002).</li><li>MacKenzie, S. J., Peres, N. A., Timmer, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colonization+of+citrus+leaves+and+secondary+conidiation+response+to+citrus+flower+extracts+by+non-postbloom+fruit+drop+strains+of+Colletotrichum+acutatum.">Colonization of citrus leaves and secondary conidiation response to citrus flower extracts by non-postbloom fruit drop strains of Colletotrichum acutatum.</a> Tropical Plant Pathology. 35, 333-342 (2010).</li><li>Leandro, L. F. S., Gleason, M. L., Nutter, F. W., Wegulo, S. N., Dixon, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strawberry+plant+extracts+stimulate+secondary+conidiation+by+Colletotrichum+acutatum+on+symptomless+leaves.">Strawberry plant extracts stimulate secondary conidiation by Colletotrichum acutatum on symptomless leaves.</a> Phytopathology. 93, 1285-1291 (2003).</li><li>Waller, T. J., Vaiciunas, J., Constantelos, C., Oudemans, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+the+blueberry+floral+extracts+influence+secondary+conidiation+and+appressorial+formation+of+Colletotrichum+fioriniae.">Evidence the blueberry floral extracts influence secondary conidiation and appressorial formation of Colletotrichum fioriniae.</a> Phytopathology. 108, 561-567 (2017).</li><li>Gager, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The influence of cranberry floral wax on appressorium formation in Colletotrichum fioriniae. , (2015).</li><li>Podila, G. K., Rogers, L. M., Kolattukudy, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+signals+from+avocado+surface+wax+trigger+germination+and+appressorium+formation+in+Colletotrichum+gloeosporioides.">Chemical signals from avocado surface wax trigger germination and appressorium formation in Colletotrichum gloeosporioides.</a> Plant Physiology. 103, 267-272 (1993).</li><li>Polashock, J. J., Caruso, F. L., Oudemans, P. V., McManus, P. S., Crouch, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+North+American+cranberry+fruit+rot+fungal+community:+a+systematic+overview+using+morphological+and+phylogenetic+affinities.">The North American cranberry fruit rot fungal community: a systematic overview using morphological and phylogenetic affinities.</a> Plant Pathology. 58, 1116-1127 (2009).</li><li>Miller, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=V-8+juice+agar+as+a+general+purpose+medium+for+fungi+and+bacteria.">V-8 juice agar as a general purpose medium for fungi and bacteria.</a> Phytopathology. 45, 461-462 (1955).</li></ol>

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Bioassays påvisning af C. fioriniae svar på floral ekstrakter (FEs) blev udviklet til blåbær og tranebær frugt rot pathosystems, men let kan tilpasses andre gartneriafgrøder. Protokollen beskrevet ovenfor har været værdifulde i at erhverve mange vigtige datasæt, herunder, men ikke begrænset til: FE effekter på flere isolater af mange patogener, tidsforløb oplysninger vedrørende svampevækst stadier i overværelse af forskellige FEs, sammenligning af udvinding teknikker, inspektion af individuelle kemikalier på C. fioriniae vækst og differentiering, evaluering af individuelle blomst orgel ekstrakter, effekter af temperatur på C. fioriniae mens i FE, effekter af Fænologi afhængige voks ekstraktioner og floral regnvand effekter. Ved hjælp af disse teknikker har data genereret også givet en meget klarere forståelse C. fioriniae livets stadier og delvist belyser hvorfor perioden bloom er så kritisk, at kontrol med mange frugt rådner patogener.
I første omgang alle blomster blev behandlet identisk til aktivt-FE, men udpakningen er flyttet mod at bruge hele blomster. Floral dissektion var tidskrævende og havde meget lille effekt på bioactivity af den resulterende FEs. Dog enkelte blomstermotiver organer kan og har været evalueret ved hjælp af denne protokol, men stor omhu skal tages til ikke helt udblødte floral væv (supplerende film 1, med forholdsregler detaljerede taktfast 2.3), da dette kan resultere i frigivet svampe-toxic/statisk forbindelser ind i en FE, der kunne fordreje de mikroskopiske evalueringer. Mindre invasive ekstraktioner som pass -er FE (supplerende film 2) og rw-FE nu mere gunstig på grund af deres lethed af erhvervelse. Derudover kræver disse udvinding teknikker kun vakuum filtrering til at erhverve biologisk aktive floral kemiske signaler.
Blomsterne anvendes i alle ekstraktioner blev typisk afkølet til 0-3 dage før ekstrakt forberedelse. En udfordring i denne protokol er tidsstyring af FE omsætning (feltsamlingen gennem opbevaring af uddrag). Dette var forstærket af talrige prøver fra flere kilder og datoer. Frosne blomster er ikke blevet evalueret virkelige omfang, som optøede blomster vises forringet og misfarvet. Når den vandbaserede FEs er blevet forberedt, gentagen nedfrysning og optøning har vist nogen effekt på genindfrosset bioactivity af FE, så så længe som FE dog hurtigt efter bioassay forberedelse (levedygtige 3 år gammel FE).
Chloroform-baseret udvinding giver mulighed for undersøgelse af patogenet svar til tre-dimensionelle blomster/frugt overflade voks i et todimensionalt fly via ch-FE fordampning på glas coverslips. Men det er usandsynligt, at de faktiske krystallinske strukturer af voks deponeret fra ch-FE er identisk med den overflade, hvorfra de blev indsamlet. Betydning, supplerende teknikker skal gennemføres, hvis svampe svar på specifikke voks strukturer i vivo er det vigtigste fokus i undersøgelsen. Chloroform-baserede ekstrakter har brug for mere lagerplads vedligeholdelse end de vandbaseret ekstraktion. Ud over at holde ch-FE ekstrakter i mørke, PTFE foret cellekultur tube caps og parafilm forsegling wrap skal jævnligt kontrolleres for fordampning lækager og udskiftes efter behov.
Begrebet overvågning floral regnvandsafstroemning er forankret i tanken om at fremme lokationsspecifikke sygdom overvågningsværktøjer. Regnvand samling enheder kan tilpasses til mange andre plante arkitekturer, så længe enheden indsamling indfanger regnvand, der har kørt ud af blomster. Denne fremgangsmåde indeholder oplysninger om hvorvidt floral stimulation er til stede i feltet på ethvert givet tidspunkt og kan overvåges hele sæsonen. Alternativt, strømaftagere kan implementeres på flere baldakin steder til at bestemme hvor langt floral stikord er blevet vasket i nogen givet befugtning-event. I fremtidige eksperimenter, rw-FE vil diktere Hvornår fungicid programmer skal begynde og hvornår de kan sikkert ende. Derudover ved at overvåge Fænologi afhængige voks ekstraktioner (protokollen afsnit 9), er betydningen af perioden bloom patogen biologi blevet endnu tydeligere. Dette afsnit blev også medtaget for at udvise fleksibilitet for disse bioassays, giver metoder, der giver mulighed for side-by-side sammenligning af vært overflade voks, der er timeligt adskilt. De data, der genereres ved hjælp af blomsterarter udvinding teknikker og bioassays repræsenterer konkrete indikatorer for patogenet stimulation, specifikke kemiske klasser vigtige patogen biologi og mål for fremtidige kontrolstrategier.

Colletotrichum fioriniae forårsager en frugt rådner af både Highbush blåbær (Vaccinium corymbosum L.) og de store amerikanske tranebær (V. macrocarpon Aiton)1,2. Dette patogen blev for nylig afgrænset fra C. acutatum arter komplekse3,4,5,6 og er en kausal agent af blueberry anthracnose og medlem af tranebær frugt rot komplekse, ud over forårsager talrige andre plante sygdomme på verdensplan7. C. fioriniae har en latent, hemibiotrophic livsstil8, med infektioner opstår under flor og symptom udvikling ikke bliver synlige, indtil frugten er i sidste fase af modning9. I blåbær og tranebær kontrolleret frugt rådner kun tilstrækkeligt med fungicid ansøgninger periode flor. Patogenet Overvintrer i hvilende blueberry blomster bud skalaer10 og sporulates under flor. Konidierne flyttes hele baldakinen via regn-splash spredning11,12 og inokulum oprustning er blevet stærkt korreleret til flor periode13. Svar af Colletotrichum arter til vært blomster er ikke enestående for Vaccinium, som blomster er vigtige komponenter af citrus post bloom frugt drop (PFD)14 samt jordbær anthracnose15, i begge tilfælde forårsager patogenet til sporulate. Alle disse tilfælde understrege behovet for effektive metoder til at evaluere de tidsmæssige dynamikken i floral kemiske signaler på C. fioriniae og andre patogener, der inficerer under flor. Den indsigt, som de metoder, der beskrives her bliver stadig mere værdifuldt.
Denne protokol beskriver metoder til blomster ekstrakt (FE) indkøb og guider evaluering af C. fioriniae svar til FE via glas coverslip bioassays15,16. Floral udvinding teknikker er opdelt i to hovedtyper; vandbaseret ekstraktion (aktiv-FE, passiv (pass -FE) og feltet regnvand-baseret (rw-FE)), og chloroform-baseret (ch-FE)17 ekstraktioner. Vand-baserede ekstraktioner mulighed for inspektion af vand mobiliseret floral kemiske signaler. Disse mobiliserede stikord er sandsynligvis vigtige komponenter Domstolens infektion da FE øger hastigheden af infektion16, ud over at give fugt kræves for infektion at forekomme. Derudover udgør de en mere naturlig tilstand som floral stimulation kan blive vasket hele baldakinen under befugtning-begivenheder som tidligere observerede i blåbær og andre afgrøde systemerne14,16. Chloroform-baserede floral ekstraktioner (ch-FE) også give værdifuld information vedrørende patogen svar til værten overflade voks17,18, belyse de tidlige vækst stadier af konidier engang deponeret på modtagelige værten organer (dvs. blomster, æggestokkene og udvikle frugt). Patogenet svar til sæsonbestemte ændringer i vært overflade voks kan også overvåges ved hjælp af denne protokol. Derfor, bioassays er skræddersyet til at arbejde med enten vandbaseret FE eller chloroform-baserede FE at afbøde de iboende forskelle mellem disse to materialer.
De data, der genereres fra bioassays afslørede at vandbaseret ekstraktion stimulere højere niveauer af sekundære conidiation end chloroform-baserede ekstraktioner hvor der var en definitiv appressorial svar, derfor implicere flere forbindelser stede i FE. Interessant nok, blev begge disse vækst svar observeret når ved hjælp af regnvand, der var løbet ud af blåbær og tranebær blomster, der angiver flere stimulerende forbindelser kan vaskes fra overfladen af blomster. Således vil overvågning for blomstermotiver stimulation give indsigt i sandsynligheden for, at patogenet succes i et landbrugssystem.
Det ultimative mål for denne protokol er at give en metode til generere baseline biologiske oplysninger om svampe plante patogener som svar på floral kemiske signaler, som igangsættende metoder, der kan udnytte denne floral oplysninger til støtte i lokationsspecifikke sygdom forvaltnings- og beslutningsprocedurerne processer.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:932px;" width="933">
	<colgroup>
		<col />
		<col span="3" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:324px;">0.22 &#181;m pore size, acetate sterilizing filter</td>
			<td style="width:203px;">VWR</td>
			<td style="width:203px;">101102-280</td>
			<td style="width:203px;">Blueberry floral extract (FE) clarification&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:324px;">200-1000 &#181;l pipette with tips</td>
			<td style="width:203px;">-</td>
			<td style="width:203px;">-</td>
			<td style="width:203px;">Equipment, any make within range will be adequate</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:324px;">40-200 &#181;l pipette with tips</td>
			<td style="width:203px;">-</td>
			<td style="width:203px;">-</td>
			<td style="width:203px;">Equipment, any make within range will be adequate</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:324px;">5-40 &#181;l pipette with tips</td>
			<td style="width:203px;">-</td>
			<td style="width:203px;">-</td>
			<td style="width:203px;">Equipment, any make within range will be adequate</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:324px;">Air spray gun disposable paint spray cup with connection adapter&#160;</td>
			<td style="width:203px;">Harbor Freight</td>
			<td style="width:203px;">97098</td>
			<td style="width:203px;">Blueberry rainwater (rw-)FE collection</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:324px;">Autoclave</td>
			<td style="width:203px;">Amsco</td>
			<td style="width:203px;">3011</td>
			<td style="width:203px;">Equipment, media preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:324px;">Bar mesh matting (plastic mesh sheet)</td>
			<td style="width:203px;">Winco</td>
			<td style="width:203px;">BL-240</td>
			<td style="width:203px;">Passive (pass)-FE collection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:324px;">Benchtop timer</td>
			<td style="width:203px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:203px;">06-662-47</td>
			<td style="width:203px;">Equipment, FE preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:324px;">Black pressure/vacuum hose</td>
			<td style="width:203px;">VWR</td>
			<td style="width:203px;">62994-795</td>
			<td style="width:203px;">Vacuum filter component</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:324px;">Buchner funnel</td>
			<td style="width:203px;">Coors USA</td>
			<td style="width:203px;">60240</td>
			<td style="width:203px;">Vacuum filter component, accepts 55 mm filter paper disks</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:324px;">Bunsen burner&#160;&#160;</td>
			<td style="width:203px;">-</td>
			<td style="width:203px;">-</td>
			<td style="width:203px;">Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:324px;">Calcium carbonate</td>
			<td style="width:203px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:203px;">C64-500</td>
			<td style="width:203px;">Media component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:324px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:203px;">Sorvall&#160;</td>
			<td style="width:203px;">RC 5B Plus</td>
			<td style="width:203px;">Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:324px;">Centrifuge tubes (15 ml)</td>
			<td style="width:203px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:203px;">05-527-90</td>
			<td style="width:203px;">Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:324px;">Centrifuge tubes (50 ml)</td>
			<td style="width:203px;">VWR</td>
			<td style="width:203px;">10025-694</td>
			<td style="width:203px;">Equipment, rw-FE collection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:324px;">Cheesecloth (grade 50)</td>
			<td style="width:203px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:203px;">AS240</td>
			<td style="width:203px;">Equipment, FE preparation</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:324px;">Chloroform</td>
			<td style="width:203px;">VWR</td>
			<td style="width:203px;">JT9175-3</td>
			<td style="width:203px;">Chemical, trichloromethane: assay grade, &#8805; 99% pure, for molecular biology, peroxide-free</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:324px;">Corn Meal Agar (CMA)</td>
			<td style="width:203px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:203px;">B11132</td>
			<td style="width:203px;">&#160;Pre-mix media, isolate storage on slants</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:324px;">Cotton-blue stain</td>
			<td style="width:203px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:203px;">61335</td>
			<td style="width:203px;">Lactophenol cotton-blue stain</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:324px;">Curved forceps (45&#730;)</td>
			<td style="width:203px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:203px;">10-270</td>
			<td style="width:203px;">Equipment, flower processing and coverslip inversion</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:324px;">Difco Agar</td>
			<td style="width:203px;">VWR</td>
			<td style="width:203px;">90004-032</td>
			<td style="width:203px;">Media component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:324px;">Drill-press</td>
			<td style="width:203px;">Delta</td>
			<td style="width:203px;">-</td>
			<td style="width:203px;">Equipment, rw-FE collection</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:324px;">EASYpure LF Ultrapure water</td>
			<td style="width:203px;">Barnstead</td>
			<td style="width:203px;">D738</td>
			<td style="width:203px;">Equipment, deionized water source</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:324px;">Ethanol (95%)</td>
			<td style="width:203px;">-</td>
			<td style="width:203px;">-</td>
			<td style="width:203px;">Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:324px;">Filter flask (500 ml)</td>
			<td style="width:203px;">Pyrex</td>
			<td style="width:203px;">No. 5340</td>
			<td style="width:203px;">Vacuum filter component</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:324px;">Freezer (set to -20&#730; C)</td>
			<td style="width:203px;">-</td>
			<td style="width:203px;">-</td>
			<td style="width:203px;">Equipment, storage of active-FE, pass-FE, rw-FE&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:324px;">Fume hood</td>
			<td style="width:203px;">Hamilton</td>
			<td style="width:203px;">-</td>
			<td style="width:203px;">Equipment, chloroform usage</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:324px;">Funnel (7 X 7 cm)&#160;</td>
			<td style="width:203px;">VWR</td>
			<td style="width:203px;">60820-110</td>
			<td style="width:203px;">Cranberry rw-FE collection, FE preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:324px;">Generic glass slide&#160;</td>
			<td style="width:203px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:203px;">22-038-101</td>
			<td style="width:203px;">Bioassay conductance</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:324px;">Generic plastic pump spray bottle</td>
			<td style="width:203px;">VWR</td>
			<td style="width:203px;">16126-454</td>
			<td style="width:203px;">pass-FE collection, at least 250 ml capacity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:324px;">Glass cell culture tubes</td>
			<td style="width:203px;">-</td>
			<td style="width:203px;">-</td>
			<td style="width:203px;">Storage of ch-FE</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:324px;">Glass coverslips (22 x 22 mm)</td>
			<td style="width:203px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:203px;">12-542B</td>
			<td style="width:203px;">Bioassay conductance</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:324px;">Glass Van Tieghem cells (hand cut glass tubes)</td>
			<td style="width:203px;">-</td>
			<td style="width:203px;">-</td>
			<td style="width:203px;">Chloroform (ch)-FE bioassay, (8 mm OD 6 mm ID)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:324px;">Glass-pipette (1-100 &#181;l)</td>
			<td style="width:203px;">Hamilton Co. Inc.</td>
			<td style="width:203px;">#710</td>
			<td style="width:203px;">ch-FE bioassay</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:324px;">Glycerol</td>
			<td style="width:203px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:203px;">G5516</td>
			<td style="width:203px;">Lactophenol cotton-blue stain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:324px;">Hemocytometer</td>
			<td style="width:203px;">Bright-Line</td>
			<td style="width:203px;">5971R10</td>
			<td style="width:203px;">Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:324px;">Incubator (set to 25&#730; C, dark)</td>
			<td style="width:203px;">Percival&#160;</td>
			<td style="width:203px;">50036</td>
			<td style="width:203px;">Equipment, bioassay conductance</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:324px;">Lactic acid</td>
			<td style="width:203px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:203px;">W261106</td>
			<td style="width:203px;">Lactophenol cotton-blue stain</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:324px;">Laminar flow hood</td>
			<td style="width:203px;">Labconco</td>
			<td style="width:203px;">3730400</td>
			<td style="width:203px;">Equipment, sterile work environment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:324px;">Metal probe (generic)&#160;</td>
			<td style="width:203px;">-</td>
			<td style="width:203px;">-</td>
			<td style="width:203px;">Equipment&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:324px;">Microcentrifuge tubes (2 ml)</td>
			<td style="width:203px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:203px;">05-408-138</td>
			<td style="width:203px;">Aqueous treatment mixture storage and preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:324px;">Microscope, Leica DMLB</td>
			<td style="width:203px;">Leica</td>
			<td style="width:203px;">020-519.010</td>
			<td style="width:203px;">Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:324px;">Mortar (ceramic)</td>
			<td style="width:203px;">Coors USA</td>
			<td style="width:203px;">60313</td>
			<td style="width:203px;">Vacuum filter component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:324px;">Nitrile gloves&#160;</td>
			<td style="width:203px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:203px;">19-130-1597D</td>
			<td style="width:203px;">Flower collection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:324px;">Paper disks (cut paper towels)</td>
			<td style="width:203px;">Office Basics</td>
			<td style="width:203px;">KCC01510</td>
			<td style="width:203px;">humidity control in bioassay</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:324px;">Parafilm</td>
			<td style="width:203px;">Bemis</td>
			<td style="width:203px;">PM-996</td>
			<td style="width:203px;">Plastic paraffin film&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:324px;">Pestle (ceramic)</td>
			<td style="width:203px;">Coors USA</td>
			<td style="width:203px;">60314</td>
			<td style="width:203px;">Vacuum filter component</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:324px;">Phenol crystals</td>
			<td style="width:203px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:203px;">A92-100</td>
			<td style="width:203px;">Lactophenol cotton-blue stain</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:324px;">Plastic bags (~100 mm X 152 mm)</td>
			<td style="width:203px;">Uline</td>
			<td style="width:203px;">S1294</td>
			<td style="width:203px;">Equipment, flower refrigeration</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:324px;">Plastic cell culture dishes (9 cm diameter)&#160;</td>
			<td style="width:203px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:203px;">FB0875712</td>
			<td style="width:203px;">(Petri dish), bioassay conductance</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:324px;">Polytetrafluoroethylene (PTFE) lined caps&#160;</td>
			<td style="width:203px;">VWR</td>
			<td style="width:203px;">60927-228</td>
			<td style="width:203px;">Storage of ch-FE</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:324px;">Pyrex beakers (100 ml)</td>
			<td style="width:203px;">Pyrex</td>
			<td style="width:203px;">No. 1000</td>
			<td style="width:203px;">Preparation of ch-FE</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:324px;">Pyrex bread-pan</td>
			<td style="width:203px;">-</td>
			<td style="width:203px;">-</td>
			<td style="width:203px;">pass-FE collection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:324px;">Pyrex graduated cylinder</td>
			<td style="width:203px;">-</td>
			<td style="width:203px;">-</td>
			<td style="width:203px;">Equipment, FE preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:324px;">Refrigerator (set to 4&#730; C)</td>
			<td style="width:203px;">-</td>
			<td style="width:203px;">-</td>
			<td style="width:203px;">Equipment, storage of ch-FE</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:324px;">Sealed plastic container (30 mm X 13 mm X 7 mm)&#160;</td>
			<td style="width:203px;">-</td>
			<td style="width:203px;">-</td>
			<td style="width:203px;">Bioassay conductance</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:324px;">Sharp-pointed dissecting scissors</td>
			<td style="width:203px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:203px;">8940</td>
			<td style="width:203px;">Equipment, to cut cheese-cloth and paper disks</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:324px;">Stainless steel mesh strainer</td>
			<td style="width:203px;">VWR</td>
			<td style="width:203px;">470149-756</td>
			<td style="width:203px;">Preparation of ch-FE</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:324px;">Step drill bit (step-bit)</td>
			<td style="width:203px;">Dewalt</td>
			<td style="width:203px;">-</td>
			<td style="width:203px;">Equipment, rw-FE collection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:324px;">Sterile loop (combi-loop)</td>
			<td style="width:203px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:203px;">22-363-602&#160;</td>
			<td style="width:203px;">Culture preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:324px;">Telephone wire (internal wires)</td>
			<td style="width:203px;">-</td>
			<td style="width:203px;">-</td>
			<td style="width:203px;">Blueberry rw-FE collection</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:324px;">Test tube basket&#160;</td>
			<td style="width:203px;">VWR</td>
			<td style="width:203px;">470137-792</td>
			<td style="width:203px;">Readily available substitution for plastic mesh [strawberry] basket&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:324px;">V8 Juice</td>
			<td style="width:203px;">Campbell&#39;s Soup Company</td>
			<td style="width:203px;">-</td>
			<td style="width:203px;">Fungal media component</td>
		</tr>
		<tr height="65">
			<td height="65" style="height:65px;width:324px;">Vintage plastic mesh [strawberry] baskets</td>
			<td style="width:203px;">Donation</td>
			<td style="width:203px;">-</td>
			<td style="width:203px;">pass-FE collection, can substitute for test tube basket (470137-792)</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:324px;">Vortex Genie (Vortex)</td>
			<td style="width:203px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:203px;">12-812</td>
			<td style="width:203px;">Spore suspension preparation</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:324px;">Whatman No. 1 Qualitative 55 mm circles</td>
			<td style="width:203px;">Whatman</td>
			<td style="width:203px;">1001-055</td>
			<td style="width:203px;">Vacuum filter component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:324px;">White plastic twist ties (100 mm)</td>
			<td style="width:203px;">Uline</td>
			<td style="width:203px;">S-566W</td>
			<td style="width:203px;">Cranberry rw-FE collection</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

colletotrichum fioriniae development in water and chloroform-based blueberry and cranberry floral extracts

Nøjagtigt overvåge Fænologi udløb bloom og tidsmæssige dynamikken i floral kemiske signaler på svampe frugt rådner patogener, blev floral udvindingsmetoder og coverslip bioassays udviklet, udnytte Colletotrichum fioriniae. I blåbær og tranebær styres dette patogen optimalt ved at anvende fungicider periode flor på grund af blomster rollespil i de indledende stadier af infektion. Protokollen detaljeret her beskriver hvordan floral ekstrakter (FE) er fremstillet ved hjælp af vand-, chloroform- og felt regnvand-baserede metoder til senere brug i tilsvarende glas coverslip bioassays. Hver FE tjente til at angive forskellige sæt af oplysninger: svar af C. fioriniae mobiliserede floral kemiske stikord i vand (vandbaseret), patogen svar til blomst og frugt overflade voks (chloroform-baseret) og felt-baseret overvågning indsamlet floral regnvand, flytte in vitro- bemærkninger til en landbrugs indstilling. FE er generelt betegnes som enten vand - eller chloroform-baseret, med en passende bioassay beskrevet for at kompensere for de iboende forskelle mellem disse to materialer. Regnvand, der havde kørt off blomster blev indsamlet i unikke enheder for hver afgrøde, hentyder til den fleksibilitet og anvendelsen af denne tilgang til andre afgrøder systemer. Bioassays er hurtig, billig, enkel og giver mulighed for at generere spatiotemporelle og områdespecifikke oplysninger om tilstedeværelsen af stimulerende floral forbindelser fra forskellige kilder. Denne information vil i sidste ende bedre informere sygdom strategier, som FE falde af fristerne for infektion at forekomme, hvilket giver indblik i skiftende risici for patogen infektion over vækstsæsonen.

Resultaterne præsenteres her er et par eksempler på de mange assays, der kan udføres ved hjælp af denne metode. Figur 1 er en illustreret guide til vandbaserede FE bioassay og er suppleret med figur 2 som følger til chloroform-baserede FE bioassay. Figur 3 giver en visuel guide til hvad man kan forvente ved mikroskopisk evaluering af C. fioriniae på 24 timer, i både vand - og chloroform-baserede bioassays (sammenlignet SDW kontrolelementer). Figur 4 detaljer en 24 h tidsforløb undersøgelse med C. fioriniae i nærværelse af sorten tranebær 'Stevens' ch-FE, og giver visuel reference til en import resultatet af denne forskning: FE faldt tid til at danne strukturer, der infektion i forhold til SDW. Figur 5 viser et eksempel på data indsamlet fra en coverslip bioassay bruger tranebær floral regnvandsafstroemning (CB "Blomst" rw-FE). Figur 6 repræsenterer et andet vigtigt resultat: floral æggestokken ch-FE var langt mere stimulerende end frugt ch-FE, der angiver betydningen af bloom i livscyklus C. fioriniae. Supplerende billeder og film giver vigtige visuals af blomster anvendes i ekstraktioner og floral regnvand samling enheder/installation, ud over film, at Visualiser aktiv- og passiv - udvinding ( vand-baseret) processer.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58880/58880fig1.jpg"> Figur 1 : Generel oversigt over den vandbaserede blomster ekstrakt (FE) bioassay. Denne analyse blev udnyttet til vandbaseret floral ekstrakter med både blåbær og tranebær blomster: aktiv -floral ekstrakter (aktiv-FE), passiv -floral ekstrakter (pass-FE) og floral regnvandsafstroemning (rw-FE). -FE del typisk udgør den eksperimentelle/variabel faktor. Omvendt-FE del kan forblive konstant og tid point/timer efter podning kan evalueres. Præference er gjort 4 felt analyse på 200 X forstørrelse. Forkortelser: Sterile deioniseret vand, SDW; Areal pr. synsfelt, A. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880fig1large.jpg" target="_blank">venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58880/58880fig2.jpg"> Figur 2 : Generel oversigt over chloroform-baserede blomster ekstrakt (ch-FE) bioassay. Denne analyse blev udnyttet til både blåbær og tranebær (blomster, æggestokkene og frugt). Kun én type af vandige behandling blanding blev brugt i denne analyse, 1 del sporeopslæmning til 2 dele SDW (til at holde conidial koncentration konsekvent skyldes ch-FE fordampning). Denne analyse kan bruges til at sammenligne flere ch-FE (voks fra forskellige plante overflader) eller flere gang point/timer efter podning ved hjælp af en enkelt ch-FE. Forkortelser: Sterile deioniseret vand, SDW; Van Tieghem [glas] celler, vante. celle. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880fig2large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58880/58880fig3.jpg"> Figur 3 : Visuel sammenligning af Colletotrichum fioriniae vandbaseret FE og ch-FE. I denne analyse blueberry 'Bluecrop' (aktiv-FE, vand-baseret) (svampe isolat: BB #10) og tranebær 'Stevens' chloroform-baseret (ch-FE) (svampe isolat: CB-PMAP182) blomster ekstrakter sammenlignet med SDW kontrol. En dramatisk stigning i sekundære conidiation (ringe) og appressorium dannelse (pilespidser) blev observeret ved sammenligning af konidier i overværelse af SDW (kontrol) (A) til active-FE (B) på 24 h efter podning. Sekundær conidiation var dog ikke så tydeligt når man sammenligner chloroform bioassay SDW kontrol (C) til ch-FE (D); snarere, C. fioriniae vækst skiftede retning appressorial dannelse. Vist er et fælles svar på hver type, udvinding, vandbaseret og chloroform-baseret, uanset vært/blomstermotiver arter beskrevet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880fig3large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58880/58880fig4.jpg"> Figur 4 : Tidsforløb undersøgelse (24 h) med Colletotrichum fioriniae i nærværelse af ch-FE. I dette assay, blev en SDW kontrol (A-D) og tranebær 'Stevens' ch-FE (E-F) visuelt inspiceret på 0, 6, 12 og 24 timer efter podning (et eksempel på variabel tid point i stedet for at sammenligne flere FE). Appressorium dannelse (pilespidser) begyndte på 6 h i ch-FE og steget støt i hele efterfølgende tid point. Denne resultater unddrager sig til en vigtig faktor for patogenet biologi periode flor: blomster afkortning af fristerne til at danne infektion strukturer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880fig4large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58880/58880fig5.jpg"> Figur 5 : Grafisk visning af data indsamlet ved hjælp af rw-FE i et bioassay. Regnvand løber ud af tranebær blomster (CB "Blomst" rw-FE) og jomfru regnvand, der ikke havde rørt nogen tranebær plantevæv ("Ground" rw-FE) fra en enkelt befugtning-event plus en standard aktive, tranebær vandbaseret blomster ekstrakt (CB aktive -FE) (positiv kontrol) og SDW (negativ kontrol) blev udsat for en vandbaseret coverslip bioassay og evalueret for C. fioriniae vækst. CB "Blomst" rw-FE havde det samme niveau af sekundære conidiation og appressorium dannelse som den standard CB aktiv-FE på 24 h efter podning, der angiver, at strømaftagere var effektive i at indfange floral stimulanser frigivet under en befugtning-event. Samlede konidier består af primær (deponeret), konidier og nydannede sekundære konidier. Bogstaver angiver betydelige forskelle på p < 0,05 ifølge Fischers mindste signifikant forskel test (LSD); store bogstaver, samlede konidier; små bogstaver, appressoria. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880fig5large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58880/58880fig6.jpg"> Figur 6 : Tranebær Fænologi baseret ch-FE bioassay, besigtigelse. Disease management for frugt rådner svampe ofte indebærer bloom tid fungicid applikationer. Tranebær chloroform-baserede ekstrakter (ch-FE) fra flere vækststadierne af tranebær ('Stevens') var her, visuelt vurderet effekten af overflade voks på C. fioriniae på 24 h efter podning. Æggestokkene indsamlet i juni (A), umodne frugt indsamles i juli og August (B, C), høstede frugten indsamlet i oktober (D), og en SDW kontrol (E) blev inspiceret for appressorial dannelse (pilespidser). Æggestokken ch-FE havde det største omfanget af appressorial dannelse, der angiver, at denne plante Fænologi (bloom) er kritisk vigtigt at livscyklus af C. fioriniae. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880fig6large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Supplemental Figure 1" src="/files/ftp_upload/58880/58880supfig1.jpg"> Supplerende figur 1: blåbær blomsterstand. Blueberry blomster blev indsamlet for ekstraktioner i fuldt flor (April-maj i New Jersey, USA) (vist 'Bluecrop'). Bemærk overlapningen af corollas/æggestokke fra tilstødende blomster og den overordnede arkitektur i Blomsterstanden sammenlignet med supplerende figur 2 (cranberry oprejst). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880supfig1large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Supplemental Figure 2" src="/files/ftp_upload/58880/58880supfig2.jpg"> Supplerende figur 2: tranebær opretstående. Tranebær blomster blev indsamlet for ekstraktioner i fuldt flor (juni-juli i New Jersey, USA) (vist 'Stevens'). Bemærk varieret blomst stadier på en enkelt tranebær blomsterstand (oprejst), og de krogede vanddråbe bevarer formen af Blomsterkronen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880supfig2large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Supplemental Figure 3" src="/files/ftp_upload/58880/58880supfig3.jpg"> Supplerende figur 3: blåbær regnvand installation (blomst). Afsluttet blueberry floral regnvand samling enhed, placeret direkte under en klynge af blomsterstande. Bemærk den plastik-belagt ledning anvendes til lodret orientere enheden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880supfig3large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Supplemental Figure 4" src="/files/ftp_upload/58880/58880supfig4.jpg"> Supplerende figur 4: blåbær regnvand installation (stem). Udfyldte blueberry floral regnvand samling enhed, placeret halvvejs nede på stænglen mellem en blomsterstand og kronen af bush. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880supfig4large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Supplemental Figure 5" src="/files/ftp_upload/58880/58880supfig5.jpg"> Supplerende figur 5: blåbær regnvand installation (crown). Afsluttet blueberry floral regnvand samling enhed, placeret i bunden af bush (crown). Bemærk plast belagt ledninger kan fjernes, hvis det er ikke nødvendigt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880supfig5large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Supplemental Figure 6" src="/files/ftp_upload/58880/58880supfig6.jpg"> Supplerende figur 6: blåbær regnvand installation (jorden). Afsluttet jomfru regnvand samling enhed, placeret ved siden af blueberry buske. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880supfig6large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Supplemental Figure 7" src="/files/ftp_upload/58880/58880supfig7.jpg"> Supplerende figur 7: tranebær regnvand installation (close-up). Afsluttet tranebær floral regnvand samling enhed, med to stolper gemt under pænt krydsede wire slips. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880supfig7large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Supplemental Figure 8" src="/files/ftp_upload/58880/58880supfig8.jpg"> Supplerende figur 8: tranebær regnvand deployment. Flere afsluttet tranebær floral regnvand enheder installeres i en mose. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880supfig8large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Supplemental Movie 1" src="/files/ftp_upload/58880/58880supmovie1.jpg"> Supplerende Movie 1: aktiv, vandbaseret floral ekstrakter (aktiv -FE). Supplerende video støtte følgende trin 2.3-2.5.1. Blueberry 'Bluecrop' blomster blev brugt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/active-FEextraction.mp4" target="_blank">Venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente.)</a>
<img alt="Supplemental Movie 2" src="/files/ftp_upload/58880/58880supmovie2.jpg"> Supplerende Movie 2: passiv, vandbaseret floral ekstrakter (pass-FE). Supplerende video støtte følgende trin 3.3-3.4. Blueberry 'Bluecrop' blomster blev brugt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/pass-FEextraction.mp4" target="_blank">Venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente.)</a>
<img alt="Supplemental Movie 3" src="/files/ftp_upload/58880/58880supmovie3.jpg"> Supplerende Movie 3: implementering af tranebær floral regnvand strømaftagere. Supplerende video støtte følgende trin 6.4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/rw-FEdeployment.mp4" target="_blank">Venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente.)</a>

Watch this Scientific Journal Video about Colletotrichum fioriniae Development in Water and Chloroform-based Blueberry and Cranberry Floral Extracts at JoVE.com

Colletotrichum fioriniae Development in Water and Chloroform-based Blueberry and Cranberry Floral Extracts

Her, er bioassays designet til at overvåge udviklingen af en svampe patogen, Colletotrichum fioriniae, i overværelse af blåbær eller tranebær blomsterarter udskrifter på glas coverslips beskrevet. Vand-, chloroform, og feltet regnvand - baseret floral udvinding teknikker er detaljerede samt indsigt i hvordan oplysningerne kan anvendes.

Colletotrichum fioriniae Udvikling i vand og Chloroform-baserede blåbær og tranebær Floral ekstrakter

To accurately monitor the phenology of the bloom period and the temporal dynamics of floral chemical cues on fungal fruit rotting pathogens, floral ...

Denne protokol giver en billig og fleksibel system til at vurdere den tidsmæssige dynamik fluorokemiske signaler på Colletotrichum fiornia og andre plantepatogener, der inficerer sigt blomstre. Nye gulv regnvand indsamling enheder gør det muligt for brugeren at overvåge naturlige stimulanser og betingelser, der påvirker patogen udvikling i en nær realtid sted-specifik måde. Begynd denne procedure med en kultur af Colletotrichum fiorniae fra en naturligt inficeret vært som beskrevet i tekstprotokollen.Når kolonier begynder at sporulere, streak conidia på en anden V 8 Juice agar indeholder cellekultur parabol til at producere en høj densitet sporulerende kultur. Efter syv dages vækst skal du bruge en standardsterilsløjfe til at samle en lille mængde conidia fra højtæthedskulturen ved let at røre løkken til konidial massen. Dette omrøres i et 15 milliliter centrifugerør indeholdende 10 milliliter sterilt deioniseret vand.Vortex denne prøve i 10 sekunder. Brug en standard pipette, springet op og ned mange gange for yderligere at blande prøven. Derefter placeres en dråbe af den vortexed prøve på hæmocytometeret og anslå spor koncentrationer.Koncentrationen justeres til 0,1 mio. Dette kaldes sporeaffjedringen og foretages først umiddelbart før brug i enten bioassay. For at udføre chloroform-baseret blomsterekstraktion, rense alle komponenter med 95% ethanol to gange.Derefter rengøres komponenterne to gange med chloroform for at forhindre kontaminering for hver ekstraktion. PTFE-forede hætter må ikke rengøres med chloroform, da det beskadiger dem. Efter rengøring skal komponenterne sættes til side for at tørre på hovedet.Kombiner en del forarbejdede blomster til ni dele chloroform i et bægerglas ved at tilføje blomster og derefter kloroform. Svir forsigtigt i 30 sekunder og belastning gennem en rustfri stål skærm i det andet bægerglas. Hæld det chloroformbaserede ekstrakt fra det andet bægerglas i glaskulturrøret, og PTFE-hætten anbringes.Wrap hætten med parafilm for at forhindre fordampning. Opbevar det resulterende chloroform-baserede blomsterekstrakt i mørke for at reducere lysnedbrydningen ved fire grader Celsius indtil eksperimentel brug. Gentag ekstraktioner med flere prøver for at give replikater.Hvis du vil oprette en samlingsenhed for hvert valgt sted, skal du bruge en skridtbid, der er fastgjort til et boretryk, til at bore et hul i bunden af en spraykop. Skær derefter en lige linje fra toppen af hullet til mundingen af spraykoppen. Nu bor fire lige langt huller store nok til at tråd plast belagt tråd ved mundingen af spray kop.Fastgør den ene ende af plastbelagte ledninger og efterlader den ene ende fri. Bor et hul, der er stort nok til at tråde malingssprayen eller kopadapteren i et 50 milliliter centrifugedæklåg. Forsegl adaptertrådene med parafilm for at undgå utætte.Fastgør dette til både centrifugehætten og den gevinddelen af sprøjtekoppen. Derefter fastgør parret 50 millimeter centrifuge rør. Opret fire indsamlingsenheder pr. samplingplacering.Implementer enheder på udvalgte steder ved at bøje sprøjtekopper, så de passer på stængler. Vend skæresiden af sprøjtekoppen opad ved hjælp af plastbelagte ledninger, der er fastgjort til andre stængler. Dette sikrer, at vand, der passerer over blomsterne, fanges.At indsamle regnvand fra tranebær blomster, første varme punktering otte lige langt huller omkring mundingen af tragten ved hjælp af en metalsonde. Sæt twist bånd i fire af hullerne. Fastgør de andre ender til hullets modsatte placering, der danner et pænt krydsmønster.Wrap tragten ned damp med parafilm og der er afsat. Bor et hul stort nok til at indsætte tragten ned stilken i en 50 milliliter centrifuge hætte med et skridt smule. Sæt den forberedte tragt i centrifugehætten.Efter regn eller overvanding, fjerne og erstatte den nederste rør del af centrifugerøret. Regnvandsopsamlingsrørene bør hurtigt skiftes efter befugtning begivenheder, da de er tilbøjelige til nedbrydning fra naturlige forurenende stoffer mobiliseret i afstrømning såsom bakterier og andre svampe. Placer to lag papir skiver i kultur retter og suge med to milliliter sterilt destilleret vand.Dernæst blandes lige store mængder sterilt destilleret vand og vandbaseret blomsterekstrakt i to milliliter mikrocentrifugerør. Derefter tilsættes et tilsvarende volumen af sporeaffjedringen til de forberedte to milliliter mikrocentrifugerør. Det resulterende præparat kaldes en vandig behandlingsblanding.For kontrol, udelade blomsterekstrakt del og erstatte med sterilt destilleret vand for at holde konidiale koncentrationer konsekvent. Nu placere forrensede glas coverslips på toppen af gennemblødt papirhåndklæder i cellen kultur parabol. Placer en 40 mikroliter dråbe vandig behandling blanding på midten af en coverslip.Gentag dette for ønskede behandlinger, herunder kontrol. Luk derefter cellekulturskålen. Når alle behandlinger og replikater er blevet dispenseret, skal du placere alle replikerede cellekulturretter i en forseglet plastbeholder og inkubere ved 25 grader Celsius i mørket.Ved forudbestemte tidspunkter tilsættes 10 mikroliter af et fiksativ til dråberne, der stopper væksten, og semi-konservering af holderen. Når en fiksativ er blevet tilføjet, omhyggeligt vende coverslips placere hver af dem dråbe side ned på et glas mikroskop dias for at lette mikroskopisk undersøgelse. Når alle dækslæber er på glasmikroskopets slides, skal du lade dem sætte sig ned og delvist tørre i flowhætten i 20 minutter.Tæl alle conidia til stede på coverslip herunder primær conidia, spirede conidia, og nydannede sekundære conidia, samt appressoria. Arbejde på enten 400 gange forstørrelse eller 200 gange i alt et areal på 3.808 kvadrat millimeter. I en laminar flow hætte, tilsættes to lige store mængder sterilt destilleret vand og et volumen af spore suspension til en to milliliter mikrocentrifuge rør.Sæt denne vandige behandling blanding til side for chloroform-baserede blomsterekstrakt bioassays. I en røghætte skal du placere en Van T Cell på et glasdækslæb i den forberedte plastikcellekulturskål. Dispensere 33 mikroliter af ønskede chloroform-baserede blomsterekstrakt ind i midten af cellen og lad det tørre.Rør ikke ved væggene i cellen. Til kontrolbehandlingen tilsættes jomfruchloroform. Når det chloroform-baserede blomsterekstrakt er tørret, dispenseres 99 mikroliter af den forberedte vandige behandlingsblanding med en standardpipette ind i midten af Van T Cell.Luk derefter alle cellekulturretter og inkuber. På forudbestemte tidspunkter tilsættes 15 mikroliter af et fiksativ til Van T Cell og lad den sidde i mindst fem minutter for at sikre tilstrækkelig svampefarvning. Derefter skal van T-cellen fjernes forsigtigt.Udfør coverslip inversion og dataindsamlingstrin som før. Ved mikroskopisk evaluering af C.fiorniae ved 24 timers efter vaccination, sammenligning af conidia i nærvær af sterilt destilleret vand versus vandbaseret blomsterekstrakt afslører en dramatisk stigning i sekundær conidiation og appressorium dannelse. Sekundær konidiation var imidlertid ikke så tydelig, når man sammenlignede den chloroforme bioassay sterile destilleret vandkontrol med chloroformbaserede ekstrakter.Snarere, C.fiorniae vækst flyttet i retning af appressoral dannelse. I denne analyse blev en steril destilleret vandkontrol og tranebærchloroform-baserede blomsterekstraktioner visuelt inspiceret ved nul, seks, 12 og 24 timer efter vaccination. Appressorium dannelse begyndte på seks timer i chloroform-baserede blomsterekstrakt og støt steget i hele efterfølgende tidspunkter.Dette resultat understøtter konstateringen af, at blomster reducere den tid, der er nødvendig for at danne infektion strukturer. Sygdomshåndtering for frugt rådnende svampe indebærer ofte blomstre tid fungicid applikationer. Her blev tranebærchloroform-baserede ekstrakter fra flere vækststadier af tranebær visuelt evalueret for den effektive overfladevoks på C.fiorniae ved 24 timer efter vaccination.Æggestokke indsamlet i juni, umodne frugter indsamlet i juli, og i august høstede frugt indsamlet i oktober, og en steril destilleret vandkontrol blev inspiceret for appressoral dannelse. Æggestokkene chloroform-baserede ekstrakter havde den største størrelse af appressoral dannelse angiver betydningen af blomstre i livscyklus C.fiorniae. Patogenet er den vigtigste komponent i denne protokol.Svampe bør flyttes til friske medier rutinemæssigt at bevare sammenhængen mellem forsøg. Arbejde med chloroform skal udføres i en røghætte af sikkerhedsmæssige årsager. Dette omfatter fremstilling af materialer og glasvarer, ekstraktionsprocedurer og ledningsevne af den chloroformbaserede bioassay.Kombinationer af tidspunkter, patogener, blomster regnvand samlinger, eller vært ekstraktioner kan udnyttes til at evaluere forskellige vært-patogen interaktioner. Regnvandsopsamlingsudstyret og de tilhørende bioassays vil gøre det muligt for andre at arbejde med værtsstimulanser mobiliseret under regnbegivenheder i mange stisystemer.

Research

JoVE Journal

Environment

Colletotrichum fioriniae Development in Water and Chloroform-based Blueberry and Cranberry Floral Extracts

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. I. Collection of Virus Samples

EPA Method 1615. Måling af Enterovirus og norovirus Forekomst i vand efter kultur og RT-qPCR. I. Indsamling af virus prøver

EPA Method 1615 was developed with a goal of providing a standard method for measuring enteroviruses and noroviruses in environmental and drinking waters. ...

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. Part III. Virus Detection by RT-qPCR

EPA Metode 1615. Måling af Enterovirus og Roskildesyge Forekomst i Water af Kultur og RT-qPCR. Del III. Virus Detection ved RT-qPCR

EPA Method 1615 measures enteroviruses and noroviruses present in environmental and drinking waters. This method was developed with the goal of having a ...

A Duplex Digital PCR Assay for Simultaneous Quantification of the Enterococcus spp. and the Human Fecal-associated HF183 Marker in Waters

A Duplex Digital PCR Assay for Simultaneous Quantification of the Enterococcus spp. and the Human Fecal-associated HF183 Marker in Waters

En Duplex Digital PCR analyse for Samtidig Kvantificering af<em&gt; Enterococcus spp.</em&gt; Og Human Fækal-associerede HF183 Marker i Waters

This manuscript describes a duplex digital PCR assay (EntHF183 dPCR) for simultaneous quantification of Enterococcus spp. and the human fecal-associated ...

Characterization and Application of Passive Samplers for Monitoring of Pesticides in Water

Karakterisering og anvendelse af passive samplere for Overvågning af pesticider i vand

Five different water passive samplers were calibrated under laboratory conditions for measurement of 124 legacy and current used pesticides. This study ...

Soil Lysimeter Excavation for Coupled Hydrological, Geochemical, and Microbiological Investigations

Jord lysimeter Udgravning til Koblede Hydrologiske, geokemiske og mikrobiologiske undersøgelser

Studying co-evolution of hydrological and biogeochemical processes in the subsurface of natural landscapes can enhance the understanding of coupled ...

Use of a Filter Cartridge for Filtration of Water Samples and Extraction of Environmental DNA

Anvendelse af en filterpatron til filtrering af vandprøver og Udvinding af Environmental DNA

Recent studies demonstrated the use of environmental DNA (eDNA) from fishes to be appropriate as a non-invasive monitoring tool. Most of these studies ...

Continuous Instream Monitoring of Nutrients and Sediment in Agricultural Watersheds

Kontinuerlig Instream overvågning af næringsstoffer og Sediment i landbruget vandskel

Pollutant concentrations and loads in watersheds vary considerably with time and space. Accurate and timely information on the magnitude of pollutants in ...

Measuring and Mapping Patterns of Soil Erosion and Deposition Related to Soil Carbonate Concentrations Under Agricultural Management

Måling og kortlægning mønstre af jorderosion og Deposition relateret til jordbunden karbonat koncentrationer Under landbrugsdrift

Spatial patterns of soil erosion and deposition can be inferred from differences in ground elevation mapped at appropriate time increments. Such changes ...

Protocol for Acute and Chronic Ecotoxicity Testing of the Turquoise Killifish Nothobranchius furzeri

Protocol for Acute and Chronic Ecotoxicity Testing of the Turquoise Killifish Nothobranchius furzeri

Protokol for akut og kronisk Økotoksicitet afprøvning af turkis Killifish Nothobranchius furzeri

The killifish Nothobranchius furzeri is an emerging model organism in the field of ecotoxicology and its applicability in acute and chronic ecotoxicity ...

Construction of a Low-cost Mobile Incubator for Field and Laboratory Use

Konstruktion af en billig mobil inkubator for feltet og laboratoriebrug

Incubators are essential for a range of culture-based microbial methods, such as membrane filtration followed by cultivation for assessing drinking water ...